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一种人源化抗人Vδ1TCR单克隆抗体及其在活化扩增人Vδ1T细胞中的应用

一种人源化抗人v
δ
1tcr单克隆抗体及其在活化扩增人v
δ
1 t细胞中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域中的人源化单克隆抗体制备及体外细胞扩增的技术领域，具体涉及一种人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体及其制备方法和在高效活化扩增人vδ1 t细胞中的应用。

背景技术：

2.γδt细胞是一在进化上比b细胞和αβt细胞还要古老的淋巴细胞。虽然γδt细胞只占成人外周血cd3
+
t细胞的0.5％-10％，却兼有固有免疫和适应性免疫应答的双重特性，在机体抗感染、抗肿瘤和组织损伤修复等过程中发挥着重要的免疫作用。与αβt细胞相比，γδt细胞具有以下特点有利于发挥免疫作用：第一，在粘膜和皮下组织的大量分布以及tcrγδ的有限多样性，有利于γδt细胞在早期接触识别入侵的病原微生物，无需大量扩增即可发挥抗感染的作用；第二，γδt细胞识别抗原无mhc限制性，同时与tcrαβ相比，tcrγ和tcrδ的cdr3长度及结构更加类似于抗体的轻链和重链，因而tcrγδ可以像抗体一样无需抗原提呈分子辅助直接识别多种抗原分子；第三，γδt细胞表达nkg2d及ncr(nkp30、nkp44和nkp46)等nk细胞样受体，使其可以类似nk细胞在早期识别病原微生物及病原微生物引起的应激分子信号；第四，γδt细胞处于一种预活化状态，迅速发挥多种功能，包括分泌细胞因子，杀伤靶细胞等；第五，γδt细胞具有抗原提呈功能，启动后继的适应性免疫应答；第六，γδt细胞在维持上皮组织的完整及组织损伤修复方面具有重要作用。
3.γδt细胞根据tcr的γ和δ链的表达，主要分为3个亚，分别为vδ1 t细胞、vδ2 t细胞和vδ3 t细胞，其中vδ3 t细胞主要分布于肝和肠，vδ2 t细胞主要分布在外周血中，vδ1t细胞主要存在于粘膜和上皮组织中，尤其是胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道的黏膜下区域，外周血中也有极少量的vδ1 t细胞亚。γδt细胞不同亚可发挥自己独特的作用，近年来发现粘膜中的vδ1 t细胞能够有效渗入实体肿瘤中，识别肿瘤表面异常表达的mhc i类相关分子a和b(mica和micb)以及ul-16结合蛋白(ulbp)发挥抗肿瘤作用，然而目前vδ1t细胞过继免疫疗法面临的最大阻碍是其在外周血中的数量非常少，且难以进行高效体外扩增，从而限制了vδ1 t细胞在临床上的应用。

技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体，其重链可变区包含seq id no:1所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区包含seq id no:2所示的氨基酸序列或由其组成。
5.在一些实施方式中，所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体的重链恒定区包含seq id no:9所示的氨基酸序列或由其组成，轻链恒定区包含seq id no:10所示的氨基酸序列或由其组成。
6.在一些实施方式中，所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体的重链包含seq id no:11
所示的氨基酸序列或由其组成，轻链包含seq id no:12所示的氨基酸序列或由其组成。
7.本发明另一方面提供一种编码所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体的基因；优选地，其中编码所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体的重链的基因包含如seq id no:13所示的核苷酸序列或由其组成，编码所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体的轻链的基因包含如seq id no:14所示的核苷酸序列或由其组成。
8.本发明另一方面还提供一种含有编码所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体的基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
9.本发明再一方面提供一种制备所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：
10.1)将鼠源抗人vδ1tcr单克隆抗体的重轻链可变区的氨基酸序列分别与人源化抗体重轻链恒定区的氨基酸序列连接，分别得到人源化抗体的重链和轻链的氨基酸序列；其中所述鼠源抗人vδ1tcr单克隆抗体的重链可变区包含seq id no:1所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区包含seq id no:2所示的氨基酸序列或由其组成；
11.2)将步骤1)所得人源化抗体的重链和轻链的氨基酸序列进行逆翻译后，分别得到人源化抗体的重链和轻链的编码基因；和
12.3)对步骤2)所得人源化抗体的重链和轻链的编码基因进行真核表达，得到所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体。
13.在一些实施方式中，所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体在活化扩增vδ1 t细胞中的应用也属于本发明的内容。
14.在一些实施方式中，所述活化扩增vδ1 t细胞的方式包括固相化体外扩增。
15.在一些实施方式中，所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体还联合细胞因子对所述vδ1 t细胞进行活化扩增；可选地，所述细胞因子包括il-4、il-12、il-15、ifn-γ、il-21、或其组合。
16.在一些实施方式中，所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体或由所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体扩增获得的vδ1 t细胞在制备杀伤肿瘤细胞的药物中的应用也属于本发明的内容。
17.在一些实施方式中，所述肿瘤细胞包括但不限于daudi细胞、k562细胞、ovcar-8细胞、hepg2细胞和sw480细胞。
18.基于以上技术方案提供的人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体由鼠源单克隆抗体经重轻链可变区与人源化抗体重轻链恒定区连接获得，得到的人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体的重链可变区包含seq id no:1所示的氨基酸序列，轻链可变区包含seq id no:2所示的氨基酸序列。实施例结果表明，本发明提供的人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体能够在体外特异性活化人γδt细胞中的vδ1 t细胞亚增殖，尤其是当该人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体联合其他细胞因子(例如il-4、il-12、il-15、ifn-γ和il-21)时更能够有效活化增殖vδ1 t细胞，且增殖获得的vδ1 t细胞能有效杀伤肿瘤细胞，例如daudi细胞、k562细胞、ovcar-8细胞、hepg2细胞和sw480细胞，因此由本发明提供的人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体体外固相化刺激增殖获得的vδ1 t细胞对肿瘤细胞具有较好的细胞毒作用，可应用于临床上肿瘤的vδ1 t淋巴细胞的过继免疫。
附图说明
19.图1为12种候选人源化单克隆抗体分别体外活化扩增γδt细胞及vδ1 t亚的流式检测结果。
20.图2为人源化单克隆抗体hl001体外固相化活化扩增γδt细胞及vδ1 t亚的流式检测结果。
21.图3为不同剂量人源化单克隆抗体hl001体外活化扩增vδ1 t细胞的流式检测结果。
22.图4为人源化单克隆抗体hl001联合细胞因子il-4、ifn-γ和il-15体外活化扩增vδ1 t细胞的流式检测结果。
23.图5为人源化单克隆抗体hl001联合细胞因子活化扩增的vδ1 t细胞对肿瘤细胞sw480的细胞毒作用。
具体实施方式
24.针对现有技术中存在的难以高效体外扩增vδ1 t细胞的缺陷，本发明提供一种人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体，并基于该人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体提供一种体外高效活化扩增vδ1 t细胞的方法。本发明提供的人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体是基于鼠源抗人单克隆抗体经重、轻链可变区与人源化抗体重轻链恒定区连接、优化获得。
25.以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
26.在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
27.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《molecular cloning:a laboratory manual》sambrook，j.，russell，david w.，molecular cloning:a laboratory manual，3rd edition，2001，ny，cold spring harbor)。
28.实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
29.实施例中涉及的序列均可以通过现有技术合成。
30.实施例1：鼠源抗人vδ1tcr单克隆抗体的制备与纯化
31.该实施例按照本领域已知的常规方法(如参见以下文献中记载的方法制备：kohler and milrtein,nature 256:495-96,1975；harlow and lane，antibodies:a laboratory manual，cold spring harbor laboratory，1988)制备鼠源抗人vδ1tcr单克隆抗体。
32.在本实施例中，鼠源抗人vδ1tcr单克隆抗体的制备方法可包括以下步骤：
33.1)按文献(flanking v and j sequences of complementary determining region 3of t cell receptor(tcr)δ1(cdr3δ1)determine the structure and function of tcrγ4δ1)中的方法制备重组人tcrγ4/δ1-fc蛋白作为免疫原免疫balb/c小鼠，具体为
腹部皮下多点注射100μg/只/次，首次免疫时混合等体积弗氏完全佐剂，第2-4次加强免疫时混合等体积弗氏不完全佐剂。一周后小鼠尾静脉取血，采用elisa方法检测血清抗体滴度，选择滴度最高的小鼠，尾静脉注射再次注射100μg/只进行冲击免疫。
34.2)72h后取小鼠脾脏，分离脾细胞，采用聚乙二醇法将其与sp2-0骨髓瘤细胞融合。
35.3)融合细胞用hat选择性培养基(invitrogen公司)重悬，加入2％甲基纤维素半固体培养基加压筛选，挑取单个克隆细胞团，培养上清采用elisa法检测筛选阳性克隆并进行亚克隆。
36.4)将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞腹腔接种balb/c小鼠，定期抽取腹水，采用rproteina亲和层析纯化获得鼠源抗人vδ1tcr单克隆抗体。
37.实施例2：鼠源抗人vδ1tcr单克隆抗体的从头(de-novo)测序
38.本实施例对由实施例1获得的鼠源抗人vδ1tcr单克隆抗体进行从头测序，以解析抗体可变区氨基酸序列，具体包括以下操作。
39.将实施例1获得纯化的鼠源抗人vδ1tcr单克隆抗体样品经typsin，chymotrypsin，gluc，elastase和pepsin 5种酶进行多酶酶解后采集多肽质谱数据。具体如下：取2μg酶解后的多肽样品进样(高效液相谱仪)，90min谱梯度分离，orbitrap-lumos超高分辨率质谱仪进行数据采集检测。具体的仪器方法参数如下：
40.高效液相谱仪：(easy nlc 1200)；谱柱：c18，3μm，75μm x 15cm；上样量：10μl。流动相：a：0.1％formic acid in water；b：0.1％formic acid in 80％acetonitrile/h2o。谱梯度如下表1所示。
41.表1：谱梯度参数设置
[0042][0043]
质谱采集参数如下：质谱仪orbitrap-lumos，喷雾电压：2.1kv，毛细管温度：320℃，s-lens rf level：30，碰撞能量：30％nce，isolation window:2.5da。
[0044]
master scan分辨率设置：一级60,000@m/z 200，agc target 4e5，一级最大离子注入时间40ms，母离子扫描范围：m/z 350-1550；scan event 1activation type:hcd二级30,000@m/z200agc target 1e5，二级最大离子注入时间60ms；scan event 2activation type:etd二级30,000@m/z 200agc target 1e5，二级最大离子注入时间60ms。
[0045]
检测获得的质谱数据用peaks软件进行de-novo分析，获得酶切后的多肽序列，经与抗体数据库(例如imgt等)进行比较后拼接，人工校正序列，多轮检索修正后分别获得鼠源抗人vδ1tcr单克隆抗体的重链可变区(vh001)序列(seq id no：1所示)和轻链可变区(vl001)序列(seq id no：2所示)，将获得的鼠源抗人vδ1tcr单克隆抗体命名为mvδ1。
[0046]
实施例3：鼠源mvδ1单克隆抗体的人源化设计
[0047]
该实施例利用上述实施例2从头测序获得的抗体重链可变区序列为seq id no：1和抗体轻链可变区为seq id no：2的单克隆抗体mvδ1，通过重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3移植的方式设计人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体，具体包括以下操作。
[0048]
3.1)经鼠源抗体对抗原识别区的氨基酸序列的多样性分析确定mvδ1的vh001的cdr1、cdr2、cdr3分别为seq id no：1的第26-33、51-58、97-107位氨基酸，vl001的cdr1、cdr2、cdr3分别为seq id no：2的第27-36、54-56、93-101位氨基酸。氨基酸残基由kabat编号系统确定并注释。
[0049]
3.2)通过比对imgt人类抗体重轻链可变区种系基因数据库(https://www.imgt.org/)和moe软件，分别挑选与mvδ1抗体的重轻链可变区同源性高的重轻链可变区种系基因作为模板，其中挑选的mvδ1的人源化重链移植框架包括四种：ighv3-23d*01-ighv3-23*01、ighv3-30-5*02-ighv3-30*02、ighv3-48*02、ighv3-48*04-ighv3-48*01，以及mvδ1的人源化轻链移植框架包括两种：igkv3-11*01和igkv7-3*01，如下表2所示。将mvδ1的重轻链可变区的cdr分别移植到相应的人源模板中，形成次序为fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4的人源化抗体重轻链可变区序列，其中得到的人源化抗体的重链可变区分别命名为vh11、vh12、vh13和vh14，得到的人源化抗体的轻链可变区分别命名为vl11和vl12，其氨基酸序列信息如下表2所示。
[0050]
表2：挑选的与mvδ1的重轻链可变区同源性高的重轻链可变区种系基因模板
[0051]
匹配的人源抗体重轻链模板人源化抗体重轻链氨基酸序列ighv3-23d*01-ighv3-23*01vh11seq id no:3ighv3-30-5*02-ighv3-30*02vh12seq id no:4ighv3-48*02vh13seq id no:5ighv3-48*04-ighv3-48*01vh14seq id no:6igkv3-11*01vl11seq id no:7i igkv7-3*01vl12seq id no:8
[0052]
3.3)将上述步骤3.2)得到的4条人源化抗体重链可变区vh11、vh12、vh13和vh14分别与人源抗体重链铰链区和恒定区(seq id no:9)连接得到4条人源化抗体重链，并将上述步骤3.2)得到的2条人源化抗体轻链可变区vl11和vl12分别与人源抗体轻链恒定区(seq id no:10)连接得到2条人源化抗体轻链，由这些人源化抗体重链和人源化抗体轻链随机组合，可得到8种候选人源化单克隆抗体，命名为huvδ1，将这8种人源化抗体分别命名为huvδ1(h11l11)、huvδ1(h12l11)、huvδ1(h13l11)、huvδ1(h14l11)、huvδ1(h11l12)、huvδ1(h12l12)、huvδ1(h13l12)、huvδ1(h14l12)。此外，由于mvδ1的轻链可变区vl001和人源化移植框架高度同源，因此该步骤中，将该轻链可变区vl001与人源化抗体轻链恒定区(seq id no:10)连接获得的完全轻链与上述移植后获得的4条人源化重链进行组合，得到4种人源化抗体，分别命名为huvδ1(h11vl001)、huvδ1(h12vl001)、huvδ1(h13vl001)和huvδ1(h14vl001)。另外，在该步骤中，还直接将上述步骤3.1)得到的mvδ1的vh001和vl001分别与人源化抗体重链和轻链恒定区序列连接，得到人源化抗体的重链和轻链，分别命名为huvδ1(h001)(其氨基酸序列如seq id no:11所示)和huvδ1(l001)(其氨基酸序列如seq id no:12所示)，得到的人源化抗vδ1单克隆抗体命名为hl001，因此共得到13种候选的人源化抗体
huvδ1。
[0053]
3.4)根据真核表达系统对上述13种人源化抗体huvδ1的氨基酸序列进行逆翻译、密码子优化，分别获得完整的重链和轻链的dna编码序列，通过化学合成dna编码序列，并将合成的dna编码序列分别插入到真核表达载体构建重组质粒。表达重链的质粒与表达轻链的质粒按照质量比为1:1共转染hek-293t细胞，在无血清培养基中37℃、5％co2条件下培养和表达，72h后收集细胞上清液，采用重组蛋白a亲和层析介质纯化抗体，分别得到上述13种人源化单克隆抗体。
[0054]
实施例4：人源化抗体体外活化扩增vδ1 t细胞的功能学试验
[0055]
该实施例利用上述实施例3获得的13种人源化抗体分别进行固相包被体外活化扩增人外周血中分离单个核细胞(pbmc)中的γδt细胞(具体为γδt细胞中的vδ1 t细胞亚)的功能学试验，固相包被抗体法体外扩增γδt细胞的流程如下：
[0056]
1)将实施例3重组表达纯化的13种人源化抗体作为包被液分别固相包被培养板，于37℃孵育2h；
[0057]
2)弃包被液，用无菌的pbs洗涤2遍；
[0058]
3)利用人淋巴细胞分离液密度梯度离心法，从正常人外周全血中分离pbmc，铺孔密度为2
×
106/孔，以含3％sr和200u/ml il-2的kbm581培养基进行悬浮培养；
[0059]
4)5天后，将细胞移出抗体包被孔；每2天换液、传孔；
[0060]
5)培养第10天，采用流式细胞仪检测扩增γδt细胞表面生物标记物，其中，fitc标记的anti-γδt ab(11-9959-42)检测总γδt细胞；apc标记的anti-vδ1ab(tcr2730)检测vδ1细胞亚。
[0061]
流式细胞术检测的具体操作如下：取1
×
106细胞数量的样本于400-600
×
g、离心5分钟，弃掉上清。用1ml 1％bsa/pbs清洗1次，弃掉上清。按照1个待检样本每种抗体2μl的量加入40μl 1％bsa/pbs混匀成抗体稀释液，用于重悬细胞。4℃避光反应30分钟。每管加入1ml pbs洗涤，400-600
×
g离心5分钟。弃掉上清，每管加入200μl pbs重悬，上机检测。选择点击密度图图标作图，纵坐标选择“ssc-h/a”，横坐标选择“time”，圈出液流稳定区域。选择点击密度图图标作图，在已圈出的门中分析，纵坐标选择“ssc-h/a”，横坐标选择“fsc-h/a”，圈出目标淋巴细胞。选择点击密度图图标作图，纵坐标选择“fsc-a”，横坐标选择“fsc-h”，在淋巴细胞中，圈出集中在图形对角线位置的细胞，排除黏连体细胞。选择点击密度图图标作图，纵坐标选择“ssc-a”，横坐标选择“ssc-h”，在淋巴细胞中，圈出集中在图形对角线位置的细胞，进一步排除黏连体细胞。
[0062]
总γδt细胞百分比：选择点击散点图图标作图，纵坐标选择“vδ1-apc”，横坐标选择“γδtcr-fitc”，画出γδt细胞阳性(tcrγδ
+
)，vδ1 t细胞亚为apc和fitc双阳性细胞的结果。
[0063]
结果如图1和图2所示，其中图1示出的是12种候选人源化单克隆抗体(huvδ1(h11l11)、huvδ1(h11l12)、huvδ1(h12l11)、huvδ1(h12l12)、huvδ1(h13l11)、huvδ1(h13l12)、huvδ1(h14l11)、huvδ1(h14l12)、huvδ1(h11vl001)、huvδ1(h12vl001)、huvδ1(h13vl001)和huvδ1(h14vl001))分别体外活化扩增pbmc中的γδt细胞的结果，图2示出的是候选人源化单克隆抗体hl001体外活化扩增pbmc中的γδt细胞的结果。由图1和图2所示的结果可知，与没有固相包被单克隆抗体的对照(il2对照)相比，只有hl001人源化单克隆
抗体可有效扩增总γδt细胞，主要以vδ1 t细胞亚为主，vδ1 t细胞比例可达到33％，而另外12种候选人源化单克隆抗体(均为经cdr移植获得)均不能有效扩增总γδt细胞及vδ1 t细胞亚。由此，本发明确定一种可在体外有效扩增γδt细胞中的vδ1 t细胞亚的人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体hl001，其重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示；该人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体hl001的完全重链的氨基酸序列如seq id no:11所示(对应的核苷酸编码序列如seq id no:13所示)，完全轻链的氨基酸序列如seq id no:12所示(对应的核苷酸编码序列如seq id no:14所示)。
[0064]
实施例5：不同剂量人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体或进一步联合细胞因子体外活化扩增vδ1 t细胞的功能学试验
[0065]
该实施例按照实施例4的操作进行，以检测不同剂量hl001人源化单克隆抗体或进一步联合细胞因子(例如il-4、il-12、il-15、ifn-γ和il-21)体外活化扩增vδ1 t细胞的效果，具体操作为：
[0066]
5.1、不同剂量hl001人源化单克隆抗体体外活化扩增vδ1 t细胞的功能学试验
[0067]
1)分别用1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml浓度的hl001作为包被液包被培养板，于37℃孵育2h；
[0068]
2)弃包被液，用无菌的pbs洗涤2遍；
[0069]
3)利用人淋巴细胞分离液密度梯度离心法，从正常人外周血中分离pbmc，铺孔密度为2
×
106/孔，以含3％sr和200u/ml il-2的kbm581培养基进行悬浮培养；
[0070]
4)5天后，将细胞移出抗体包被孔；每2天换液、传孔；
[0071]
5)培养第10天，采用流式细胞仪检测扩增γδt细胞表面生物标记物，使用fitc标记的anti-vδ1ab检测vδ1 t细胞亚。
[0072]
结果如图3所示，可见在使用的hl001人源化单克隆抗体的三种剂量中，4μg/ml的剂量体外活化扩增vδ1 t细胞的纯度相对更高，第10天检测的纯度达到40％以上，活化扩增vδ1t细胞的纯度与固化抗体的浓度具有剂量依赖性。
[0073]
5.2、hl001人源化单克隆抗体进一步联合细胞因子体外活化扩增vδ1 t细胞的功能学试验
[0074]
1)用4μg/ml的hl001作为包被液包被培养板，于37℃孵育2h；
[0075]
2)弃包被液，用无菌的pbs洗涤2遍；
[0076]
3)利用人淋巴细胞分离液密度梯度离心法，从正常人外周血中分离pbmc，铺孔密度为2
×
106/孔，以3％sr和200u/ml il-2联合不同细胞因子il-4(100ng/ml)、il-12(50ng/ml)、il-15(50ng/ml)、il-21(10ng/ml)、ifn-γ(100ng/ml)、或其组合的kbm581培养基进行悬浮培养；
[0077]
4)5天后，将细胞移出抗体包被孔；移孔后更换培养基为含3％sr和不同细胞因子il-4(100ng/ml)、il-12(50ng/ml)、il-15(50ng/ml)、il-21(10ng/ml)、ifn-γ(100ng/ml)、或其组合的kbm581培养基，每2天换液、传孔；
[0078]
5)培养第10天，采用流式细胞仪检测扩增γδt细胞表面生物标记物，pb标记的anti-vδ2ab检测vδ2细胞亚；fitc标记的anti-vδ1ab检测vδ1细胞亚。
[0079]
结果如图4所示，其示例性示出了固化包被hl001人源化单克隆抗体联合添加il-4、ifn-γ和il-15体外活化扩增vδ1 t细胞的效果，其在第10天检测的vδ1 t细胞纯度可达
72％。当hl001人源化单克隆抗体联合其他细胞因子或细胞因子的组合时也可以获得与图4类似的效果，在此不再赘述。
[0080]
实施例6：hl001人源化抗体体外扩增的vδ1 t细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用
[0081]
该实施例利用上述实施例5使用hl001人源化抗体联合添加细胞因子il-4、ifn-γ和il-15进行体外活化扩增pbmc获得的vδ1 t细胞，使用rtca方法检测其对肿瘤细胞sw480的细胞毒作用，具体包括以下操作：
[0082]
将e-plate 16放到rtca s16 station上，系统会自动进行扫描(“scan plate”)，检查是否接触良好。点击主页上“new experiment”，进入“protocol”页面，选择需要进行的实验类型“proliferation/cytocoxicty”，选择“standard protocol”，确定实验流程。点击“layout”页面，设置实验孔的细胞名称、数目。点击左下角开始的标志，开始检测基线。取出e-plate 16检测板，在“靶细胞孔、效靶比实验孔”中加入50μl混合均匀的靶细胞悬液，使每孔中细胞数目为1.5
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104/孔/50μl(3
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105/ml)；“效应细胞孔”中补50μl靶细胞培养基。将e-plate 16板置于生物安全柜中室温放置30分钟后移至培养箱中的rtca s16 station上，确保绿指示灯亮起，细胞孵育16-20小时。在系统自动扫描“scan plate”后，点击开始step2，进行细胞增殖的实时动态检测。收集效应细胞浓度调整为1.5
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106/ml。取出e-plate16置于超净台中。将效应细胞混匀液50μl/孔加入到“效靶比实验孔、效应细胞孔”中。将e-plate16检测板置于rtca s16检测台上实时监测，确定绿指示灯亮起为仪器正常运行。
[0083]
用下列公式计算vδ1 t细胞对靶细胞的杀伤效率：
[0084][0085]
结果如图5所示，其中“靶细胞孔”的结果如曲线sw480所示，“效靶比实验孔”的结果如sw480+vδ1 t所示，“效应细胞孔”的结果如vδ1 t-对照所示，可见相对于“靶细胞孔”的结果，向“效靶比实验孔”中加入vδ1 t细胞后可明显降低细胞指数，尤其是加入vδ1 t细胞后36h后，更显著降低细胞指数，表明利用hl001人源化抗体联合添加细胞因子刺激增殖的vδ1t细胞能够有效杀伤sw480肿瘤细胞。
[0086]
按照以上操作，还测试了上述实施例5使用hl001人源化抗体联合添加细胞因子il-4、ifn-γ和il-15进行体外活化扩增pbmc获得的vδ1 t细胞对淋巴瘤细胞系daudi细胞、k562细胞、ovcar-8细胞和hepg2细胞的细胞毒作用，也具有如图5所示的类似的细胞毒作用，在此不再赘述。
[0087]
综上实施例4-6的结果可知，由本发明提供的人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体能够体外高效刺激扩增vδ1 t细胞，并且经体外刺激扩增获得的vδ1 t细胞对多种肿瘤细胞(包括daudi细胞、k562细胞、ovcar-8细胞、hepg2细胞和sw480细胞等)具有较好的细胞毒作用，因此获得的vδ1 t细胞能通过过继回输的方式用于临床上肿瘤的过继免疫。
[0088]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护
范围之内。

技术特征：

1.一种人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体，其重链可变区包含seq id no:1所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区包含seq id no:2所示的氨基酸序列或由其组成。2.根据权利要求1所述的人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体，其重链恒定区包含seq id no:9所示的氨基酸序列或由其组成，轻链恒定区包含seq id no:10所示的氨基酸序列或由其组成。3.根据权利要求1或2所述的人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体，其重链包含seq id no:11所示的氨基酸序列或由其组成，轻链包含seq id no:12所示的氨基酸序列或由其组成。4.一种编码权利要求1-3中任一项所述的人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体的基因；优选地，其中编码所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体的重链的基因包含如seq id no:13所示的核苷酸序列或由其组成，编码所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体的轻链的基因包含如seq id no:14所示的核苷酸序列或由其组成。5.含有权利要求4所述的基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。6.一种制备权利要求1-3中任一项所述的人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：1)将鼠源抗人vδ1tcr单克隆抗体的重轻链可变区的氨基酸序列分别与人源化抗体重轻链恒定区的氨基酸序列连接，分别得到人源化抗体的重链和轻链的氨基酸序列；其中所述鼠源抗人vδ1tcr单克隆抗体的重链可变区包含seq id no:1所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区包含seq id no:2所示的氨基酸序列或由其组成；2)将步骤1)所得人源化抗体的重链和轻链的氨基酸序列进行逆翻译后，分别得到人源化抗体的重链和轻链的编码基因；和3)对步骤2)所得人源化抗体的重链和轻链的编码基因进行真核表达，得到所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体。7.权利要求1-3中任一项所述的人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体在活化扩增vδ1t细胞中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其中所述扩增的方式包括固相化体外扩增；和/或所述人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体还联合细胞因子对所述vδ1t细胞进行活化扩增；可选地，所述细胞因子包括il-4、il-12、il-15、ifn-γ、il-21、或其组合。9.权利要求1-3中任一项所述的人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体或由权利要求1-3中任一项所述的人源化抗人vδ1tcr单克隆抗体扩增获得的vδ1t细胞在制备杀伤肿瘤细胞的药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其中所述肿瘤细胞包括但不限于daudi细胞、k562细胞、ovcar-8细胞、hepg2细胞和sw480细胞。

技术总结

本发明公开了一种人源化抗人Vδ1TCR单克隆抗体及其在活化扩增人Vδ1T细胞中的应用，属于生物技术领域中的人源化单克隆抗体制备及细胞扩增的技术领域。本发明提供的人源化抗人Vδ1TCR单克隆抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，该人源化抗人Vδ1TCR单克隆抗体能够在体外高效活化扩增Vδ1T细胞，且获得的Vδ1T细胞能够有效杀伤肿瘤细胞。且获得的Vδ1T细胞能够有效杀伤肿瘤细胞。且获得的Vδ1T细胞能够有效杀伤肿瘤细胞。