一种乌鳢性别特异分子标记、基于该分子标记的遗传性别鉴定方法和应用

1.本发明涉及鱼类分子育种领域，具体涉及一种乌鳢性别特异分子标记、基于该分子标记的遗传性别鉴定方法和应用。

背景技术：

2.性别决定是决定生物体向雌性还是雄性发育的生物学事件。性别控制在水产生物遗传育种和应用、以及提高产量、避免过度繁殖等方面意义重大。这是因为许多鱼类具有性别二态性，半滑舌鳎(cynoglossus semilaevis)、虹鳟(oncorhynchus mykiss)鲤鱼(cyprinus carpio)、和比目鱼(hippoglossus hippoglossus l.)等鱼类雌性生长速度显著高于雄性。相反，黄颡鱼(pelteobagrus fulvidraco)、尼罗罗非鱼(oreochromis niloticus)和斑点叉尾鮰(ictalurus punctatus)等鱼类雄性在生长上显著高于雌性。通过性别控制技术实现全雌或全雄化个体养殖是水产中提高养殖产量的关键技术之一(陈松林等,2013；bye and lincoln,1986；shao et al.,2014)。
3.乌鳢(channa argus)隶属于鳢科、鳢属鱼类，是我国特有的重要经济鱼类，乌鳢在中国分布十分普遍，除了西部高原地区之外，从南到北均有分布。其主要分布在长江流域的河川、湖泊和池塘中。乌鳢生长快、抗病力强、身体呈棒形、少刺，肉质细嫩、味道鲜美，具有营养保健、滋补调养等功用，具有较高的营养价值和经济价值。乌鳢身体前部呈圆筒形，后部侧扁。体呈灰黑，体背和头顶较暗黑，腹部淡白，体侧各有不规则黑斑块，头侧有黑斑纹；奇鳍有黑白相间的斑点，偶鳍为灰黄，间有不规则斑点。头长，吻短圆钝，口大，牙细小。乌鳢雄鱼比雌鱼生长快，全雄鱼养殖具有更好的经济效益。因此，开展乌鳢遗传性别鉴定和性别控制技术研究既有重要的科学意义，又有广阔的应用前景。
4.乌鳢染体数为2n＝48，已有研究表明其为xy型性染体。白乌鳢为乌鳢的一种体突变体。白乌鳢是最近发展起来的一个新品种，因为自然资源比较少，相当珍贵。白乌鳢只有在四川省才有，但是受制于鱼塘、饲料、水源等硬件条件不足，发展规模有限，面对市场供不应求。
5.众多研究表明由于鱼类性别具有高度的可塑性，一方面可以通过雄性类固醇激素、抗雌药物和芳香化酶(雌激素合成关键酶)抑制剂等处理，诱导遗传性别为xx的个体发育为伪雄鱼(遗传上仍为xx)，将xx伪雄鱼与正常xx雌鱼交配繁殖，最终获得全雌后代，实现全雌单性苗种培育。另一方面，通过雌激素处理诱导遗传性别为xy的乌鳢个体发育为伪雌鱼(遗传上仍为xy)，将xy伪雌鱼与正常xy雄鱼交配繁殖，可获得yy超雄鱼，将yy超雄鱼雌性化处理，获得的yy伪雌鱼与正常xy雄鱼交配繁殖，可获得全雄鱼。传统的鱼类性别控制育种需要通过测交，来判断亲本的基因型，耗时耗力，而基于性别连锁的分子标记，可以简单快速地实现遗传性别的鉴定，大大节省人力物力，尽管乌鳢有snp标记的报道，但是在乌鳢(白乌鳢)中尚未发现基于pcr的遗传性别鉴定方法。

技术实现要素：

6.有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于到一种乌鳢(白乌鳢)性染体特异分子标记，可以适用于内江白乌鳢，以及养殖场、嘉陵江流域的野生乌鳢；目的之二在于提供一种基于上述分子标记进行乌鳢(白乌鳢)遗传性别鉴定的方法，可以经济、快速、准确地区分正常雌鱼xx
♀
、正常雄鱼xy
♂
、转化雌鱼xy
♀
或超雄鱼yy
♂
。
7.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.本发明提供一种乌鳢性染体特异分子标记，所述性染体特异分子标记为x和y染体部分同源的dna片段，包括x染体特异的dna片段，其核苷酸序列为seq id no.1，长262bp，y染体特异的dna片段，其核苷酸序列为seq id no.2，长460bp。
9.进一步，所述乌鳢包括实验室、养殖场、嘉陵江流域的野生乌鳢，以及乌鳢的体突变体。
10.进一步，所述乌鳢的体突变体为白乌鳢。
11.本发明还提供基于上述分子标记的乌鳢遗传性别鉴定方法，所述方法包括步骤：
12.a.pcr扩增：提取待测乌鳢基因组dna作为模板，采用seq id no.1和seq id no.2共有序列设计的上游引物f和下游引物r进行pcr扩增，并将所得pcr扩增产物进行电泳、溴化乙锭eb显后与所述的乌鳢性染体特异分子标记进行对比；
13.b.结果判断：从待测乌鳢的基因组dna中仅扩增出x染体特异dna片段，大小为262bp，判断该待测乌鳢在遗传上为性染体基因型为xx的雌鱼；从待测乌鳢的基因组dna中仅扩增出y染体特异dna片段，大小为460bp，判断该待测鱼在遗传上为性染体基因型为yy的超雄鱼；从待测乌鳢的基因组dna中同时扩增出所述x染体特异dna片段，和所述y染体特异dna片段，判断该待测鱼在遗传上为性染体基因型为xy的雄鱼。
14.进一步，所述乌鳢基因组dna是取待测乌鳢的尾鳍，通过常规酚氯仿法提取获得。
15.进一步，所述上游引物f为seq id no.3所示序列。
16.进一步，所述下游引物r为seq id no.4所示序列。
17.本发明还提供应用上述乌鳢遗传性别鉴定的分子标记方法生产超雄乌鳢的方法，所述方法包括：
18.a.将乌鳢xx雌鱼与xy雄鱼的交配后代进行雌性化处理，处理方法为采用200μg/g雌二醇投喂处理60天，200μg/g的浓度混于饲料中；雌二醇溶于95％乙醇后喷洒于饲料上，烘干后投喂；采用所述性别特异的分子标记筛选出性染体基因型为xy的转化雌鱼；判断方法为，野生型xy鱼性腺发育为精巢，而雌二醇处理的xy鱼性腺发育为卵巢，通过性腺组织学检测判断xy鱼的性腺发育特征，筛选出基因型为xy而性腺为卵巢的个体；
19.b.将乌鳢xy转化雌鱼与xy雄鱼交配，采用所述分子标记方法，从其后代中筛选出性染体基因型为yy的超雄鱼。
20.本发明还提供应用上述的乌鳢遗传性别鉴定的分子标记方法生产全雄乌鳢的方法，所述方法包括：
21.a.将乌鳢雌鱼xx与雄鱼xy的交配后代进行雌性化处理，采用所述分子标记方法，筛选出性染体基因型为xy的转化雌鱼，其性腺发育为卵巢，能正常产卵；
22.b.将乌鳢xy转化雌鱼与xy雄鱼交配，采用所述分子标记方法，从其后代中筛选出性染体基因型为yy的超雄鱼；
23.c.将yy超雄鱼与xx正常雌鱼交配，获得xy全雄鱼。
24.本发明的有益效果在于：
25.1.本发明首次筛选到乌鳢(白乌鳢)性染体特异分子标记，建立了乌鳢(白乌鳢)遗传性别pcr鉴定方法。本方法可适用于实验室、养殖场、嘉陵江流域的野生乌鳢、以及白乌鳢的遗传性别鉴定。
26.2.基于该分子标记构建的乌鳢(白乌鳢)遗传性别鉴定方法，可以经济、快速地区分正常雌鱼xx
♀
、正常雄鱼xy
♂
、转化雌鱼xy
♀
、超雄鱼yy
♂
。具有高效，准确和稳定的特点，在乌鳢(白乌鳢)性别控制和全雄乌鳢苗种的持续规模化生产中具有重要的应用价值。
27.3.基于上述遗传性别鉴定方法可以通过xx转化雄鱼
♂
与正常雌鱼xx
♀
交配实现全雌鱼苗的规模化生产。
28.4.通过正常雌鱼xx
♀
与超雄鱼yy
♂
交配产生xy全雄鱼，转化雌鱼yy
♀
和超雄鱼yy
♂
交配产生yy超雄鱼，可获得大量单性鱼苗，从而应用于基础研究。该分子标记的开发有助于显著提高养殖产量，降低养殖成本，提高经济效益。
附图说明
29.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
30.图1为本发明x染体特异dna序列和y染体特异dna序列比对图，引物位置用粗黑下划线标出，黑背景为x染体和y染体dna片段的一致序列，
“‑”
表示缺失序列；
31.图2为应用本发明所述x和y染体特异分子标记对8尾白乌鳢xx雌鱼、8尾白乌鳢xy雄鱼进行遗传性别鉴定的结果，m表示dna分子量标准dl2000；
32.图3为应用本发明所述x和y染体特异分子标记对5尾白乌鳢xx雌鱼、5尾白乌鳢xy雄鱼、5尾白乌鳢yy超雄鱼，进行遗传性别鉴定的结果，m表示dna分子量标准dl2000；
33.图4为应用本发明所述x和y染体特异分子标记对来自嘉陵江的野生乌鳢(wild xx和xy)和广东佛山梁氏种业的养殖乌鳢(farmed xx和xy)进行遗传性别鉴定的结果，m表示dna分子量标准dl2000；
34.图5为应用本发明所述x和y染体特异分子标记辅助选育生产遗传全雄鱼的技术路线。
具体实施方式
35.下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
36.本发明未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
37.实施例一、乌鳢(白乌鳢)性别特异分子标记的获得
38.1、基因组dna的提取
39.剪取白乌鳢(乌鳢)尾鳍大约10mg，置裂解液[10mm tris-hcl(ph8.0)+100mm edta(ph8.0)+100mm nacl+5mg/ml sds]800μl中用剪刀剪碎，加入终浓度为100μg/ml的核糖核酸酶a(rnasea)和终浓度为20mg/ml的蛋白酶k，在55℃水浴中消化至无明显鳍条组织，然后
再加入体积比为25:24:1de苯酚/氯仿/异戊醇混合液800μl，充分混匀后于12000rpm离心10分钟，吸取分层的上清液，避免吸入分层下面的液体，再次加入体积比为25:24:1为苯酚/氯仿/异戊醇混合液抽提dna，离心，同样吸取分层的上清液，加入提前冷冻的冰乙醇1000μl沉淀dna，12000rpm离心10分钟，丢弃上清液，dna沉淀经70％的乙醇洗涤、自然干燥后，用te缓冲液溶解制成浓度为20ng/μl的溶液(od
260
/od
280
＝1.76～1.80)，-20℃保存备用。
[0040]
2、性别特异分子标记的筛选
[0041]
采用三代测序技术对白乌鳢进行了xx、xy全基因组测序和雌雄混合池的重测序，发明人将测序获得的xy雄鱼380,108,762条clean reads通过bowtie2比对到xx雌鱼参考基因组上，用samtools软件将没有比对到参考基因组的reads提取出来，并通过de novo组装软件iterative de bruijn graph assembler(idba)对提取结果进行从头组装，然后将雌鱼混合池的214,784,264条clean reads比对到这些contig上，从比对结果中过滤掉被雌鱼混合池中的reads比对上的contig，最终得到y染体特异的片段，将这些片段比回到雄鱼基因组上，确定出它们的位置，然后用雌鱼的reads进行比对，结果文件用可视化软件integrative genomics viewer(igv)打开进行查看，在差异之处的左右两侧的一致序列(consensus sequences)处设计引物，分别对xx，xy和yy白乌鳢和xx、xy乌鳢基因组进行pcr扩增，筛选性别特异分子标记。结果发现，其中1对引物(上游引物f序列(5
’‑
gcactataagtttcatttggatttgg-3)如seq id no.3所示，下游引物r序列(5
’‑
gtttatcaagtacacttacagtag-3’)如seq id no.4所示)具有明显的性别特异性，能在xx和xy个体中扩增出一条长262bp的x染体特异条带，同时在xy和yy个体中扩增出一条长460bp的y染体特异条带。
[0042]
3、性别特异分子标记的克隆与序列分析
[0043]
分别取含有上述x染体特异dna条带、y染体特异dna条带的琼脂糖凝胶，普通dna胶回收试剂盒回收目的片段，将其克隆入pmd-19t载体，再转化大肠杆菌感受态细胞，用蓝白斑筛选法筛选阳性克隆，挑取白斑单菌落，用pcr法鉴定阳性克隆，再进行测序。
[0044]
对测序获得的x染体特异dna片段(序列如seq id no.1所示，命名为cax)和y染体特异dna片段(序列如seq id no.2所示，命名为cay)进行序列比对分析。结果如图1所示，x和y染体特异分子标记的序列差异：与x染体dna序列相比，y染体dna序列多了198bp序列(图1)。
[0045]
实施例二：白乌鳢(乌鳢)遗传性别鉴定的分子标记方法
[0046]
白乌鳢(乌鳢)遗传性别鉴定的分子标记方法，包括以下步骤：
[0047]
a.pcr扩增：剪取待测白乌鳢(乌鳢)的鳍条，常规酚氯仿法提取基因组dna；以所得基因组dna为模板，采用上游引物f和下游引物r进行pcr扩增；pcr反应体系：2
×
pcr taq mix buffer 10μl，10μmol/l上下游引物各0.4μl，模板dna 0.8μl(100ng dna)，ddho 8.4μl，总体积20μl，混匀后离心。pcr扩增参数为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸40秒，共38个循环，最后72℃延伸10分钟；所得pcr产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳；
[0048]
b.结果判断：当从待测白乌鳢(乌鳢)的基因组dna中仅扩增出长260bp的x染体特异条带(即本发明所述x染体特异分子标记cax)，则判断该待测白乌鳢(乌鳢)为遗传上的雌鱼，性染体基因型为xx；当从待测白乌鳢(乌鳢)的基因组dna中仅扩增出长262bp的y
染体特异条带(即本发明所述y染体特异分子标记cay)，则判断该待测白乌鳢(乌鳢)为遗传上的超雄鱼，性染体基因型为yy；当从待测白乌鳢(乌鳢)的基因组dna中同时扩增出长262bp的x染体特异条带和长460bp的y染体特异条带，则判断该待测乌鳢为遗传上的雄鱼，性染体基因型为xy(图2)。
[0049]
应用上述方法对5尾白乌鳢雌鱼xx、5尾白乌鳢雄鱼xy和5尾白乌鳢超雄鱼yy进行遗传性别鉴定，结果见图3，在所有xx个体中都仅扩增出了长262bp的x染体特异条带，在所有yy个体中都仅扩增出了长460bp的y染体特异条带，而在xy个体中同时扩增出了长262bp的x染体特异条带和长460bp的y染体特异条带，与理论结果一致。
[0050]
实施例三：基于性别特异分子标记对嘉陵江流域的野生乌鳢和广东梁氏种业养殖乌鳢进行遗传性别鉴定
[0051]
应用上述方法对来自嘉陵江流域的野生乌鳢和广东梁氏种业养殖乌鳢(48尾表型雄鱼和48尾表型雌鱼)进行遗传性别鉴定，结果见图4，在所有待测雌性乌鳢个体中都仅扩增出了长262bp的x染体特异条带，而在所有待测雄性乌鳢个体中都同时扩增出了长262bp的x染体特异条带和长460bp的y染体特异条带，说明这96尾待测乌鳢表型与基因型完全吻合(表1)。由上述结果可知，本实验开发的性别特异分子标记适用于嘉陵江流域的野生乌鳢和广东梁氏种业养殖乌鳢，具有普适性。
[0052]
表1 3个不同体的乌鳢的遗传性别鉴定结果
[0053][0054]
实施例四：基于性别特异分子标记生产全雄白乌鳢的方法
[0055]
基于本发明的性别特异分子标记cax/cay进行白乌鳢遗传性别鉴定，生产全雄白乌鳢的方法包括以下步骤(图5)：
[0056]
a.将白乌鳢雌鱼xx与雄鱼xy的交配后代进行雌性化处理，采用上述分子标记方法，筛选出性染体基因型为xy的转化雌鱼；将白乌鳢雌鱼xx与雄鱼xy交配后代于孵化后5天进行雌二醇(e2，200μg/g)浸浴，采用本发明所述白乌鳢遗传性别鉴定的分子标记方法，筛选出性染体基因型为xx的转化雄鱼；
[0057]
b.将xy转化雌鱼与乌鳢鲇xy雄鱼交配，采用上述分子标记方法，从后代中筛选出性染体基因型为yy的超雄鱼；
[0058]
c.将yy超雄鱼与xx正常雌鱼交配，可获得xy全雄鱼。
[0059]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

技术特征：

1.一种乌鳢性染体特异分子标记，其特征在于，所述性染体特异分子标记为x和y染体部分同源的dna片段，包括x染体特异的dna片段，其核苷酸序列为seq id no.1，长262bp，y染体特异的dna片段，其核苷酸序列为seq id no.2，长460bp。2.根据权利要求1所述的乌鳢性染体特异分子标记，其特征在于，所述乌鳢包括实验室、养殖场、嘉陵江流域的野生乌鳢，以及乌鳢的体突变体。3.根据权利要求2所述的乌鳢性染体特异分子标记，其特征在于，所述乌鳢的体突变体为白乌鳢。4.基于权利要求1所述分子标记的乌鳢遗传性别鉴定方法，其特征在于，所述方法包括步骤：a.pcr扩增：提取待测乌鳢基因组dna作为模板，采用seq id no.1和seq id no.2共有序列设计的上游引物f和下游引物r进行pcr扩增，并将所得pcr扩增产物进行电泳、溴化乙锭eb显后与所述的乌鳢性染体特异分子标记进行对比；b.结果判断：从待测乌鳢的基因组dna中仅扩增出x染体特异dna片段，大小为262bp，判断该待测乌鳢在遗传上为性染体基因型为xx的雌鱼；从待测乌鳢的基因组dna中仅扩增出y染体特异dna片段，大小为460bp，判断该待测鱼在遗传上为性染体基因型为yy的超雄鱼；从待测乌鳢的基因组dna中同时扩增出所述x染体特异dna片段，和所述y染体特异dna片段，判断该待测鱼在遗传上为性染体基因型为xy的雄鱼。5.根据权利要求4所述的乌鳢遗传性别鉴定的分子标记方法，其特征在于，所述乌鳢基因组dna是取待测乌鳢的尾鳍，通过常规酚氯仿法提取获得。6.根据权利要求4所述的乌鳢遗传性别鉴定的分子标记方法，其特征在于，所述上游引物f为seq id no.3所示序列。7.根据权利要求4所述的乌鳢遗传性别鉴定的分子标记方法，其特征在于，所述下游引物r为seq id no.4所示序列。8.应用权利要求4所述的乌鳢遗传性别鉴定的分子标记方法生产超雄乌鳢的方法，其特征在于，所述方法包括：a.将乌鳢xx雌鱼与xy雄鱼的交配后代进行雌性化处理，处理方法为采用200μg/g雌二醇投喂处理60天，200μg/g的浓度混于饲料中；雌二醇溶于95％乙醇后喷洒于饲料上，烘干后投喂；采用所述性别特异的分子标记筛选出性染体基因型为xy的转化雌鱼；判断方法为，野生型xy鱼性腺发育为精巢，而雌二醇处理的xy鱼性腺发育为卵巢，通过性腺组织学检测判断xy鱼的性腺发育特征，筛选出基因型为xy而性腺为卵巢的个体；b.将乌鳢xy转化雌鱼与xy雄鱼交配，采用所述分子标记方法，从其后代中筛选出性染体基因型为yy的超雄鱼。9.应用权利要求4所述的乌鳢遗传性别鉴定的分子标记方法生产全雄乌鳢的方法，其特征在于，所述方法包括：a.将乌鳢雌鱼xx与雄鱼xy的交配后代进行雌性化处理，采用所述分子标记方法，筛选出性染体基因型为xy的转化雌鱼，其性腺发育为卵巢，能正常产卵；b.将乌鳢xy转化雌鱼与xy雄鱼交配，采用所述分子标记方法，从其后代中筛选出性染体基因型为yy的超雄鱼；c.将yy超雄鱼与xx正常雌鱼交配，获得xy全雄鱼。

技术总结

本发明涉及乌鳢性别特异分子标记、基于该分子标记的遗传性别鉴定方法和应用。本发明首次筛选得到的乌鳢性染体特异分子标记为X和Y染体部分同源的DNA片段，包括X染体特异的DNA片段序列为SEQ ID NO.1，Y染体特异的DNA片段序列为SEQ IDNO.2。基于此差异建立了乌鳢遗传性别PCR鉴定方法，可适用于实验室、养殖场、嘉陵江流域的野生乌鳢、以及白乌鳢的遗传性别鉴定。本发明方法用于乌鳢遗传性别鉴定具有高效、准确和稳定的特点。基于该标记获得了超雄乌鳢YY