一种查尔酮还原酶突变体及其应用

1.本发明属于基因工程和酶工程领域，具体而言，涉及一种查尔酮还原酶突变体及其应用，尤其是查尔酮还原酶突变体用于选择性还原查尔酮碳碳双键合成二氢查尔酮的应用。

背景技术：

2.查尔酮还原酶(chalcone reductase，chr)是醛酮还原酶(akr)蛋白超家族的成员，可催化选择性还原查尔酮及α,β-不饱和羰基结构单元中的碳碳双键，生成二氢查尔酮。二氢查尔酮类化合物具有抗炎、抗肿瘤、抑菌及降血糖等多种药理活性，并且是一种低能量甜味剂，在药品食品制造领域具有较高的应用价值。选择性氢化查尔酮碳碳双键并进行衍生化是合成二氢查尔酮类化合物的主要途径。由于查尔酮类化合物的碳碳双键与相邻羰基共轭形成α,β-不饱和羰基结构单元，两种官能团键能相近，采用化学法还原易发生竞争，具有一定的难度，需要以昂贵的过渡金属作为催化剂，且易污染环境。以查尔酮还原酶为催化剂具有反应条件温和、绿环保、无化学选择性问题等优势，具有良好的应用前景。但野生型查尔酮还原酶的催化效率较低，无法达到工业化应用的要求，开发其高效突变体势在必行。与筛选随机突变体相比，基于三维结构的酶理性设计获得有益突变体的效率显著提高。查尔酮还原酶与辅因子nadph的复合物晶体三维结构已获解析(bomati ek,austin mb,bowman me,dixon ra,noel jp.structural elucidation of chalcone reductase and implications for deoxychalcone biosynthesis.j biol chem 2005,280,30496-30503.pdb id：1zgd)，根据chr-nadph三维结构，结合计算机模拟技术，对底物结合关键位点进行突变，是获得chr有益突变体的有效途径。

技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种查尔酮还原酶突变体，该突变体由野生型查尔酮还原酶氨基酸序列在120位或121位发生以下单突变获得：h120g/r/i/n、w121r/c/n/p/l/q/a/f/y，其中“/”代表“或”。具体的是该突变体是在野生型查尔酮还原酶的氨基酸序列seq id no.1(其dna序列为seq no.2)的基础上发生如下突变之一：h120g、h120r、h120i、h120n、w121r、w121c、w121n、w121p、w121l、w121q、w121a、w121f、w121y。
4.任何查尔酮还原酶突变体包含上述突变，经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且仍具有上述查尔酮还原酶突变体活性的，仍属于本发明的保护范围。
5.本发明的另一个目的是提供一种包含所述查尔酮还原酶突变体编码基因的重组载体。
6.本发明的再一个目的是提供所述查尔酮还原酶突变体在选择性还原查尔酮碳碳双键中的应用，具体地，所述反应中查尔酮还原酶突变体催化查尔酮碳碳双键的还原反应，所述合成反应以查尔酮为原料，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)为辅因子，经查尔酮还原酶突变体催化生成二氢查尔酮，如反应式1所示：
7.进一步的，本发明提供了一种选择性还原查尔酮碳碳双键的方法，以nadph为辅酶，查尔酮在chr突变体的催化下，于缓冲溶液中进行碳碳双键还原反应，生成二氢查尔酮，nadph在反应后氧化形成nadp
+
，所述查尔酮的添加量为0.1～45mm，nadph添加量为0.15～60mm，查尔酮还原酶突变体添加量为0.1～5mg/ml，ph值为5～10，反应温度为20～45℃，反应时间为0.5～24h。
8.本发明还提供了一种用于所述辅因子nadph的再生方法，具体地，辅因子再生系统为：以葡萄糖脱氢酶为辅因子再生酶、以葡萄糖为辅因子再生底物，包含nadph和nadp
+
。
9.本发明所述查尔酮碳碳双键还原体系包括查尔酮还原酶突变体、葡萄糖脱氢酶、查尔酮(底物)、葡萄糖和微量nadp
+
，在控制ph和温度的条件下，可选择性还原查尔酮碳碳双键。查尔酮还原酶突变体催化体系中以葡萄糖脱氢酶为nadph再生酶还原反应原理如反应式2所示。
10.进一步的，查尔酮的添加量为0.1～60mm，nadp
+
添加量为0.01～0.3mm，葡萄糖的添加量为0.15～90mm，查尔酮还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶添加量均为0.1～5mg/ml，ph值为6～9，反应温度为20～45℃，反应时间为0.5～24h。作为优选，温度为30℃，ph值为7.0，时间为6～14h。
11.作为优选，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌。
12.具体的，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)iam1030的葡萄糖脱氢酶，所述葡萄糖脱氢酶氨基酸序列如seq no.3所示，核苷酸序列如seq no.4所示。
16.本发明具有以下有益效果：本发明通过基于查尔酮还原酶与辅因子复合物三维结构的理性突变得到了一种催化选择性还原查尔酮类化合物碳碳双键活性显著增强的突变体，对于催化还原反式查尔酮，突变体h120g、h120i、h120n、h120r、w121r、w121c、w121n、
w121p、w121l、w121a、w121f、w121y的酶活力分别为野生酶的3.6倍、4.0倍、7.6倍、10.0倍、10.1倍、4.6倍、1.6倍、7.0、1.9倍、1.9倍、3.6倍及3.7倍。本发明对查尔酮还原酶工业化应用具有一定意义，旨在提高chr催化查尔酮碳碳双键还原的活性，从而提高了该酶的在食品、医药、化工行业中的应用潜力，实现其工业化应用。
附图说明
17.图1.空白对照高效液相图：以不添加nadph的反应液作为空白，仅有底物查尔酮。
18.图2.查尔酮还原酶野生型催化反应液高效液相图。
19.图3.查尔酮还原酶120位突变体催化反应液高效液相图。
20.图4.查尔酮还原酶121位突变体催化反应液高效液相图。
具体实施方式
21.以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
22.实施例1野生型查尔酮还原酶的制备
23.编码紫花苜蓿(medicago sativa)查尔酮还原酶基因(genbank:u13925.1)序列经密码子优化后(序列如seq id no.2)，由生工生物工程(上海)有限公司全合成后连入pet-28a(+)载体，构建为chr-pet-28a(+)质粒，并测序验证序列后，热击转化到e.coli bl21(de3)感受态细胞，获得查尔酮还原酶表达工程菌，由含有50μg/ml卡那霉素的lb平板培养基上挑取单菌落，接种至含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，于37℃摇床200rpm振荡培养12h后，转接至3l液体tb培养基中扩大培养，于37℃摇床200rpm继续振荡培养12h，当培养液的光密度od
600
达到0.6时，将温度降低至16℃，加入终浓度为1.0mm的iptg溶液用于诱导表达12h，将培养液4000rpm离心25min，弃去上清培养液，菌体-20℃保存备用。
24.收集的菌体每3g加入20ml细胞裂解液(20mm咪唑，50mm nah2po4，300mm nacl，ph 8.0)，临用前加入1mg/ml溶菌酶，4℃条件下超声细胞破碎20min，12,000rpm离心25min，上清液即为粗酶液。玻璃层析柱中加入3ml ni-nta填料，待填料沉降，20ml裂解液平衡，以1ml/min的速率上样粗酶液。20ml细胞裂解液洗脱杂蛋白，洗脱液缓冲液(250mm咪唑，50mm nah2po4，300mm nacl，ph 8.0)洗脱目标蛋白，测定蛋白浓度，并进行透析，去除咪唑，得到纯度较高的查尔酮还原酶，4℃保存备用。
25.实施例2查尔酮还原酶突变体的制备
26.以chr与辅因子nadph复合物三维结构为模板，经分子对接及动力学模拟底物与chr的结合，确定查尔酮还原酶120位组氨酸和121位氨酸为底物结合关键位点，以连有野生型查尔酮还原酶dna的质粒chr-pet-28a(+)为模板，对上述两个位点进行定点突变。
27.表1.查尔酮还原酶突变所用引物突变体名称引物h120gfor5'-ggatctgtacctgatcggatggccgctgagcagcca-3' rev5'-ctgctcagcggccatccgatcaggtacagatcca-3'h120rfor5'-ggatctgtacctgatccggtggccgctgagcagcca-3' rev5'-ctgctcagcggccaccggatcaggtacagatcca-3'
nta为纯化材料，装柱体积为3ml，15ml裂解液平衡ni-nta柱，以1ml/min的速率上样粗酶液，用淋洗缓冲液(20mm咪唑，50mm nah2po4，300mm nacl，ph 8.0)洗脱去除未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(250mm咪唑，50mm nah2po4，300mm nacl，ph 8.0)洗脱收集目标蛋白，用5l kpi缓冲液(50mm kh2po4，50mm k2hpo4，10mm edta，ph 7.0)透析目标蛋白，去除盐及咪唑，所得纯酶液4℃保存备用。
33.实施例4.查尔酮还原酶野生型及突变体选择性还原查尔酮碳碳双键(以查尔酮为例)
34.将实施例1和2中所得查尔酮还原酶野生型或突变体按照2mg/ml、实施例3中所得葡萄糖脱氢酶按照浓度1mg/ml的添加量加入到反应体系中，以含有10mm edta的50mm ph 7.0kpi为缓冲液，再分别加入终浓度为0.8mm的底物查尔酮、1.2mm葡萄糖、0.02mm nadp
+
于30℃恒温振荡(660rpm)反应2h，加等体积甲醇终止反应，反应液经12000rpm，30min离心后，取上清液进样高效液相(hplc)对底物和产物量进行分析。hplc分析方法为：谱仪安捷伦高效液相谱1260；谱柱agilent 5hc-c18 250*4.6mm；柱温30℃；流速1ml/min；检测波长254nm；流动相：水55％，乙腈45％。查尔酮碳碳双键还原产物为二氢查尔酮，以不加辅因子nadph的酶和查尔酮混合液为空白对照(图1)，二氢查尔酮标准品为对照，分析查尔酮还原酶野生型及突变体催化反应，并通过查尔酮和二氢查尔酮标准品浓度曲线计算收率，比较查尔酮还原酶野生型(图2)与120位突变体(图3)及121位突变体(图4)的相对活性。
35.表2.以查尔酮为底物检测查尔酮还原酶突变体活性
36.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：

1.一种查尔酮还原酶突变体，其特征在于，该突变体是在野生型查尔酮还原酶的氨基酸序列seq id no.1的基础上发生如下突变之一：h120g、h120r、h120i、h120n、w121r、w121c、w121n、w121p、w121l、w121q、w121a、w121f、w121y。2.一种编码基因，其特征在于，编码权利要求1所述查尔酮还原酶突变体。3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述编码基因。.4.权利要求1所述查尔酮还原酶突变体作为催化剂在选择性还原查尔酮碳碳双键中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述选择性还原查尔酮碳碳双键中的应用通过以下步骤实现：以查尔酮为原料，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)为辅因子，经查尔酮还原酶突变体催化生成二氢查尔酮，反应式如下：在反应过程中nadph被氧化成nadp
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，通过辅因子再生系统将nadp
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再生为nadph。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述辅因子再生系统为：以葡萄糖脱氢酶为辅因子再生酶、以葡萄糖为辅因子再生底物、包含nadph和nadp
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的葡萄糖脱氢酶辅因子再生系统。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，查尔酮还原酶突变体催化反应中，所述查尔酮的添加量为0.1～45mm，nadph添加量为0.15～60mm，查尔酮还原酶突变体添加量为0.1～5mg/ml，ph值为5～10，反应温度为20～45℃，反应时间为0.5～24h。

技术总结

本发明提供一种查尔酮还原酶突变体及其应用，该突变体由野生型查尔酮还原酶氨基酸序列在120位或121位发生以下单突变获得：H120G/R/I/N、W121R/C/N/P/L/Q/A/F/Y。本发明对上述突变体选择性催化还原查尔酮碳碳双键的活性，筛选获得选择性催化还原活性显著高于野生型的查尔酮还原酶突变体。本发明中所述查尔酮还原酶作为生物催化剂用于选择性还原查尔酮碳碳双键合成二氢查尔酮的方法具有反应步骤简单、反应条件温和、催化效率高、酶制备容易、热稳定性好等优点，发掘了催化性能显著优于野生型的突变体。本发明对查尔酮还原酶的工业化应用具有重要意义，提升查尔酮还原酶在选择性还原查尔酮碳碳双键的应用力。原查尔酮碳碳双键的应用力。