一种鉴别水稻稻瘟病抗性基因座Pik功能基因的插入缺失分子标记及其应用

一种鉴别水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的插入缺失分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种鉴别水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的插入缺失分子标记及其应用。

背景技术：

2.水稻是世界上主要的粮食作物之一，其产量的高低关系到全球粮食安全。由稻瘟病菌(magnapothe oryzae)引起的稻瘟病害是世界水稻产区最重要的病害，每年可造成水稻减产10％-30％(dean et al.,2005)。长期生产实践表明，防治稻瘟病最经济有效、对环境安全的策略就是利用优异抗性资源及基因培育具有广谱抗病能力的水稻新品种。迄今为止，已鉴定近百个稻瘟病抗性基因，其中23个基因已被克隆(liu et al.,2014)。在此基础上，开发了很多与抗抗病基因连锁的分子标记，特别是基于基因序列的功能特异的分子标记，并用其辅助水稻抗病育种。相较于传统的接种鉴定方法，这种方法更为简单便利，操作性强，且不受遗传背景的限制。
3.稻瘟病抗病基因座pik是水稻一个主效抗稻瘟病位点，位于水稻第11染体长臂近端粒处。目前，该位点已有多个抗稻瘟病等位基因被克隆，包括pik、pik-m、pik-p、pik-h、pik-s、pi1、pi7和pik-lth等。除pik-lth(非抗病功能基因)外，这些基因对我国不同稻区的稻瘟菌生理小种均具有较广谱抗性，在水稻抗病育种中具有重要的应用价值(xiao et al.,2020)。研究发现，基因座pik的等位基因介导的抗性由两个紧密连锁、具有独立功能的nbs-lrr基因pik-1和pik-2协同作用(ashikawa et al.,2008)。在pik-1/pik-2介导的免疫反应中，pik-1的hma(heavy-metal-associated)结构域可特异性识别稻瘟病菌无毒基因avrpik，是基因座pik等位基因序列中最具多态性的区域(meng et al.,2021)。
4.目前，研究者针对pik抗病基因的编码区开发了鉴定不同等位基因的功能特异性分子标记。如稻瘟病抗性基因pik-s功能特异性分子标记piksfnp及其方法与应用(zl201210118460.5)，一种用于检测抗稻瘟病pik基因的snp分子标记及其应用(cn202011566147.9)，稻瘟病抗性基因pi1功能特异性分子标记pik1fnp及其方法与应用(201210039960.x)，稻瘟病抗性基因pik功能特异性分子标记pikfnp及其方法与应用(cn201210060905.9)，稻瘟病抗性基因pik-m功能特异性分子标记pikmfnp及其方法与应用等(cn201210060274.0)。然而这些分子标记鉴定的方法均要经过pcr、酶切、电泳检测等过程。另外，研究表明稻瘟病抗病基因座pik的功能性抗病基因在水稻种质资源和品种中的分布是很少的(xiao et al.,2020；陈子强等，2016)。因此，直接利用已开发的标记应用于大量水稻品种和种质资源鉴定/筛选中工作量大，且操作具有一定的盲目性。通常，一些科研人员会通过pcr检测优先确定基因座pik是否存在pik-1/pik-2基因(zhai et al.,2011；陈子强等，2016)，但这种方法无法排除pik-lth无抗病功能的基因。为了提高检测效率、降低成本，并精准识别pik功能基因，在本发明中，申请人提供了一种稻瘟病抗性基因座pik功能基因的分子标记pik-gn及其方法，该方法只需要经过pcr扩增和凝胶检测，就可明确水稻种
质资源中是否存在稻瘟病抗病基因座pik的功能基因，有易于后续抗病基因型的进一步鉴定和抗病种质资源的筛选，可广泛应用于生产实践。

技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种鉴别水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的插入缺失分子标记。
6.本发明的另一目的在于提供所述的一种鉴别水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的插入缺失分子标记的制备方法。
7.本发明的再一目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因座pik功能基因的分子标记的应用。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：
9.一种鉴别水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的插入缺失分子标记：
10.所述插入缺失分子标记的物理位置为水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的828-836位点处。
11.进一步的，所述插入缺失碱基序列为5
’‑
agatagtgg-3’。
12.一种鉴定权利要求1所述一种鉴别水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的插入缺失分子标记的特异性引物对，所述引物对序列如seq id no.1-2所示。
13.水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的分子标记pik-gn，利用所述seq idno.1-2从水稻基因组dna中扩增出与功能基因呈特异性带型的分子标记pik-gn。
14.进一步的，所述分子标记pik-gn的dna片段包含一个编码hma(heavy-metal-associated)结构域的核苷酸序列，位置为700-933位点处；
15.所述pik-gn序列为pik序列或者pik序列发生至少一个碱基插入、缺失或替换的序列；所述pik序列如seq id no.3所示。
16.一种鉴别水稻抗稻瘟病基因座pik功能基因分子标记pik-gn的鉴定方法，包括以下步骤：
17.1)提取待鉴别水稻的基因组dna；
18.2)利用引物对seq id no.1-2对所述水稻基因组dna进行pcr扩增反应，得到功能分子标记扩增产物；
19.3)对步骤2)制备的功能分子标记扩增产物进行电泳检测以及测序验证；
20.4)对步骤3)所获得的电泳检测凝胶进行带型显和基因型分型，若扩增产物存在248bp的条带，则水稻品种携带了稻瘟病抗性基因座pik的功能基因；若扩增产物存在257bp的条带，则水稻品种携带pik的非功能抗性基因；若无扩增产物，则水稻品种中不存在pik位点等位基因。
21.进一步的，步骤2)所述pcr扩增反应体系如下：
[0022][0023]
pcr温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃7分钟；10℃保存。
[0024]
进一步的，步骤3)所述电泳检测如下：取1μl pcr样品产物在8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为130v，2小时。
[0025]
一种鉴别水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的插入缺失分子标记在稻瘟病抗性基因座pik的等位基因类型鉴别、在水稻品种和种质资源基因型检测中的应用。
[0026]
本发明的有益效果：
[0027]
本发明是针对稻瘟病抗病基因座pik的主效抗病基因开发的功能特异性分子标记，pik-gn功能特异性分子标记在实际应用中，具有特异性强、准确率高、成本低、效率高等优点：
[0028]
1)pik-gn功能特异性分子标记能够利用电泳检测的方法成功地将稻瘟病抗病基因座pik的主效抗病基因与其它无功能抗病基因区分开，特异性强；
[0029]
2)本发明所提供的pik-gn分子标记是针对基因内部一段编码hma结构域的核苷酸序列，该序列是特异性识别稻瘟病菌无毒基因avrpik的区域，也是基因座pik等位基因序列中最具多态性的区域，可开发真实反映目标基因，准确率高。
[0030]
3)本发明提供的pik-gn功能特异性分子标记只需pcr结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，就能快速筛查水稻种质资源中的稻瘟病抗病基因座pik的抗病功能基因，并可为后续特定基因型的鉴定工作减少工作量和成本，特别适用于农业生产实践以及任何遗传背景下稻瘟病抗病基因座pik功能基因的种质资源筛选，大大提高了育种效率。
[0031]
因此，本发明所提供的稻瘟病抗性基因pik-gn具有重要的应用价值，利用此标记可以提高稻瘟病抗性基因座pik抗病功能基因在种质资源筛选、分子标记辅助选择育种的效率。
附图说明
[0032]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0033]
图1是pik、pik-m、pik-s、pi1、pik-h、pik-p、pi7、pik-lth等位基因部分序列。
[0034]
图2是稻瘟病抗性基因座pik功能基因的分子标记在9个已知pik等位基因的水稻品种中的验证图，其中：泳道m为dna ladder，泳道1～9的样品依次为日本晴、丽江新团黑谷
(pik-lth)，irblk-ka(pi-k)、irblkm-ts(pi-km)、irblkp-k60(pi-kp)、irblkh-k3(pi-kh)、irblks-s(pi-ks)、irbl1-cl(pi-1)和irbl7-cl(pi-7)；
[0035]
图3是实施例2pcr扩增产物测序结果；
[0036]
图4是稻瘟病抗性基因座pik功能基因的分子标记在37个水稻品种中的检测结果，其中：泳道m为dna ladder，泳道1～37的样品依次为日本晴、丽江新团黑谷、irblk-ka、隆两优华占、隆两优1377、和两优713、晶两优534、恩恢99-64、福稻88、隆两优黄莉占、隆两优3206、y两优5867、晶两优1125、荣优308、创两优0861、和两优1号、赣810、陆两优17、两优8341、粳谷、陵两优211、甬优1540、紫心糯、香优雅丝苗、锦两优816、五优556、荟丰a、佳福占、成恢448、福恢016、明恢72、徽两优882、福恢9649、r527、徽两优1813、京虎b、悦两优2464；
具体实施方式
[0037]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0038]
实施例1：水稻抗稻瘟病基因座pik功能基因分子标记的制备方法，具体包括以下步骤：
[0039]
1)已克隆基因座pik等位基因的序列分析：
[0040]
公共数据库中下载得到pik-1等位基因的核苷酸序列：pik(genbank:ab616658.1)、pik-m(genbank:gu811860.1)、pik-s(genbank:hq662329.1)、pi1(genbank:hq606329.1)、pik-h(genbank:hq662330.1)、pik-p(genbank:hm035360.1)、pi7(ky225903.1)、pik-lth(ku365334.1)和日本晴(locus:loc_os11g42010)。将这些进行序列比对，各等位基因部分序列如图1所示。
[0041]
图1结果表明，除pik-lth(非功能性抗病基因)外，其它的功能型抗病基因在828-836位点处存在9个碱基(agatagtgg)缺失，而日本晴则无对应的基因组序列。
[0042]
2)设计引物:
[0043]
根据标记的设计原理，根据pik序列(seq id no.3)设计引物，引物对碱基序列如下所示：
[0044]
seq id no.1:5
’‑
tgttgcagcaaaaaatcgtg-3’；
[0045]
seq id no.2:5
’‑
gcgtcgtctccttcacatct-3’；
[0046]
4)pcr扩增获得含有基因座pik等位功能基因的特异性片段
[0047]
利用上述引物对seq id no.1和seq id no.2，以上述水稻品种的总dna为模板进行常规pcr扩增以及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
[0048]
扩增反应体系如下：
[0049][0050]
pcr温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃7分钟；10℃保存。
[0051]
pcr反应结束后，取适量样品，pcr反应结束后，为了检测目的基因片段大小，取1μl pcr样品产物在8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为130v，2小时。
[0052]
实施例2：分子标记pik-gn在鉴别稻瘟病抗性基因座pik功能基因的应用
[0053]
采集携带不同稻瘟病抗性基因的8个水稻品种，品种如下：
[0054]
①
选择携带有基因座pik等位功能基因的抗稻瘟病水稻品种
[0055]
irblk-ka(pi-k)、irblkm-ts(pi-km)、irblkp-k60(pi-kp)、irblkh-k3(pi-kh)、irblks-s(pi-ks)、irbl1-cl(pi-1)、irbl7-cl(pi7)。
[0056]
②
选择携带有基因座pik等位非功能基因的感病水稻品种
[0057]
丽江新团黑谷(pik-lth)
[0058]
③
选择不携带基因座pik等位基因的感病水稻品种
[0059]
日本晴
[0060]
提取这些水稻品种的dna，以此为模板，利用实施例1中描述的pcr扩增反应体系和反应条件，对抗性基因座pik功能基因的分子标记pik-gn进行pcr扩增及电泳检测。电泳结果如图2所示，泳道1无扩增产物，表示不含pik等位基因；泳道2有一条相对更高的带型(257bp)，表示含有pik位点的非功能抗性基因；泳道3～9有一条相对更低的带型(257bp)，表示携带了pik位点的功能基因。同时，2～9泳道相应的pcr产物用诺唯赞生物公司的dna纯化试剂盒(货号：dc301)进行纯化，并送生工生物工程(上海)公司测序，测序结果(如图3)显示，上述材料所扩增的pcr产物就是pik等位基因的序列。
[0061]
实验结果与设计分析相吻合，说明pik-gn可以作为鉴别稻瘟病抗性基因座pik等位功能基因的分子标记。
[0062]
实施例3：pik功能基因分子标记pik-gn在水稻品种基因型检测中的应用
[0063]
选择37个代表性水稻品种，依次为:日本晴、丽江新团黑谷、irblk-ka、隆两优华占、隆两优1377、和两优713、晶两优534、恩恢99-64、福稻88、隆两优黄莉占、隆两优3206、y两优5867、晶两优1125、荣优308、创两优0861、和两优1号、赣810、陆两优17、两优8341、粳谷、陵两优211、甬优1540、紫心糯、香优雅丝苗、锦两优816、五优556、荟丰a、佳福占、成恢448、福恢016、明恢72、徽两优882、福恢9649、r527、徽两优1813、京虎b、悦两优2464。
[0064]
分别提取上述水稻品种的基因组dna，并以此为模板，按照实施例1的方法，进行pcr扩增和电泳检测。根据条带的大小和存在情况，可以把基因座pik的功能基因与其他无功能基因区分开来。如图4所示，在37份水稻品种中，有7份材料的pcr扩增产物在电泳检测
中以248bp条带呈现，说明这些材料均含有基因座pik的功能基因；除以上7份材料外，其它材料均检测不到248bp条带(以257bp条带或无条带呈现)，说明这些材料不含有该位点的功能基因。
[0065]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：

1.一种鉴别水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的插入缺失分子标记，其特征在于：所述插入缺失分子标记的物理位置为水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的828-836位点处。2.根据权利要求1所述一种鉴别水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的插入缺失分子标记，所述插入缺失碱基序列为5
’‑
agatagtgg-3’。3.一种鉴定权利要求1所述一种鉴别水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的插入缺失分子标记的特异性引物对，其特征在于，所述引物对序列如seq id no.1-2所示。4.水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的分子标记pik-gn，其特征在于，利用权利要求3所述seq id no.1-2从水稻基因组dna中扩增出与功能基因呈特异性带型的分子标记pik-gn。5.根据权利要求4所述的水稻稻瘟病抗性基因座pik功能基因的分子标记pik-gn，其特征在于，所述分子标记pik-gn的dna片段包含一个编码hma(heavy-metal-associated)结构域的核苷酸序列，位置为700-933位点处；所述pik-gn序列为pik序列或者pik序列发生至少一个碱基插入、缺失或替换的序列；所述pik序列如seq id no.3所示。6.一种鉴别水稻抗稻瘟病基因座pik功能基因分子标记pik-gn的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待鉴别水稻的基因组dna；2)利用引物对seq id no.1-2对所述水稻基因组dna进行pcr扩增反应，得到功能分子标记扩增产物；3)对步骤2)制备的功能分子标记扩增产物进行电泳检测以及测序验证；4)对步骤3)所获得的电泳检测凝胶进行带型显和基因型分型，若扩增产物存在248bp的条带，则水稻品种携带了稻瘟病抗性基因座pik的功能基因；若扩增产物存在257bp的条带，则水稻品种携带pik的非功能抗性基因；若无扩增产物，则水稻品种中不存在pik位点等位基因。7.根据权利要求6所述的一种鉴别水稻抗稻瘟病基因座pik功能基因分子标记pik-gn的鉴定方法，其特征在于，步骤2)所述pcr扩增反应体系如下：pcr温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃7分钟；10℃保存。8.根据权利要求6所述的一种鉴别水稻抗稻瘟病基因座pik功能基因分子标记pik-gn的鉴定方法，其特征在于，步骤3)所述电泳检测如下：取1μl pcr样品产物在8％的聚丙烯酰
胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为130v，2小时。9.权利要求1所述分子标记在稻瘟病抗性基因座pik的等位基因类型鉴别、在水稻品种和种质资源基因型检测中的应用。

技术总结

本发明提供了一种鉴别水稻稻瘟病抗性基因座Pik功能基因的插入缺失分子标记及其应用，涉及农业生物技术领域。本发明要求保护一种鉴别水稻稻瘟病抗性基因座Pik功能基因的插入缺失分子标记，插入缺失分子标记的物理位置为水稻稻瘟病抗性基因座Pik功能基因的828-836位点处。本发明通过引物对SEQ ID NO.1-2从水稻基因组DNA中扩增出与功能基因呈特异性带型的分子标记Pik-GN。本发明所提供的稻瘟病抗性基因座Pik功能基因的分子标记具有重要的应用价值，利用此标记可以提高水稻品种/种质资源Pik位点功能基因型检测以及分子标记辅助选择育种的效率。择育种的效率。择育种的效率。