长牡蛎含DM9结构域的重组蛋白rCgDM9CP-7及其应用

长牡蛎含dm9结构域的重组蛋白rcgdm9cp-7及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7及其应用。

背景技术：

2.dm9是一种新型的模式识别结构域，最初在果蝇中被发现。随后在鱼类中发现一种含dm9结构域的毒素，该毒素的n-端含dm9结构域，c端含细菌毒素(etx/mtx2)结构域，并将其命名为“natterin”，它可对人体细胞产生毒性作用，导致细胞坏死、水肿和局部肿胀。近几年，越来越多含dm9结构域的蛋白(dm9-domain containing protein,dm9cp)在节肢动物、软体动物被发现。例如当肝吸虫寄生在肝脏表面后，dm9表达量显著升高引发机体产生免疫反应，冈比亚按蚊中的dm9cps在唾液腺侧叶上的表达量随疟原虫入侵后感染孢子虫数量的增加而升高。研究发现，长牡蛎cgdm9cp-1能识别微生物和病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,pamps)，对甘露糖mannose具有相对较强的结合活性。同时，已报道cgdm9cp-1对菌株具有识别结合活性能力，cgdm9cp-2可与d-mannose、lps及pgn结合。
3.但是，迄今为止未见关于长牡蛎含dm9结构域重组蛋白作为抑制特定菌株的制剂，以及识别特定pamps活性的相关报道。

技术实现要素：

4.本发明是为了解决现有技术所存在的上述问题，提供一种长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7及其应用。
5.为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：
6.一种长牡蛎含dm9结构域的重组蛋白rcgdm9cp-7，长牡蛎含dm9结构域的重组蛋白rcgdm9cp-7其氨基酸序列如seq id no.1所示，或，与其同源性大于等于90％的氨基酸序列。
7.一种长牡蛎含dm9结构域的重组蛋白rcgdm9cp-7的制备方法，依次按照如下步骤进行：
8.a.用引物p1和p2对长牡蛎cgdm9cp-7基因编码区片段进行pcr扩增，
9.b.将pcr扩增产物与pet30a载体经bamh i和xhol i酶切后通过t4连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；
10.c.将所述重组子转入大肠杆菌transetta(de3)表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，即得到具有序列表seq id no.1中氨基酸序列的重组蛋白rcgdm9cp-7。
11.所述引物p1为cgcggatccatgaaaaagaaggtaaaaat；
12.引物p2为acgcgtcgacctacttgatcttacagagga。
13.一种长牡蛎含dm9结构域的重组蛋白rcgdm9cp-7的应用，所述重组蛋白rcgdm9cp-7在识别干扰素诱导剂(poly(i:c))中的应用。
14.一种长牡蛎含dm9结构域的重组蛋白rcgdm9cp-7的应用，所述重组蛋白rcgdm9cp-7在制备灿烂弧菌、大肠杆菌、金黄葡萄球菌或枯草芽孢杆菌的凝集制剂进而抑制菌株生长中的应用。
15.本发明所具有的优点：
16.本发明长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7克隆自长牡蛎cdna文库，rcgdm9cp-7具有结合man、lps、pgn及poly(i:c)的活性。rcgdm9cp-7能与真菌y.lipolytica、p.pastoris革兰氏阳性菌s.aureus、m.luteus及革兰氏阴性菌e.coli、v.splendidus结合。rcgdm9cp-7能显著抑制v.splendidus、e.coli与s.aureus生长，介导v.splendidus、e.coli与b.subtilis凝集并使其菌体表面出现褶皱等。作为一种有效的模式识别受体，在制备抗菌类药物、新型免疫制剂以及饲料添加剂等方面具有应用价值。cgdm9cp-7与cgdm9cp-2相比除结合man、lps及pgn外还可结合poly(i:c)。并且比对e.coli、v.splendidus及s.aureus抑菌能力更强。同时cgdm9cp-7可促进v.splendidus、e.coli及b.subtilis凝集使b.subtilis表面发生褶皱。
附图说明
17.图1是本发明实施例长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7结合菌的活性检测效果图。
18.图2是本发明实施例长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7结合pamp的活性检测效果图。
19.图3-5是本发明实施例长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7孵育后v.splendidus、e.coli及s.aureus生长情况的检测图。
20.图6是本发明实施例长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7孵育后v.splendidus、e.coli及b.subtilis形态结构的电子显微镜观察结果。
具体实施方式
21.以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
22.实施例1
23.长牡蛎含dm9结构域重组蛋白cgdm9cp-7制备方法，依次按照如下步骤进行：
24.1.重组载体的构建
25.本发明实施例采用重组载体为novagen公司pet-30a(+)原核表达载体。通过pcr技术，采用5’末端分别添加了bamh i和xhol i限制性酶切位点引物p1和p2，对长牡蛎cgdm9cp-7mrna编码区进行扩增；
26.所述引物p1为cgcggatccatgaaaaagaaggtaaaaat；
27.引物p2为acgcgtcgacctacttgatcttacagagga。
28.pcr反应条件为：首先94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min；利用琼脂糖胶电泳将扩增片段纯化回收，与pmd19-t载体连接；转化后筛选阳性克隆，提取质粒，并使用bamh i和sal i对质粒进行双酶切；回收目的片段与经bamh i和sal i酶切的表达载体pet-30a(+)连接，完
成重组质粒的构建。
29.2.重组蛋白rcgdm9cp-7表达
30.将构建好的重组质粒转化表达大肠杆菌transetta(de3)中，挑取单克隆，接种于400ml lb液体培养基中，220rpm，37℃培养至od
600
＝0.4～0.8；加入iptg(终浓度1mmol/l)，继续培养12h后于4℃，12,000
×
g离心5min，收集菌体，于-80℃冻存备用；同时取1ml菌液离心，弃去上清后，加入80μl水和20μl 5
×
蛋白上样缓冲液，99℃煮沸10min，稍离心，sds-page检测表达产物。
31.3.重组蛋白rcgdm9cp-7纯化与复性
32.将表达产物采用镍琼脂糖凝胶ff柱纯化，获得了变性重组蛋白，用透析缓冲液透析复性。具体操作步骤如下：
33.(1)镍琼脂糖凝胶ff装柱，1.6
×
20cm，柱床体积为10ml；
34.(2)用缓冲液i(50mmol/l tris-hcl缓冲液，ph为9.0，50mmol/l nacl，8mol/l尿素)平衡2～5个床体积，流速为2ml/min；
35.(3)取经iptg诱导表达细胞，用缓冲液i重悬，150w超声破碎30min，12,000
×
g，4℃离心30min，上清液用0.45μm滤膜过滤后，过柱，流速为1ml/min；
36.(4)用缓冲液i再洗2～5个床体积，流速为2ml/min；
37.(5)用含有50mmol/l咪唑缓冲液i再洗2～5个柱床体积，流速为2ml/min；
38.(6)用含400mmol/l咪唑缓冲液i洗脱目的蛋白，收集；
39.(7)用sds-page检测融合蛋白表达；
40.(8)用纯水流洗5个柱床体积，再用20％乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4℃环境中保存变性状态下提纯重组蛋白需要在复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。变性纯化产物经2mm还原谷胱甘肽、0.4mm氧化谷胱甘肽、1mm edta、50mm tris-hcl、100mm nacl、10％甘油、1％甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度起始6m逐渐替换到4m、3m、2m、1m、0m，最后一次透析至无尿素透析液时不加甘油，每次在4℃透析12h，即得到长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7，所得到的长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7氨基酸序列如seq id no.1所示。
41.seq id no.1：
42.mkkkvkmavwvtttgchipehairagyeadgrplfiarasmegtltpgkcgfhlpgahipygckeniahqyevlvhpnnaqgfydwqraadgnvpehalktdtdtyvgrayfsgslvpckiatssphmcaymgyggkehntkdyevlckik-43.长度：152个氨基酸
44.类型：氨基酸
45.链型：单链
46.特性：分子量为16.67kda，等电点为8.49，具有两个dm9结构域。
47.实验例2：本发明长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7与菌结合活性检测
48.基于western blotting方法检测重组蛋白rcgdm9cp-7对两种革兰氏阴性菌(灿烂弧菌和大肠杆菌)，两种革兰氏阳性菌(藤黄微球菌和金黄葡萄球菌)以及两种真菌(耶罗维亚酵母菌和毕赤酵母)结合活性。所用菌种来源如下：灿烂弧菌(vibrio splendidus jz6)购自北京微生物菌种保藏中心，大肠杆菌(escherichia coli)购自北京全式金公司，
金黄葡萄球菌(staphylococcus aureus)购自北京微生物菌种保藏中心，藤黄微球菌(micrococcus luteus)购自北京微生物菌种保藏中心，耶罗维亚酵母菌(yarrowia lipolyticd)购自北京微生物菌种保藏中心,毕赤酵母菌(pichia pastoris gs115)购自invitrogen。
49.具体操作如下：
50.(1)对上述7种微生物进行过夜培养，培养方法：藤黄微球菌与大肠杆菌于lb培养基37℃培养20h，金黄葡萄球菌于lb培养基28℃培养20h，灿烂弧菌和耶罗维亚酵母菌于2216e培养基中28℃培养20h，毕赤酵母菌于ypd培养基中28℃培养20h；
51.(2)对上述获得菌液分别离心收集菌体，使用tbs缓冲液重悬，调整菌浓度均为1
×
108cfu/ml；
52.(3)吸取100μl各微生物悬液分别与等体积上述实施例制备获得重组蛋白rcgdm9cp-7混合，于室温旋转孵育30min；
53.(4)10,000
×
g离心2min收集菌体，tbs缓冲液清洗菌体四次；
54.(5)洗涤完成后收集菌体，使用40μl无菌水重悬；
55.(6)加入10μl 5
×
蛋白电泳缓冲液，于99℃加热10min，sds-page电泳分离蛋白样品；
56.(7)电泳完成后，取下凝胶，并裁取相同大小nc膜和滤纸共同浸入电转缓冲液中静置10min；
57.(8)按照从上到下顺序依次将滤纸、nc膜、凝胶和滤纸放入电转仪中，根据凝胶块面积大小设定对应电流，转膜25min；
58.(9)取出nc膜，使用tbs缓冲液洗涤三次，每次5min；
59.(10)使用缓冲液tbst洗涤三次，每次5min；
60.(11)将nc膜放入5％脱脂奶粉(溶解于tbst)中，室温封闭2h；
61.(12)取出nc膜，使用tbst缓冲液洗涤三次，每次5min；
62.(13)将nc膜浸入按比例稀释(1：2000(v/v))的his标签单抗(购于上海生工)溶液(5％脱脂奶粉，tbst缓冲液)，于室温条件下孵育1h；
63.(14)取出nc膜，使用tbst缓冲液洗涤三次，每次5min。
64.(15)将nc膜放入按比例稀释(1：2000(v/v))的羊抗小鼠hrp二抗(购自于上海生工)溶液中(5％脱脂奶粉tbst缓冲液)，于室温孵育1h；
65.(16)取出nc膜，使用tbst缓冲液洗涤三次，每次10min；
66.(17)ecl方法显影，成像仪记录western blotting结果，如图1所示。
67.结果显示，本发明实施例长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌均具有不同程度的结合活性，且对灿烂弧菌、大肠杆菌、金黄葡萄球菌及藤黄微球菌结合活性高于毕赤酵母菌和耶罗维亚酵母菌。rtrx阴性对照组中则无明显条带。
68.实验例3：本发明长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7与糖结合活性检测
69.利用酶联免疫吸附反应(elisa)实验检测本发明长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7与各种pamps结合情况。所用man、lps、pgn及poly(i:c)四种糖均购自sigma。
70.具体操作步骤如下：
71.(1)将na2co3(15mmol/l)与nahco3(35mmol/l)所配置包被液(ph为7.6)分别溶解man、lps、pgn和poly(i:c)四种糖并调至浓度均为125μg/ml，随后向酶标板每孔加100μl，4℃过夜；
72.(2)弃掉包被液体并tbs-t清洗4次，每次4min；
73.(3)清洗后孔内加3％ bsa250μl于37℃恒温培养箱中封闭1h；
74.(4)封闭完毕后重复步骤2；
75.(5)各孔加入100μl不同浓度(浓度为15.625、31.25、62.5、125、250及500μg/ml)的重组蛋白rcgdm9cp-7(阴性对照加入rtrx蛋白，对照孔加tbs)室内恒温孵育2h；
76.(6)重复步骤(4)；
77.(7)各孔中以1：1,000(v/v)比例加入his标签一抗100μl，37℃放置1h；
78.(8)同步骤(2)；
79.(9)将步骤(7)中抗体换成hrp二抗并37℃恒温培养箱孵育1h；
80.(10)用tbst洗涤各孔5次，每次3min；
81.(11)利用tmb显液显约30min后加入终止液45.65μl(浓度为2m hcl)终止显，随后测定得到od
595
数值，结果如图2所示。
82.结果显示，本发明实施例重组蛋白rcgdm9cp-7与man、lps、pgn、poly(i:c)都具有结合活性，并且重组蛋白rcgdm9cp-7与man和lps亲和力最强(p/n＝7.45；6.44)，而与pgn亲和力(p/n＝5.10)以及与poly(i:c)亲和力(p/n＝4.21)次之。并且重组蛋白rcgdm9cp-7与man、lps、pgn、poly(i:c)亲和力随重组蛋白rcgdm9cp-7浓度递增而加强。而阴性对照rtrx与以上四种糖均无结合活性。
83.实验例4：本发明长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7抑制细菌生长的活性(生长曲线法)检测
84.采用生长曲线法对rcgdm9cp-7孵育后，革兰氏阴性菌v.splendidus、e.coli及革兰氏阳性菌s.aureus的生长情况进行检测。
85.所述菌种来源如上。
86.具体操作如下：
87.(1)实验细菌用tbs溶液配成浓度均约为4
×
104cell/ml菌悬液；
88.(2)取100μl重组蛋白rcgdm9cp-7与100μl菌悬液混合室温孵育2h；
89.(3)孵育完毕后10,000
×
g离心2min收集菌体，缓冲液tbs洗3次；
90.(4)将测试菌液20μl及200μl 2216e或lb培养液加入到96孔酶标板中，同时设置阴性对照孔(rtrx)对照孔，每孔体积共220μl；
91.(5)置于酶标仪中适温培养10-12h至到达平台期，每半小时读一次od
600
数值；
92.(6)绘制各检测细菌生长曲线进行比较。结果如图3-5所示。
93.结果显示，本发明实施例长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7与对照组rtrx蛋白相比在11h及2.5h时对灿烂弧菌、大肠杆菌及金黄葡萄球菌生长产生显著抑制现象。
94.实验例5：本发明长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7细菌凝集活性电子显微镜检测
95.某些蛋白能够结合到细菌的细胞壁造成不同程度凝集及破坏。采用电子显微镜观察法对革兰氏阴性菌v.splendidus、e.coli及革兰氏阳性菌b.subtilis进行检测。
96.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)购自北京微生物菌种保藏中心并于lb培养基28℃培养20h其余菌种来源如上；而后进行实验，下述以枯草芽孢杆菌为例进行操作。
97.具体操作如下：
98.(1)枯草芽孢杆菌于lb培养基28℃培养20h，随后将实验菌液用tbs溶液配成浓度约为4
×
104cell/ml菌悬液；
99.(2)取3ml重组蛋白rcgdm9cp-7与3ml菌悬液混合同时设置阴性对照(rtrx)室温孵育3h；
100.(3)孵育完毕后5,000
×
g离心2min收集菌体，缓冲液tbs洗3次；
101.(4)将上清弃掉后沉淀菌泥用2.5％戊二醛固定12h；
102.(5)固定后用磷酸缓冲液清洗5,000
×
g 3次；
103.(6)随后1％锇酸浸泡5h缓冲液清洗5,000
×
g 3次；
104.(7)乙醇梯度脱水，30％、50％、70％、85％、95％各一次及100％乙醇2次每次20min；
105.(8)乙酸异戊酯置换2次每次20min；
106.(9)将定性滤纸对折成小纸包，订书钉将一端钉牢，成小口袋状。离心浓缩后的菌液滴入小纸包订书钉封口后，立即放入临界点干燥器样品室，进行co2临界点干燥；
107.(10)干燥后剪开滤纸包，将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿。碳导电胶带一面粘在1/4盖玻片上，另一面倒扣轻压在菌体粉末上，翻正后用镊子将菌体轻轻刮薄铺平。离子溅射金后，进行扫面电镜观察。结果如图6所示。
108.结果显示，本发明实施例长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7与对照组rtrx蛋白相比灿烂弧菌及大肠杆菌出现明显凝集效果且菌体表面呈粗糙粘稠状而枯草芽孢杆菌菌体表面则出现明显褶皱现象。

技术特征：

1.一种长牡蛎含dm9结构域的重组蛋白rcgdm9cp-7，其特征在于：长牡蛎含dm9结构域的重组蛋白rcgdm9cp-7其氨基酸序列如seq id no.1所示；或，与其同源性大于等于90％的氨基酸序列。2.一种如权利要求1所述长牡蛎含dm9结构域重组蛋白rcgdm9cp-7的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.用引物p1和p2对长牡蛎cgdm9cp-7基因编码区片段进行pcr扩增，b.将pcr扩增产物与pet30a载体经bamh i和xhol i酶切后通过t4连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；c.将所述重组子转入大肠杆菌transetta(de3)表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，即得到具有序列表seq id no.1中氨基酸序列的重组蛋白rcgdm9cp-7。3.如权利要求1所述长牡蛎含dm9结构域的重组蛋白rcgdm9cp-7的制备方法，其特征在于：所述引物p1为cgcggatccatgaaaaagaaggtaaaaat；引物p2为acgcgtcgacctacttgatcttacagagga。4.一种如权利要求1所述长牡蛎含dm9结构域的重组蛋白rcgdm9cp-7的应用，其特征在于：所述重组蛋白rcgdm9cp-7在识别干扰素诱导剂(poly(i:c))中的应用。5.一种如权利要求1所述长牡蛎含dm9结构域的重组蛋白rcgdm9cp-7的应用，其特征在于：所述重组蛋白rcgdm9cp-7在制备灿烂弧菌、大肠杆菌、金黄葡萄球菌或枯草芽孢杆菌的凝集制剂进而抑制菌株生长中的应用。

技术总结

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-7及其应用。长牡蛎含DM9结构域的重组蛋白rCgDM9CP-7其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；与其同源性大于等于90％的氨基酸序列。该重组蛋白在制备灿烂弧菌、大肠杆菌、金黄葡萄球菌或枯草芽孢杆菌的凝集制剂进而抑制菌株生长中的应用。孢杆菌的凝集制剂进而抑制菌株生长中的应用。孢杆菌的凝集制剂进而抑制菌株生长中的应用。