一种应用视网膜原位基因编辑制作非人灵长类动物先天性黑矇模型的方法

1.本发明属于分子生物技术领域，尤其是涉及一种应用视网膜原位基因编辑制作非人灵长类动物先天性黑矇模型的方法。

背景技术：

2.先天性黑矇(lca)是一组临床及遗传异质性的先天性及早发性疾病。主要的临床表现为严重的先天性、早期视觉丧失，眼球震颤，非变性瞳孔和明显减少或者缺失的全视野视网膜电图，是导致儿童先天性盲的主要疾病。
3.目前我国针对该遗传病仍无有效方法。最新的研究结果应用腺相关病毒(aav)介导的基因替代疗法，相继在小动物和大动物的疾病模型验证效果，已取得了显著效果。然而很多基因临床试验的有效性验证失败，即在小鼠动物模型上有效，但用于患者却无效。主要原因可能是啮齿动物与人的物种差异，解剖结构及细胞种类的差别，人的实施步骤比小鼠更为复杂，成为影响其效果的原因。
4.crispr/cas9基因编辑技术使针对胚胎的基因修饰、敲除成为可能，然而非人灵长类动物由于其一胎生育特点和生长时期长，基因编辑胚胎构建转基因非人灵长类动物模型造价成本和时间成本极高，目前尚未有成功构建的案例。

技术实现要素：

5.本发明针对现有技术的不足提供了一种应用视网膜原位基因编辑制作非人灵长类动物先天性黑矇模型的方法。通过基因编辑技术，敲除非人灵长类动物先天性黑矇的相关致病基因，通过阻断视循环通路，获得与人先天性黑矇发病机制及病程相似的疾病动物模型。
6.为此，本发明第一方面提供了一种应用视网膜原位基因编辑制作非人灵长类动物先天性黑矇模型的方法，包括：敲除非人灵长类动物先天性黑矇的相关致病基因，模拟先天性黑矇致病基因突变导致的视杆细胞凋亡。
7.在本发明的一些实施方式中，所述先天性黑矇致病基因包括rdh12基因、lrat基因、rpe65基因、gucy2d基因或aipl1基因；优选为rdh12基因。
8.根据本发明，使用sgrna敲除非人灵长类动物先天性黑矇的相关致病基因。
9.根据本发明，所述sgrna序列如seq id no:1-2和/或seq id no:3-4所示。
10.在本发明的一些实施方式中，所述方法包括以下具体步骤：
11.s1：构建sgrna，sgrna特异靶向非人灵长类动物先天性黑矇的相关致病基因；
12.s2：对非人灵长类动物注射sgrna，敲除非人灵长类动物先天性黑矇的相关致病基因，获得非人灵长类动物先天性黑矇模型。
13.在本发明的一些实施方式中，所述步骤s2中对非人灵长类动物进行视网膜下腔注射或玻璃体腔注射，优选为视网膜下腔注射。
14.在本发明的一些实施方式中，所述注射包括单次注射或间隔多次注射。
15.在本发明的一些实施方式中，所述间隔多次注射的间隔时间包括6个月。
16.在本发明的一些实施方式中，所述步骤s1包括以下具体步骤：针对rdh12基因的第三外显子，设计sgrna1序列和/或sgrna2序列，采用sacas9与sgrna1构建在同一个质粒中得到sacas9/sgrna1质粒，和/或采用sacas9与sgrna2构建在同一个质粒中得到sacas9/sgrna2质粒。
17.根据本发明，所述sgrna1序列如seq id no:1-2所示，所述sgrna2序列如seq id no:3-4所示。
18.根据本发明，所述sgrna1包括sgrna1-1和sgrna1-2；所述sgrna1-1序列如seq id no:1所示，所述sgrna1-2序列如seq id no:2所示。
19.根据本发明，所述sgrna2包括sgrna2-1和sgrna2-2；所述sgrna2-1序列如seq id no:3所示，所述sgrna2-2序列如seq id no:4所示。
20.根据本发明，所述步骤s1包括以下具体步骤：应用addgene质粒px602，将sgrna1-1和sgrna1-2分别构建在启动子u6之后，sacas9构建在ef1a启动子之后，构建成sacas9/sgrna1质粒；和/或，应用addgene质粒px602，将sgrna2-1和sgrna2-2分别构建在启动子u6之后，sacas9构建在ef1a启动子之后，构建成sacas9/sgrna2质粒。
21.根据本发明，所述sacas9/sgrna1质粒的全载体序列为seq id no:5；和/或，所述sacas9/sgrna2质粒的全载体序列为seq id no:6。
22.本发明第二方面提供了一种应用视网膜原位基因编辑制作非人灵长类动物先天性黑矇模型的方法制作的非人灵长类动物先天性黑矇模型。
23.本发明第三方面提供了一种特异靶向rdh12基因的sgrna，所述sgrna序列如seq id no:1-2和/或seq id no:3-4所示。
24.本发明第四方面提供了一种sgrna载体，包括如seq id no:1-2和/或seq id no:3-4所示的sgrna序列。
25.在本发明的一些实施方式中，所述sgrna载体由sgrna序列和crispr酶序列构建在空的病毒表达载体中得到。
26.在本发明的一些实施方式中，所述病毒表达载体包括腺相关病毒、腺病毒或慢病毒，优选为衍生自aav8的腺相关病毒。
27.在本发明的一些实施方式中，所述crispr酶包括cas9，优选为sacas9。
28.本发明第五方面提供了一种病毒，通过将第三方面所述sgrna或第四方面所述sgrna载体于宿主细胞中表达与包装得到。
29.在本发明的一些实施方式中，所述宿主细胞包括人源hek293t细胞。
30.本发明第六方面提供了一种试剂盒，包括第三方面所述sgrna或第四方面所述sgrna载体或第五方面所述病毒。
31.本发明第七方面提供了一种第三方面所述sgrna或第四方面所述sgrna载体或第五方面所述病毒或第六方面所述试剂盒在制作非人灵长类动物先天性黑矇模型中的应用。
32.在本发明的一些实施方式中，所述非人灵长类动物包括猕猴科，优选为猕猴种，更优选为恒河猴。
33.技术效果：
34.本发明应用crispr/cas9基因编辑技术在视网膜原位敲除非人灵长类动物先天性黑矇的相关致病基因，能够模拟由于先天性黑矇的相关致病基因突变导致的视黄醛视黄酮循环通路损伤导致的视杆细胞凋亡，从而获得与人先天性黑矇发病机制及病程相似的疾病动物模型。
附图说明
35.图1为质粒构建示意图；
36.图2为注射器连接示意图；
37.图3为视网膜下注射示意图；
38.图4为本发明实施例2提供的注射后一周裂隙灯检查前节结果图。图中：od-模型组，os-对照组；
39.图5为本发明实施例2提供的注射后一周眼底相检测、自发荧光检测和oct检查结果图。图中：od-模型组，os-对照组；a-眼底相检测结果，b-自发荧光检测结果，c-oct检查结果；
40.图6为本发明实施例3提供的注射后1个月眼底相检测、自发荧光检测和oct检查结果图。图中：od-模型组，os-对照组；
41.图7为本发明实施例3提供的注射后3个月眼底相检测、自发荧光检测和oct检查结果图。图中：od-模型组，os-对照组；
42.图8为本发明实施例3提供的注射后6个月眼底相检测、自发荧光检测和oct检查结果图。图中：od-模型组，os-对照组；
43.图9为本发明实施例3提供的注射后9个月眼底相检测、自发荧光检测和oct检查结果图。图中：od-模型组，os-对照组；
44.图10为本发明实施例3提供的注射后14个月眼底相检测、自发荧光检测和oct检查结果图。图中：od-模型组，os-对照组；
45.图11为本发明实施例4提供的注射后1周、3个月、6个月、9个月和14个月眼底相检测结果图；
46.图12为本发明实施例4提供的注射前、注射后3个月、6个月、9个月和14个月oct检查结果图；
47.图13为本发明实施例5提供的注射前erg暗反应检测结果图；
48.图14为本发明实施例5提供的注射后1个月erg暗反应检测结果图；
49.图15为本发明实施例5提供的注射后6个月erg暗反应检测结果图；
50.图16为本发明实施例5提供的注射后9个月erg暗反应检测结果图；
51.图17为本发明实施例5提供的注射后14个月erg暗反应检测结果图；
52.图18为本发明实施例5提供的注射前、注射后1个月、3个月、6个月和9个月erg振幅结果图。
具体实施方式
53.为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无
特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
54.以下实施例所采用的实验动物、器材和药品如下：
55.1.实验动物
56.实验用恒河猴，来源于苏州昭衍新药研究中心，iacuc伦理号：acu20-2568，2-3岁，经筛选，生理指标正常，眼科系统检查正常。单笼饲养，动物房设定温度为18-26℃，湿度为40-70％，光照12小时明暗交替。
57.2.主要药品
58.(1)麻醉药品：50mg/ml舒泰50(virbac)，异氟烷(一品制药)，异丙酚(莱艾特)。
59.(2)消毒药品：0.1％碘伏。
60.(3)其他药品：美多丽复方托吡卡胺滴眼液(santen)，生理盐水，妥布霉素地塞米松眼膏(alcon)。
61.3.主要器材
62.(1)手术器械:medone视网膜下注射针头(23g)，爱尔康constellation vision23g波切包，眼科手术器械，1ml注射器，连接管，可吸收缝线。
63.(2)主要仪器:手术显微镜(徕卡)，constellation vision波切机(爱尔康)，数码裂隙灯显微镜(苏州六六)，视觉电生理(罗兰)，oct(海德堡)，眼底照相机(佳能)。
64.实施例1非人灵长类动物先天性黑矇模型的构建
65.1.1 sgrna设计
66.针对rdh12基因的第三外显子设计多个sgrna，各sgrna序列如下：
67.sgrna 1-1序列(seq id no:1)：acaaatgtgcagcttcctgg
68.sgrna 1-2序列(seq id no:2)：gatggctttgaaacccacct
69.sgrna 2-1序列(seq id no:3)：caatttccgcaccagcacct
70.sgrna 2-2序列(seq id no:4)：cacctttagccgctccagga
71.1.2质粒构建
72.应用addgene质粒px602，通过将sgrna 1-1和sgrna 1-2分别构建在启动子u6之后，sacas9构建在ef1a启动子之后，将sacas9和两个序列sgrna1-1、sgrna1-2构建成sacas9/sgrna1质粒，其全载体序列为seq id no:5；以同样的方式将sacas9和两个序列sgrna2-1、sgrna2-2构建成sacas9/sgrna2质粒，其全载体序列为seq id no:6。
73.应用addgene质粒px602，通过将gfp构建在ef1a启动子之后，以构建成paav-gfp质粒，其全载体序列为seq id no:7。其为表达绿荧光蛋白(gfp)的aav载体，可以使被aav感染的细胞发出绿荧光，达到可视化的目的。具体如图1所示。
74.1.3病毒制备
75.将sacas9/sgrna1质粒、sacas9/sgrna2质粒和paav-gfp质粒分别与辅助质粒ad helper vector和paav-rep/cap vector共转染进入hek293t细胞，并培养转染后的hek293t细胞。分别收获培养基上清与细胞沉淀，先将培养基上清进行0.45um滤膜过滤，再通过peg8000沉淀培养基上清中的病毒，用碘克沙醇密度梯度超速离心的方式纯化病毒，用超滤管进行浓缩。应用qpcr的方法来检测病毒的滴度，以最终获得滴度为4.63
×
10
13
个病毒基因组/ml的aav8-efs-sacas9-rdh12-sgrna1病毒、aav8-efs-sacas9-rdh12-sgrna2病毒和aav8-efs-gfp病毒。
76.1.4视网膜下注射
77.依据实验猴体重分别肌肉注射舒泰50，吸入异氟烷。检查四肢反应，确认麻醉状态。将实验猴移入手术间，置于手术台上，摆好位置，过静脉点滴异丙酚(10-12mg
·
kg-1
·
h-1
)进行持续麻醉，每只眼滴1滴美多丽复方托吡卡胺滴眼液，无菌手术单铺单，暴露眼周。碘伏棉签以眼睑为中心画圈消毒，重复三次；0.1％碘伏冲洗结膜囊，30秒后生理盐水冲洗；用结膜剪剪开眼贴，暴露眼球，开睑器撑开眼球，暴露巩膜；结膜剪剪开结膜囊，暴露巩膜，在鼻下及颞下分别插入穿刺针，置入光纤，将眼底透镜置于角膜上；采用1ml注射器吸取药品，将23g视网膜下注射针头、连接管与注射器连接(如图2所示)；将23g视网膜下注射针头通过穿刺针置于玻璃体腔中，针头轻触视网膜，缓慢注射200μl药品，观察注射泡形成。注射完成，移除针头和光纤，采用可吸收缝线缝合巩膜穿刺孔和结膜；移除开睑器，挤入妥布霉素地塞米松眼膏。另一只眼重复以上操作。操作完成后将实验猴移入复苏笼等待复苏，待实验猴复苏后转移至饲养笼中饲养。
78.将aav8-efs-sacas9-rdh12-sgrna1病毒、aav8-efs-sacas9-rdh12-sgr na2病毒和aav8-efs-gfp病毒混合注射于实验猴的左眼作为模型组；aav8-efs-sacas9-rdh12-sgrna1+aav8-efs-sacas9-rdh12-sgrna2病毒和aav8-ef s-gfp病毒按体积比4:1的比例混合，浓度为7x10
11
gc。将aav8-efs-gfp病毒注射于实验猴的右眼作为对照组，浓度为7x10
11
gc。后续进行检测。如图3所示
79.实施例2表达检测
80.于注射后一周进行裂隙灯检查前节、眼底相检测、自发荧光检测和oct检查；结果如图4、图5所示。od为右眼对照组，os为左眼模型组。
81.由图4可见，注射后一周裂隙灯检查前节，角膜清，kp(-)，房闪(-)，晶体透明，说明视网膜下注射未引起手术相关并发症。由图5中a可见，注射后一周眼底相检测结果显示视网膜复位，未见眼底出血，感染等并发症。由图5中b可见，注射后一周自发荧光检测结果显示右眼对照组有高荧光，说明aav8-efs-gfp病毒已经在注射区域表达，左眼模型组可见少量高荧光点。由图5中c可见，注射后一周oct结果显示注射区域视网膜复位。
82.试验例3临床表型检测
83.分别于注射后1个月、3个月、6个月、9个月和14个月进行眼底相检测、自发荧光检测和oct检查；结果如图6-10所示。
84.由图6-10可见，注射后1个月，自发荧光检测结果显示对照组与模型组的注射区域均具有高荧光，模型组于注射后3个月高荧光消失，而对照组一直具有高荧光区，说明本发明制备的病毒能够将表达质粒转染进入组织并且持续表达。注射后1个月，oct检查结果显示对照组与模型组的视网膜结构均出现不同程度的改变，如椭圆体带模糊，3-14个月结果显示，对照组注射区域的视网膜结构恢复正常或保持一致，说明对照组的视网膜结构变化可能由于视网膜下注射aav产生的一次性局灶性改变；而模型组的眼椭圆体带于注射后9个月出现明显的细胞排列紊乱，注射后14个月视网膜外层明显变薄，椭圆体带消失，而对照组相应区域结构正常，说明模型组的视网膜变薄及细胞凋亡由基因编辑引起。
85.试验例4模型组临床表型检测
86.分别于注射后1周、3个月、6个月、9个月和14个月对模型组进行眼底相检测，结果如图11所示。分别于注射前、注射后3个月、6个月、9个月和14个月对模型组进行oct检查，结
果如图12所示。
87.由图11可见，眼底相检测结果显示注射后1周视网膜复位，注射区域无素改变；注射后3个月注射区域出现青灰素沉着；注射后6个月、9个月、14个月，注射区域周围素沉着依然存在，且随注射时间增加而素颜变深。由图12可见，oct检查结果显示注射后9个月眼椭圆体带出现细胞排列紊乱，注射后14个月网膜厚度明显变薄。说明模型组出现了类似先天性黑矇的临床表现。
88.试验例5 erg暗反应检测
89.主要试剂：
90.分别于注射前、注射后1个月、3个月、6个月、9个月和14个月进行erg暗反应检测和振幅记录；结果如图13-18所示。
91.由图13-18可见，注射后6个月，模型组出现暗反应振幅降低，注射后9个月和注射后14个月，模型组的暗反应1.0，3.0，10.0均出现波形振幅较对照组降低，说明模型组的视杆细胞功能损伤。
92.综上所述，本发明采用aav8-efs-sacas9-rdh12-sgrna1病毒和aav8-efs-sacas9-rdh12-sgrna2病毒通过视网膜下腔注射于恒河猴的视网膜下腔，恒河猴的视网膜出现视网膜素变动，椭圆体带模糊、消失、细胞排列紊乱，视网膜厚度变薄，erg暗反应波形振幅降低等类似先天性黑矇的临床表现。说明本发明应用视网膜原位基因剪切方法成功构建了非人灵长类动物先天性黑矇模型，模拟了与人相同的视网膜细胞损伤及凋亡造成的视杆细胞功能障碍。
93.应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

技术特征：

1.一种应用视网膜原位基因编辑制作非人灵长类动物先天性黑矇模型的方法，其特征在于，包括：敲除非人灵长类动物先天性黑矇的相关致病基因，模拟先天性黑矇致病基因突变导致的视杆细胞凋亡。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述先天性黑矇的相关致病基因包括rdh12基因、lrat基因、rpe65基因、gucy2d基因或aipl1基因；优选为rdh12基因。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用sgrna敲除非人灵长类动物先天性黑矇的相关致病基因；优选地，所述sgrna序列如seq id no:1-2和/或seq id no:3-4所示。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：s1：构建sgrna，sgrna特异靶向非人灵长类动物先天性黑矇的相关致病基因；s2：对非人灵长类动物注射sgrna，敲除非人灵长类动物先天性黑矇的相关致病基因，获得非人灵长类动物先天性黑矇模型；优选地，所述步骤s2中对非人灵长类动物进行视网膜下腔注射或玻璃体腔注射，优选为视网膜下腔注射。5.一种如权利要求1-4中任意一项所述的方法制作的非人灵长类动物先天性黑矇模型。6.一种特异靶向rdh12基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna序列如seq id no:1-2和/或seq id no:3-4所示。7.一种sgrna载体，其特征在于，包括如seq id no:1-2和/或seq id no:3-4所示的sgrna序列；优选地，所述sgrna载体由sgrna序列和crispr酶序列构建在空的病毒表达载体中得到；更优选地，所述病毒表达载体包括腺相关病毒、腺病毒或慢病毒，优选为衍生自aav8的腺相关病毒；和/或，所述crispr酶包括cas9，优选为sacas9。8.一种病毒，其特征在于，通过将权利要求6所述的sgrna或权利要求7所述的sgrna载体于宿主细胞中表达与包装得到；优选地，所述宿主细胞包括人源hek293t细胞。9.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述的sgrna或权利要求7所述的sgrna载体或权利要求8所述的病毒。10.一种如权利要求6所述的sgrna或权利要求7所述的sgrna载体或权利要求8所述的病毒或权利要求9所述的试剂盒在制作非人灵长类动物先天性黑矇模型中的应用；优选地，所述非人灵长类动物包括猕猴科，优选为猕猴种，更优选为恒河猴。

技术总结

本发明涉及一种应用视网膜原位基因编辑制作非人灵长类动物先天性黑矇模型的方法，包括：敲除非人灵长类动物先天性黑矇的相关致病基因，模拟先天性黑矇致病基因突变导致的视杆细胞凋亡。本发明还涉及一种非人灵长类动物先天性黑矇模型，一种特异靶向RDH12基因的sgRNA，一种sgRNA载体，一种病毒，一种试剂盒及其应用。其应用。其应用。