一种体外获得后脑底板细胞的方法、成套培养基及应用

1.本发明涉及生物医药领域，具体是一种体外获得后脑底板细胞的方法、成套培养基及应用。

背景技术：

2.据文献(katohм,katoh m.wnt signaling pathway and stem cell signal ing network.clincancer res.2007jul 15；13(14):4042-5.doi:10.1158/1078-0432.ccr-06-2316.pmid:17634527.)和(hattaк,kimmelсв,ho rk,walkerс.the cyclops mutation blocks specificationof the floor plate of the zebrafish central nervous system.nature.1991mar28；350(6316):339-41.doi:10.1038/350339a0.pmid:2008211.)记载，人类底板fp细胞产生于背侧外胚层，靠近脊索(notochord)的位置，成熟后在人脑中的背腹侧分区处于最腹侧区域，前后轴分布贯穿全脑，从脊髓穿过中脑，延伸至端脑正对前端神经外皮层。fp作为中脑多巴胺神经元分化的前体细胞，体外分化fp细胞也被作为进一步分化多巴胺能神经元，从而在形成正确的神经环路中发挥作用。文献(fasanoсa,chambers sm,lee g,tomishimamj,studer l.efficient derivation offunctional floor plate tissue from human embryonic stem cells.cell stem cell.2010apr 2；6(4):336-47.doi:10.1016/j.stem.2010.03.001.pmid:20362538；pmcid:pmc4336800.)记载了，fp细胞的异常会导致多种脑部发育异常的疾病，包括前脑无裂畸形、小眼畸形、裂板综合征和戈林综合征等，因此体外建立高效得到fp细胞的技术手段，能为相关疾病提供手段。
3.文献(reubinoff be,pera mf,fong cy,trounson a,bongso a.embryonic stem cell linesfrom human blastocysts:somatic differentiation in vitro.nat biotechnol.2000apr；18(4):399-404.doi:10.1038/74447.erratum in:nat biotechnol 2000may；18(5):559.pmid:10748519.)记载，人胚胎干细胞系早在1998年就被从人的囊胚内细胞团中分离得到，其自我更新能力与多向分化的潜能使得其成为体外研究人类疾病、发育等的基础，通过基因编辑手段在人胚胎干细胞水平进行编辑，也为调控基因表达优化功能性细胞的体外分化策略，以及进一步的疾病等方面提供思路。
4.文献(fasanoсa,chambers sm,lee g,tomishima mj,studer l.efficient derivation offunctional floor plate tissue from human embryonic stem cells.cell stem cell.2010apr2；6(4):336-47.doi:10.1016/j.stem.2010.03.001.pmid:20362538；pmcid:pmc4336800.)提供了经典双向抑制smad(dual smad)信号通路建立从人胚胎干细胞系向神经前体细胞分化的方法，通过加入noggin和sb431542，抑制smad信号通路将人胚胎干细胞向神经诱导，并在分化的第一天加入shh,在第11天能得到65％foxa2阳性的细胞。文献(dodd j,jessell tm,placzek m.the when and where of floor plate induction.science.1998nov27；282(5394):1654-7.doi:10.1126/science.282.5394.1654.pmid:9867664.)记载fp细胞特异性表达翼螺旋
转录因子foxa2，fp细胞特异性分子标志物为foxa2。
5.现已报道的利用人胚胎干细胞分化人类底板细胞的各种方法中的不足主要有：经典分化手段需要在分化第一天添加高浓度的蛋白shh,蛋白shh存在价格昂贵且因生产批次与保存手段导致的浓度不稳定的缺点，这会导致分化得到fp效率的不稳定。

技术实现要素：

6.本发明提供一种分化效率高、且分化时间快的体外获得后脑底板细胞的方法、成套培养基及应用，且分化的后脑底板细胞可功能性分泌shh蛋白。
7.为达此目的，本发明提供如下的技术方案：
8.本发明的第一个方面，提供了一种体外获得后脑底板细胞的方法，包括以下步骤：
9.s1、单层贴壁培养未分化的胚胎干细胞；
10.s2、在分化第0天在nim培养基中加入tgfbeta/wnt/nodal信号通路抑制剂、bmp信号通路拮抗剂；
11.s3、在分化第1天，更换培养基，在nim培养基中加入tgfbeta/wnt/nodal信号通路抑制剂、bmp信号通路拮抗剂、hedgehog信号通路smoothened蛋白激动剂、homeobox基因激动剂；
12.s4、在分化第5天，更换培养基，在nim培养基中加入bmp信号通路拮抗剂、hedgehog信号通路smoothened蛋白激动剂、homeobox基因激动剂；
13.s5、在分化第7天，更换培养基，在nim培养基中加入bmp信号通路拮抗剂、homeobox基因激动剂；
14.s6、继续培养，直至分化成后脑底板细胞。
15.优选的，所述胚胎干细胞为哺乳动物胚胎干细胞，更进一步优选的，所述胚胎干细胞为人胚胎干细胞。
16.在本发明中，细胞分化过程每日更换次培养基，分化后期随细胞量的增加每日增加使用的培养基量。步骤s1中，胚胎干细胞培养基为e8培养基。
17.优选的，tgfbeta/wnt/nodal信号通路抑制剂包括sb431542。
18.优选的，sb431542在培养基中的浓度为8-12μμ。进一步优选的，sb431542在培养基中的浓度为10μμ。
19.在本发明中，sb431542为tgfbeta/wnt/nodal信号通路抑制剂，用于体系中提高诱导人胚胎干细胞向神经分化的效率。
20.优选的，bmp信号通路拮抗剂包括dmh1。
21.优选的，dmh1在培养基中的浓度为1-2μμ。进一步优选的，dmh1在培养基中的浓度为1.5-2μμ；更进一步优选的，dmh1在培养基中的浓度为1.5μμ或2μμ。
22.在本发明中，dmh1是选择性bmp receptor的抑制剂，用于体系中提高诱导人胚胎干细胞向神经分化的效率。
23.优选的，hedgehog信号通路smoothened蛋白激动剂包括purmorphamine。
24.优选的，purmorphamine在培养基中的浓度为1.5-2.5μμ。进一步优选的，purmorphamine在培养基中的浓度为2μμ
25.在本发明中，purmorphamine为smoothened受体激动剂，激活shh信号通路，用于提
高人胚胎干细胞向腹侧分化的效率。
26.优选的，homeobox基因激动剂包括retinoic acid。
27.优选的，retinoic acid在培养基中的浓度为1.5-2.5μμ。进一步优选的，retinoic acid在培养基中的浓度为2μμ
28.在本发明中，retinoic acid，维甲酸，是retinoic acid receptor和retinoid x receptor的配体，用于诱导人胚胎干细胞向后侧分化。
29.优选的，步骤s6中，培养时间为10-14天。进一步优选的，培养时间为11-12天。
30.优选的，步骤s6得到的后脑底板细胞能够分泌shh蛋白。
31.shh蛋白为分泌性糖蛋白因子，在胚胎和神经系统发生、发育和分化中可调控神经细胞的增殖、分化和轴突的形成。
32.优选的，培养11天后，foxa2阳性细胞为94.6
±
12.5％。
33.本发明的第二个方面，提供了一种在体外将胚胎干细胞诱导为后脑底板细胞的成套培养基，包括第一培养基、第二培养基、第三培养基和第四培养基。
34.所述第一培养基包括nim培养基、tgfbeta/wnt/nodal信号通路抑制剂、bmp信号通路拮抗剂；
35.所述第二培养基包括nim培养基、tgfbeta/wnt/nodal信号通路抑制剂、bmp信号通路拮抗剂、hedgehog信号通路smoothened蛋白激动剂、homeobox基因激动剂；
36.所述第三培养基包括nim培养基、bmp信号通路拮抗剂、hedgehog信号通路smoothened蛋白激动剂、homeobox基因激动剂；
37.所述第四培养基包括nim培养基、bmp信号通路拮抗剂、homeobox基因激动剂。
38.优选的，tgfbeta/wnt/nodal信号通路抑制剂包括sb431542，sb431542在培养基中的浓度为8-12μμ。
39.优选的，bmp信号通路拮抗剂包括dmh1，dmh1在培养基中的浓度为1-2μμ。
40.优选的，hedgehog(hh)信号通路smoothened蛋白激动剂包括purmorphamine，purmorphamine在培养基中的浓度为1.5-2.5μμ。
41.优选的，homeobox基因激动剂包括retinoic acid，retinoic acid在培养基中的浓度为1.5-2.5μμ。
42.本发明的第三个方面，提供了本发明所述的方法制备的后脑底板细胞在体外研究神经环路构成、fp细胞异常导致的多种脑部发育异常疾病的以及体外分化脑区细胞方法的拓展都有应用。
43.与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：本发明提供的一种体外获得后脑底板细胞的方法其应用，利用胚胎干细胞体系诱导分化11天就能够得到功能性分泌shh的后脑底板细胞，分化稳定性和效率都得到了提高。本发明能够快速得到分泌shh的功能性floor plate细胞，分化得到的底板细胞在体外研究神经环路构成、fp细胞异常导致的多种脑部发育异常疾病的以及体外分化脑区细胞方法的拓展都有应用。
附图说明
44.为更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的实施例所需使用的附图作一简单介绍。
45.显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明中的部分实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，但这些其他的附图同样属于本发明实施例所需使用的附图之内。
46.图1为本发明实施例1的在hesc分化为fp过程培养体系示意图；
47.图2a为本发明实施例3的一个分化得到的细胞为foxa2+的fp细胞的免疫荧光图；
48.图2b为本发明实施例3的一个分化得到的细胞为foxa2+的fp细胞的免疫荧光图；
49.图2c为本发明实施例3的一个分化得到的细胞为foxa2+的fp细胞的免疫荧光图；
50.图2d为本发明实施例3的foxa2+的fp细胞的计数结果；
51.图3a为本发明实施例3的后脑标志物hoxb1的免疫荧光图；
52.图3b为本发明实施例3的后脑标志物hoxb4的免疫荧光图；
53.图3c为本发明实施例3的前中脑标志物otx2的免疫荧光图；
54.图4a为本发明实施例4的分化至11天细胞培养上清液培养前脑神经前体细胞示意图。
55.图4b为本发明实施例4的nkx6.1的mrna表达水平；
56.图4c为本发明实施例4的gli2的mrna表达水平。
具体实施方式
57.为使本发明实施例的目的、技术方案、有益效果及显著进步更加清楚，下面，将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
58.显然，所有描述的这些实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
59.需要理解的是：
60.术语“分化”是指，同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。细胞分化的本质是基因组在时间和空间上的选择性表达，通过不同基因表达的开启或关闭，最终产生标志性蛋白质。
61.术语“培养基”是指，供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。
62.术语“信号通路”是指，当细胞里要发生某种反应时，信号从细胞外到细胞内传递了一种信息，细胞要根据这种信息来做出反应的现象。信号通路是指能将细胞外的分子信号经细胞膜传入细胞内发挥效应的一系列酶促反应通路。这些细胞外的分子信号(称为配体，ligand)包括激素、生长因子、细胞因子、神经递质以及其它小分子化合物等。
63.术语“拮抗剂”是指，与受体只有较强的亲和力，而无内在活性的药物，故不产生效应，但能阻断激动药与受体结合，因而对抗或取消激动药的作用。
64.术语“激动剂”是指，能增强另一种分子活性、促进某种反应的药物、酶激动剂和激素一类的分子。
65.对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
66.还需要说明的是，以下的具体实施例可以相互结合，对于其中相同或相似的概念或过程可能在某些实施例中不再赘述。
67.下面，以具体的实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
68.实施例1人胚胎干细胞系h9的培养
69.人胚胎干细胞系h9(h9基于mta编号:wicell agreement no:21-w0349)在matrigel包被的孔板内培养，使用e8培养基培养，每日更换培养基，培养约7天至80％融合度，进行1:12传代扩增操作或是冻存保种操作。
70.传代及冻存均需要使用dpbs洗去多余培养基，再将消化液relesr添加至孔中，1分钟内吸去消化液，室温消化7分钟，添加适量e8中止消化同时拍打孔板，将细胞拍打脱落，得到约0.1cm2大小的细胞团块，1:12传代至新的孔板中，或是添加配制好的冻存液(e8:fbs:dms0＝7:2:1)收集细胞至冻存管，在冻存盒中转移至-80℃冰箱预降温处理24小时，后转移至液氮罐长期保存。
71.实施例2使用nim培养基培养h9细胞系得到功能性人类基底板细胞
72.2.1、分化细胞培养板的包被
73.细胞分化使用的细胞培养板或是圆形玻片，均须使用0.05mg/ml的poly-l-ornithine(ро)即多聚鸟氨酸预先包被过，同时在使用前再包被dmem/f12以1:50比例稀释过的laminin，并在37℃孵育1至2小时。
74.2.2、分化细胞准备
75.实施例1制备的h9细胞在matrigel包被的孔板中使用e8培养至细胞密度达到80％左右，relesr消化，按1:6传代细胞(传代步骤同实施例1)，至po-laminin包被的孔板中，使用nim培养基培养11天，nim培养基培养流程如图1所示，分化第0天在nim培养基中加入小分子化合物10μm sb431542,2μm dmh1；分化第1天加入2μm purmorphamine和2μm retinoic acid；分化第5天撤去sb431542；分化第7天撤去purmorphamine。
76.实施例3免疫荧光鉴定
77.实验样品：
78.实施例2中，分化第11天的细胞，用于检测fp特异性标志物foxa2的表达。
79.实施例2中，分化11天的细胞，用于检测后脑标志物hoxb1和hoxb4，前中脑标志物otx2的表达。
80.实验方法：
81.3.1、细胞样品处理
82.将待检测细胞传代至matrigel包被的圆形玻片上，过夜培养待细胞沉降并贴附至玻片表面，使用4％pfa固定细胞处理30分钟，而后dpbs洗去过量pfa,洗涤三次,每次5分钟。
83.3.2、封闭
84.按每片样品100μl的体积配制封闭液，血清(驴血清或羊血清，选择不同于一抗属源的血清):0.2％triton-dpbs＝1:9，玻片加入封闭液，室温封闭30分钟。
85.3.3、抗体孵育与封片
86.按每片样品100μl的体积分别配制一抗混合液与二抗混合液，一抗混合液为5％血清、不同稀释比例的一抗以及补至需要体积的0.2％triton-dpbs，一抗孵育条件为4℃过夜；孵育二抗前dpbs洗三次，每次5分钟，洗去多余一抗。二抗混合液为dapi、不同稀释比例
的抗一抗属源的且不同激发波长的二抗、5％血清以及补至需要体积的dpbs，二抗孵育时间为室温45分钟，dpbs洗三次，每次5分钟。将细胞一侧与载玻片上的封片剂贴合封片。封片剂风干后可进行荧光拍摄。
87.3.4、荧光拍摄
88.使用olympus倒置荧光显微镜进行荧光数据采集。
89.其中，实验样品分别使用一抗foxa2、0tx2、hoxb1和hoxb4进行孵育，使用一抗foxa2、0tx2、hoxb4的实验样品后续使用二抗cy3孵育，使用一抗hoxb4的实验样品采用二抗fitc孵育。
90.实验结果：
91.分化第11天检测foxa2和0tx2表达结果如图2a-d所示，其中a-c为3片分化得到的细胞为foxa2+的fp细胞的样品，统计foxa2计数结果如图2d所示，foxa2+的fp细胞占比为(94.6
±
12.5％)。
92.图3显示a-c为后脑标志物hoxb1，d-e为后脑标志物hoxb4，g-i为前脑标志物otx2不表达。
93.实施例4分泌shh的功能性验证
94.按照图4a所示的方法，将实施例2中的且采用实施例3验证了在第12天收集分化为fp细胞的条件培养基cm，培养神经前体细胞np，利用实时定量基因扩增荧光检测cm培养的细胞vnp腹侧基因nkx6.1和shh相关基因gli2的mrna表达水平，反映人类基底板细胞具有功能。
95.实验方法：rna样品收集：使用rna提取试剂盒提取合适细胞量中的rna样品。
96.基因组dna的去除与第一链cdna的反转录合成：使用takara试剂盒完成500ng每个样品的反转录，并使用rnase-free水稀释样品92倍使用。
97.实时定量pcr：反应体系为20μl，含9.2μl稀释过的cdna，0.8μl的10μm上下游引物混合液，10μl 2
×
itaq-sybr green super mix，实时定量pcr程序设置为：95℃热激活30s，而后39个循环进行：95℃5秒、60℃30秒，而后65℃5秒、95℃5分钟。每个样品设置三个技术重复。
98.数据处理：使用相对定量，以gapdh作为内参，使用2-δδct法进行数据处理，获得各个样本目标基因的相对表达量，并使用graphpad prism 7.0软件进行数据统计与作图。
99.实验结果：
100.如图4b和4c所示，与神经前体细胞np相比，cm培养的细胞即np+cm组，nkx6.1与gli2的mrna表达水平存在显著性差异，(****：p《0.0001)。
101.在上述说明书的描述过程中：
102.术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如
……
所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。
103.最后应说明的是：
104.以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；
105.尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。

技术特征：

1.一种体外获得后脑底板细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、单层贴壁培养未分化的胚胎干细胞；s2、在分化第0天在nim培养基中加入tgfbeta/wnt/nodal信号通路抑制剂、bmp信号通路拮抗剂；s3、在分化第1天，更换培养基，在nim培养基中加入tgfbeta/wnt/nodal信号通路抑制剂、bmp信号通路拮抗剂、hedgehog信号通路smoothened蛋白激动剂、homeobox基因激动剂；s4、在分化第5天，更换培养基，在nim培养基中加入bmp信号通路拮抗剂、hedgehog信号通路smoothened蛋白激动剂、homeobox基因激动剂；s5、在分化第7天，更换培养基，在nim培养基中加入bmp信号通路拮抗剂、homeobox基因激动剂；s6、继续培养，直至分化成后脑底板细胞。2.如权利要求1所述的一种体外获得后脑底板细胞的方法，其特征在于，tgfbeta/wnt/nodal信号通路抑制剂包括sb431542，sb431542在培养基中的浓度为8-12μμ。3.如权利要求1所述的一种体外获得后脑底板细胞的方法，其特征在于，bmp信号通路拮抗剂包括dmh1，dmh1在培养基中的浓度为1-2μμ。4.如权利要求1所述的一种体外获得后脑底板细胞的方法，其特征在于，hedgehog信号通路smoothened蛋白激动剂包括purmorphamine，purmorphamine在培养基中的浓度为1.5-2.5μμ。5.如权利要求1所述的一种体外获得后脑底板细胞的方法，其特征在于，homeobox基因激动剂包括retinoicacid，retinoicacid在培养基中的浓度为1.5-2.5μμ。6.如权利要求1所述的一种体外获得后脑底板细胞的方法，其特征在于，步骤s6中，培养时间为10-14天。7.如权利要求6所述的一种体外获得后脑底板细胞的方法，其特征在于，步骤s6得到的后脑底板细胞能够分泌shh，培养11天后，foxa2阳性细胞为94.6
±
12.5％。8.一种在体外将胚胎干细胞诱导为后脑底板细胞的成套培养基，其特征在于，包括第一培养基、第二培养基、第三培养基和第四培养基，所述第一培养基包括nim培养基、tgfbeta/wnt/nodal信号通路抑制剂、bmp信号通路拮抗剂；所述第二培养基包括nim培养基、tgfbeta/wnt/nodal信号通路抑制剂、bmp信号通路拮抗剂、hedgehog信号通路smoothened蛋白激动剂、homeobox基因激动剂；所述第三培养基包括nim培养基、bmp信号通路拮抗剂、hedgehog信号通路smoothened蛋白激动剂、homeobox基因激动剂；所述第四培养基包括nim培养基、bmp信号通路拮抗剂、homeobox基因激动剂。9.如权利要求1所述的一种在体外将胚胎干细胞诱导为后脑底板细胞的成套培养基，其特征在于，tgfbeta/wnt/nodal信号通路抑制剂包括sb431542，sb431542在培养基中的浓度为8-12μμ；bmp信号通路拮抗剂包括dmh1，dmh1在培养基中的浓度为1-2μμ；hedgehog(hh)信号通路smoothened蛋白激动剂包括purmorphamine，purmorphamine在培养基中的浓度为1.5-2.5μμ；homeobox基因激动剂包括retinoicacid，retinoicacid在培养基中的浓度为1.5-2.5μμ。
10.权利要求1-7任意一项所述的方法制备的后脑底板细胞在体外研究神经环路构成、fp细胞异常导致的多种脑部发育异常疾病的以及体外分化脑区细胞方法的拓展都有应用。

技术总结

本发明公开了一种体外获得后脑底板细胞的方法、成套培养基及应用，方法包括：S1、单层贴壁培养未分化的胚胎干细胞；S2、第0天在NIM培养基中加入TGFbeta/Wnt/Nodal信号通路抑制剂、BMP信号通路拮抗剂；S3、第1天，在NIM培养基中加入TGFbeta/Wnt/Nodal信号通路抑制剂、BMP信号通路拮抗剂、Hedgehog信号通路Smoothened蛋白激动剂、homeobox基因激动剂；S4、第5天，在NIM培养基中加入BMP信号通路拮抗剂、Hedgehog信号通路Smoothened蛋白激动剂、homeobox基因激动剂；S5、在分化第7天，在NIM培养基中加入BMP信号通路拮抗剂、homeobox基因激动剂；S6、继续培养，直至分化成后脑底板细胞；本发明提供一种分化效率高、且分化时间快的体外获得后脑底板细胞的方法、成套培养基及应用，且分化的后脑底板细胞可功能性分泌SHH蛋白。的后脑底板细胞可功能性分泌SHH蛋白。的后脑底板细胞可功能性分泌SHH蛋白。