一种丁酸梭菌的发酵方法与流程

1.本技术涉及一种丁酸梭菌的发酵方法，属于微生物发酵技术领域。

背景技术：

2.丁酸梭菌属于芽孢杆菌科，梭菌属，革兰氏阳性，有芽孢，孢子卵圆，偏心或次端生。丁酸梭菌是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，其直径为(0.6～1.2)
×
(3.0～7.0)μm，两端钝圆，中间部分轻度膨胀，细菌呈直杆状或稍有弯曲，单个或成对，短链，偶见有丝状菌体，周身鞭毛，能运动。革兰氏染初培养的菌为阳性，菌稍长可变为阴性。在琼脂平板上形成白或奶油的不规则圆形菌落，稍突，直径为1～3mm。不水解明胶，不消化血清蛋白，能够发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖等碳水化合物产酸，一个显著的特征是产生淀粉酶，水解淀粉但不水解纤维素。水解淀粉和糖类的最终代谢产物为丁酸、乙酸和乳酸，还发现有少量的丙酸、甲酸，硝酸盐还原实验均为阴性。丁酸梭菌dna的g+c含量的摩尔分数为27％～28％。
3.目前其作为新的饲料添加剂，丁酸梭菌在饲料中的应用对于替代饲料中抗生素产品的添加、降低动物细菌的耐药性和保障动物健康方面有着重要的意义。由于丁酸梭菌为严格厌氧菌，工业化生产对设备及工艺要求较高，但现有的发酵工艺受培养基配方和接种方法的影响存在菌种浓度低的问题，发酵效果一般，不利于工业化生产。

技术实现要素：

4.为了解决上述问题，提供了一种丁酸梭菌的发酵方法，该方法采用特定的种子罐和发酵罐的消配和接种培养方法，发酵效果好，制得的菌种浓度高，适于工业化推广生产。
5.根据本技术的一个方面，提供了一种丁酸梭菌的发酵方法，包括以下步骤：
6.s1、活化菌种：将丁酸梭菌活化，制备菌种摇瓶；
7.s2、种子罐的消配：打开种子罐冲洗罐壁，将水排出，再加水启动搅拌，将原料投入罐内完全溶解并定容，向罐内通蒸汽灭菌，灭菌结束后，先关蒸汽阀，通入氮气，降温至37
±
1℃时，关闭搅拌保温保压，等待接种；
8.s3、种子罐接种培养：
9.(1)一级种子罐接种培养：点燃酒精火圈，缓慢打开接种口，在火焰保护下将活化后的种子液接入一级种子罐，关闭接种口，通入氮气开启搅拌，保持温度37
±
1℃，罐压≥0.02mpa；
10.(2)二级种子罐接种培养：将一级种子罐的种子液通过移种管道转移到二级种子罐中，通入氮气，开启搅拌，保持温度37
±
1℃，罐压≥0.02mpa；
11.s4、发酵罐的消配：打开发酵罐冲洗罐壁，将水排出，将酶解好的玉米粉和豆粕粉打入发酵罐内，加水搅拌，将其它原料倒入罐内，待培养基完全溶解后定容，向罐内通蒸汽灭菌，灭菌结束后，先关进蒸汽阀，通入无菌空气，降温至37
±
1℃时，关闭搅拌保温保压，等待接种；
12.s5、发酵罐接种培养：将二级种子液通过移种管道转移到发酵罐中，关闭排气阀，开启搅拌，保持温度37.5
±
0.5℃，罐压≥0.02mpa。
13.优选地，s1活化菌种的步骤为将保藏丁酸梭菌菌液的甘油管取出，置于37℃水浴中完全融化，吸取1～2滴菌液，滴入rcm固体培养基平板边缘，以接种环进行划线分离，并将平板置于37℃培养箱中厌氧培养。挑选平板上长势良好的单菌落，用接种环接种于rcm试管斜面，于37℃培养箱中厌氧培养24h，保存于4℃冰箱。挑取试管斜面1环接种于摇瓶培养基，并于37℃培养箱中厌氧培养8～12h。
14.可选地，s2种子罐的消配包括一级种子罐的消配和二级种子罐的消配，消配方法相同；
15.消配方法：打开种子罐冲洗罐壁，每次冲洗2min，重复清洗2～3次，提高罐压至0.1mpa，将水排出，加水至罐内第一搅拌叶位置，然后启动搅拌，将原料投入罐内，完全溶解并定容，盖好罐盖，通入蒸汽，提高温度至120℃并维持温度121
±
1℃，压力在0.1～0.12mpa，时间30min，灭菌结束时，先关进蒸汽阀，通入氮气，控制罐压≥0.05mpa，打开冷却循环水阀门，降温至37
±
1℃时，关闭搅拌保温保压。
16.可选地，一级种子罐接种培养：当一级种子罐温度降到37
±
1℃时准备接种，打开排气阀将罐压降到0.02mpa，点燃酒精火圈，缓慢打开接种口，在火焰保护下迅速将活化后的种子液接入一级种子罐，关闭接种口，打开氮气进气阀门，调整罐压≥0.02mpa，开启搅拌，保持温度37
±
1℃，罐压≥0.02mpa；
17.接种量为0.2％～4％，ph值为5.5～6.5，搅拌转速为30～150rpm，培养时间为4～10h。
18.可选地，二级种子罐接种培养中接种量为3％～12％，ph值为5.5～6.5，搅拌转速为60～150rpm，培养时间为6～12h；
19.发酵罐接种培养中接种量为5％～12％，ph值为5.5～6.0，搅拌转速为80～150rpm，培养时间为16～24h。
20.可选地，发酵罐的消配：打开发酵罐冲洗罐壁，每次冲洗2min，重复清洗2～3次，提高罐压至0.1mpa，将水排出，将酶解好的玉米粉和豆粕粉打入发酵罐内，加水量为总罐体容积的70％，启动搅拌，将其它原料倒入罐内，待培养基完全溶解后定容，并调ph值，盖好罐盖，通入蒸汽，提高温度至120℃并维持温度121
±
1℃，压力在0.1～0.12mpa之间，时间30min，灭菌结束后，先关蒸汽阀，通入无菌空气，控制罐压≥0.05mpa，打开冷却循环水阀门，开始降温，待温度降至37
±
1℃时，关闭搅拌保温保压0.02～0.06mpa，等待接种。
21.可选地，一级种子罐的培养基包括以下成分：蛋白胨10.0g/l、牛肉粉10.0g/l、酵母粉3.0g/l、葡萄糖5.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、氯化钠5.0g/l、醋酸钠3.0g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，ph值为6.8
±
0.1。
22.可选地，二级种子罐的培养基包括以下成分：蛋白胨10.0g/l、牛肉粉10.0g/l、酵母粉3.0g/l、葡萄糖5.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、氯化钠5.0g/l、醋酸钠3.0g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，ph值为6.8
±
0.1。
23.可选地，发酵罐的培养基包括以下成分：玉米粉30.0g/l、豆粕粉25.0g/l、葡萄糖5.0g/l、氯化钠5.0g/l、醋酸钠3.0g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，ph值为6.8
±
0.1。
24.可选地，步骤s3和s5中移种前需要对移种管道进行灭菌，灭菌方法为在移种管道
一端通入蒸汽，并将管道两端的小排汽打开，保证管道中压力0.1mpa左右，灭菌时间30min～60min。
25.可选地，还包括发酵原料的预处理：将玉米粉和豆粕粉同时投入拌料罐，按20％的浓度加水拌料，搅拌均匀后调整ph值至6.8～7.2，升温至42～48℃，加入中性蛋白酶300～1500u/g，酶解30～90min，调ph值至5.5～6.5，再加入中温淀粉酶20～120u/g，升温至55～65℃，酶解20～60min。
26.具体地，在整个发酵过程中，采用碱液如氢氧化钠、氢氧化钾、氨水或碳酸钠溶液调整和维持发酵液的ph值。
27.本技术的有益效果包括但不限于：
28.1.根据本技术的丁酸梭菌的发酵方法，该方法采用特定的种子罐和发酵罐的消配和接种培养方法，发酵效果好，制得的菌种浓度高，适于工业化推广生产。
29.2.根据本技术的丁酸梭菌的发酵方法，通过限定一级种子罐和二级种子罐培养基的组成，使接入菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体，培养基组分能够为菌体提供充足的碳源和氮源及无机盐等，保证其生命力旺盛、染深、菌丝粗壮，无杂菌及异常菌体。
30.3.根据本技术的丁酸梭菌的发酵方法，通过在发酵罐中使用酶解后玉米粉和豆粕粉，为丁酸梭菌的生长提供充足氮源，用于菌体细胞蛋白质、核酸和代谢产物(如酶、抑菌肽等)的合成，有利于提升菌体浓度。
31.4.根据本技术的丁酸梭菌的发酵方法，发酵结束后获得的丁酸梭菌数量较高，可达1.0～1.2
×
109cfu/ml，芽孢耐热比例高达90％以上。
具体实施方式
32.下面结合实施例详述本技术，但本技术并不局限于这些实施例。
33.除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。本专利中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
34.本技术的实施例1-3中一级种子罐、二级种子罐和发酵罐的配方相同，均为：一级种子罐的培养基组分：蛋白胨10.0g/l、牛肉粉10.0g/l、酵母粉3.0g/l、葡萄糖5.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、氯化钠5.0g/l、醋酸钠3.0g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，ph值为6.8；
35.二级种子罐的培养基组分：蛋白胨10.0g/l、牛肉粉10.0g/l、酵母粉3.0g/l、葡萄糖5.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、氯化钠5.0g/l、醋酸钠3.0g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，ph值为6.8；
36.发酵罐的培养基组分：玉米粉30.0g/l、豆粕粉25.0g/l、葡萄糖5.0g/l、氯化钠5.0g/l、醋酸钠3.0g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，ph值为6.8。
37.实施例1
38.s1、活化菌种：将丁酸梭菌活化，制备菌种摇瓶；
39.s2、种子罐的消配：
40.一级种子罐的消配：打开一级种子罐冲洗罐壁，每次冲洗2min，重复清洗2次，提高
罐压至0.1mpa，将水排出；
41.核对原料种类及数量，并查看原料有无结块，先加水至罐内第一搅拌叶位置，然后启动搅拌，将原料缓慢投入罐内，完全溶解并定容，盖好罐盖，打开蒸汽阀门向罐内通蒸汽，并打开排气阀。缓慢提高温度至120℃并维持温度121℃，压力在0.11mpa，时间30min，完成消毒灭菌过程，灭菌结束时，先关进蒸汽阀，通入氮气，控制罐压≥0.05mpa。打开冷却循环水阀门，开始降温。待温度降至37℃时，关闭搅拌保温保压；
42.二级种子罐的消配：打开二级种子罐冲洗罐壁，每次冲洗2min，重复清洗2次，提高罐压至0.1mpa，将水排出；
43.核对原料种类及数量，并查看原料有无结块，先加水至罐内第一搅拌叶位置，然后启动搅拌，将原料缓慢投入罐内，完全溶解并定容，盖好罐盖，打开蒸汽阀门向罐内通蒸汽，并打开排气阀。缓慢提高温度至120℃并维持温度121℃，压力在0.11mpa，时间30min，完成消毒灭菌过程，灭菌结束时，先关进蒸汽阀，通入氮气，控制罐压≥0.05mpa。打开冷却循环水阀门，开始降温。待温度降至37℃时，关闭搅拌保温保压，等待接种；
44.s3、种子罐接种培养：
45.(1)一级种子罐接种培养：当温度降到37℃时准备接种，关闭门窗，接种区域喷洒消毒液，用酒精棉球擦拭双手，准备好酒精、打火机、接种火圈，打开排气阀将罐压降到0.02mpa，点燃酒精火圈，慢慢打开接种口，在火焰保护下迅速将种子液接入种子罐，并迅速盖好接种口，打开氮气进气阀门，调整罐压≥0.02mpa，开启搅拌，正常培养期间维持温度37℃，罐压≥0.02mpa；
46.接种量为2％，ph值为6，搅拌转速为100rpm，培养时间为6h；
47.(2)二级种子罐接种培养：移种前需要对移种管道进行灭菌，灭菌时间40min，灭菌结束后迅速将一级种子罐的种子液通过移种管道转移到二级种子罐中将一级种子罐的种子液通过移种管道转移到二级种子罐中，打开氮气进气阀门，调整罐压≥0.02mpa，开启搅拌，保持温度37℃，罐压≥0.02mpa；二级种子罐接种培养中接种量为10％，ph值为6，搅拌转速为100rpm，培养时间为8h；
48.s4、发酵罐的消配：打开发酵罐冲洗罐壁，每次冲洗2min，重复清洗2次，提高罐压至0.1mpa，将水排出，核对原料种类及数量，并查看原料有无结块，将酶解好的玉米粉和豆粕粉打入发酵罐内，加水量为总罐体容积的70％，然后启动搅拌，将其它原料缓慢倒入罐内，待培养基完全溶解后定容，并调ph值；
49.盖好罐盖，打开蒸汽阀门向罐内通蒸汽，并打开排气阀，提高温度至120℃并维持温度121℃，压力在0.11mpa，时间30min，完成灭菌，灭菌结束后，先关进蒸汽阀，罐顶通入无菌空气，控制罐压≥0.05mpa，打开冷却循环水阀门，开始降温，待温度降至37℃时，关闭搅拌保温保压0.04mpa，等待接种；
50.s5、发酵罐接种培养：移种前需要对移种管道进行灭菌，灭菌时间40min，灭菌结束后迅速将二级种子液通过移种管道转移到发酵罐中，关闭排气阀，开启搅拌，保持温度37.5℃，罐压≥0.02mpa；发酵罐接种培养中接种量为10％，ph值为5.8，搅拌转速为100rpm，培养时间为20h。
51.其中，还包括发酵原料的预处理：将玉米粉和豆粕粉按20％的浓度拌料，调整ph值至7，升温至45℃，加入中性蛋白酶800u/g，酶解60min，调ph值至6.0，升温至60℃，加入中温
淀粉酶60u/g，酶解30min。
52.实施例2
53.s1、活化菌种：将丁酸梭菌活化，制备菌种摇瓶；
54.s2、种子罐的消配：
55.一级种子罐的消配：打开一级种子罐冲洗罐壁，每次冲洗2min，重复清洗3次，提高罐压至0.1mpa，将水排出；
56.核对原料种类及数量，并查看原料有无结块，先加水至罐内第一搅拌叶位置，然后启动搅拌，将原料缓慢投入罐内，完全溶解并定容，盖好罐盖，打开蒸汽阀门向罐内通蒸汽，并打开排气阀。缓慢提高温度至120℃并维持温度122℃，压力在0.1mpa，时间30min，完成消毒灭菌过程，灭菌结束时，先关进蒸汽阀，通入氮气，控制罐压≥0.05mpa。打开冷却循环水阀门，开始降温。待温度降至36℃时，关闭搅拌保温保压；
57.二级种子罐的消配：打开二级种子罐冲洗罐壁，每次冲洗2min，重复清洗2次，提高罐压至0.1mpa，将水排出；
58.核对原料种类及数量，并查看原料有无结块，先加水至罐内第一搅拌叶位置，然后启动搅拌，将原料缓慢投入罐内，完全溶解并定容，盖好罐盖，打开蒸汽阀门向罐内通蒸汽，并打开排气阀。缓慢提高温度至120℃并维持温度122℃，压力在0.1mpa，时间30min，完成消毒灭菌过程，灭菌结束时，先关进蒸汽阀，通入氮气，控制罐压≥0.05mpa。打开冷却循环水阀门，开始降温。待温度降至36℃时，关闭搅拌保温保压，等待接种；
59.s3、种子罐接种培养：
60.(1)一级种子罐接种培养：当温度降到36℃时准备接种，关闭门窗，接种区域喷洒消毒液，用酒精棉球擦拭双手，准备好酒精、打火机、接种火圈，打开排气阀将罐压降到0.02mpa，点燃酒精火圈，慢慢打开接种口，在火焰保护下迅速将种子液接入种子罐，并迅速盖好接种口，打开氮气进气阀门，调整罐压≥0.02mpa，开启搅拌，正常培养期间维持温度36℃，罐压≥0.02mpa；
61.接种量为0.2％，ph值为5.5，搅拌转速为30rpm，培养时间为4h；
62.(2)二级种子罐接种培养：移种前需要对移种管道进行灭菌，灭菌时间30min，灭菌结束后迅速将一级种子罐的种子液通过移种管道转移到二级种子罐中将一级种子罐的种子液通过移种管道转移到二级种子罐中，打开氮气进气阀门，调整罐压≥0.02mpa，开启搅拌，保持温度36℃，罐压≥0.02mpa；二级种子罐接种培养中接种量为3％，ph值为5.5，搅拌转速为60rpm，培养时间为6h；
63.s4、发酵罐的消配：打开发酵罐冲洗罐壁，每次冲洗2min，重复清洗2次，提高罐压至0.1mpa，将水排出，核对原料种类及数量，并查看原料有无结块，将酶解好的玉米粉和豆粕粉打入发酵罐内，加水量为总罐体容积的70％，然后启动搅拌，将其它原料缓慢倒入罐内，待培养基完全溶解后定容，并调ph值；
64.盖好罐盖，打开蒸汽阀门向罐内通蒸汽，并打开排气阀，提高温度至120℃并维持温度120℃，压力在0.1mpa，时间30min，完成灭菌，灭菌结束后，先关进蒸汽阀，罐顶通入无菌空气，控制罐压≥0.05mpa，打开冷却循环水阀门，开始降温，待温度降至36℃时，关闭搅拌保温保压0.02mpa，等待接种；
65.s5、发酵罐接种培养：移种前需要对移种管道进行灭菌，灭菌时间30min，灭菌结束
后迅速将二级种子液通过移种管道转移到发酵罐中，关闭排气阀，开启搅拌，保持温度37℃，罐压≥0.02mpa；发酵罐接种培养中接种量为5％，ph值为5.5，搅拌转速为80rpm，培养时间为16h。
66.其中，还包括发酵原料的预处理：将玉米粉和豆粕粉按20％的浓度拌料，调整ph值至6.8，升温至42℃，加入中性蛋白酶300u/g，酶解30min，调ph值至5.5，升温至55℃，加入中温淀粉酶20u/g，酶解20min。
67.实施例3
68.s1、活化菌种：将丁酸梭菌活化，制备菌种摇瓶；
69.s2、种子罐的消配：
70.一级种子罐的消配：打开一级种子罐冲洗罐壁，每次冲洗2min，重复清洗3次，提高罐压至0.1mpa，将水排出；
71.核对原料种类及数量，并查看原料有无结块，先加水至罐内第一搅拌叶位置，然后启动搅拌，将原料缓慢投入罐内，完全溶解并定容，盖好罐盖，打开蒸汽阀门向罐内通蒸汽，并打开排气阀。缓慢提高温度至120℃并维持温度122℃，压力在0.12mpa，时间30min，完成消毒灭菌过程，灭菌结束时，先关进蒸汽阀，通入氮气，控制罐压≥0.05mpa。打开冷却循环水阀门，开始降温，待温度降至38℃时，关闭搅拌保温保压；
72.二级种子罐的消配：打开二级种子罐冲洗罐壁，每次冲洗2min，重复清洗3次，提高罐压至0.1mpa，将水排出；
73.核对原料种类及数量，并查看原料有无结块，先加水至罐内第一搅拌叶位置，然后启动搅拌，将原料缓慢投入罐内，完全溶解并定容，盖好罐盖，打开蒸汽阀门向罐内通蒸汽，并打开排气阀。缓慢提高温度至120℃并维持温度122℃，压力在0.12mpa，时间30min，完成消毒灭菌过程，灭菌结束时，先关进蒸汽阀，通入氮气，控制罐压≥0.05mpa，打开冷却循环水阀门，开始降温。待温度降至38℃时，关闭搅拌保温保压，等待接种；
74.s3、种子罐接种培养：
75.(1)一级种子罐接种培养：当温度降到38℃时准备接种，关闭门窗，接种区域喷洒消毒液，用酒精棉球擦拭双手，准备好酒精、打火机、接种火圈，打开排气阀将罐压降到0.02mpa，点燃酒精火圈，慢慢打开接种口，在火焰保护下迅速将种子液接入种子罐，并迅速盖好接种口，打开氮气进气阀门，调整罐压≥0.02mpa，开启搅拌，正常培养期间维持温度38℃，罐压≥0.02mpa；
76.接种量为4％，ph值为6.5，搅拌转速为150rpm，培养时间为10h；
77.(2)二级种子罐接种培养：移种前需要对移种管道进行灭菌，灭菌时间60min，灭菌结束后迅速将一级种子罐的种子液通过移种管道转移到二级种子罐中将一级种子罐的种子液通过移种管道转移到二级种子罐中，打开氮气进气阀门，调整罐压≥0.02mpa，开启搅拌，保持温度38℃，罐压≥0.02mpa；二级种子罐接种培养中接种量为12％，ph值为6.5，搅拌转速为150rpm，培养时间为12h；
78.s4、发酵罐的消配：打开发酵罐冲洗罐壁，每次冲洗2min，重复清洗3次，提高罐压至0.1mpa，将水排出，核对原料种类及数量，并查看原料有无结块，将酶解好的玉米粉和豆粕粉打入发酵罐内，加水量为总罐体容积的70％，然后启动搅拌，将其它原料缓慢倒入罐内，待培养基完全溶解后定容，并调ph值；
79.盖好罐盖，打开蒸汽阀门向罐内通蒸汽，并打开排气阀，提高温度至120℃并维持温度122℃，压力在0.12mpa，时间30min，完成灭菌，灭菌结束后，先关进蒸汽阀，罐顶通入无菌空气，控制罐压≥0.05mpa，打开冷却循环水阀门，开始降温，待温度降至38℃时，关闭搅拌保温保压0.06mpa，等待接种；
80.s5、发酵罐接种培养：移种前需要对移种管道进行灭菌，灭菌时间60min。灭菌结束后迅速将二级种子液通过移种管道转移到发酵罐中，关闭排气阀，开启搅拌，保持温度38.0℃，罐压≥0.02mpa；发酵罐接种培养中接种量为12％，ph值为6.0，搅拌转速为150rpm，培养时间为24h。
81.其中，还包括发酵原料的预处理：将玉米粉和豆粕粉按20％的浓度拌料，调整ph值至7.2，升温至48℃，加入中性蛋白酶1500u/g，酶解90min，调ph值至6.5，升温至65℃，加入中温淀粉酶120u/g，酶解60min。
82.对比例1
83.对比例1与实施例1的区别为：对比例1中一级种子罐的培养基由以下成分组成：胰蛋白胨10.0g/l、牛肉粉5.0g/l、酵母粉3.0g/l、葡萄糖10.0g/l、磷酸氢二钾1.0g/l、氯化钙0.2g/l、醋酸钠3.0g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.75g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.5g/l、硫酸亚铁0.05g/l，ph值为7.5；
84.二级种子罐的培养基由以下成分组成：胰蛋白胨10.0g/l、牛肉粉5.0g/l、酵母粉3.0g/l、葡萄糖10.0g/l、磷酸氢二钾1.0g/l、氯化钙0.2g/l、醋酸钠3.0g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.75g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.5g/l、硫酸亚铁0.05g/l，ph值为7.5。
85.对比例2
86.对比例2和实施例1的区别为：对比例2中发酵罐的培养基包括以下成分：玉米粉30.0g/l、蛋白胨10g/l、牛肉粉5.0g/l、酵母提取物3g/l、葡萄糖10.0g/l、磷酸氢二钾1.0g/l、氯化钙0.2g/l、醋酸钠3.0g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.75g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.5g/l、硫酸亚铁0.05g/l，ph值为7.5。
87.对比例3
88.对比例3和实施例1的区别为：对比例3中将玉米粉和豆粕粉同时投入拌料罐，加入淀粉酶200u/g，升温至60℃，调ph值至6.0，酶解70min。
89.实验例
90.对实施例1-3和对比例1-3所发酵的丁酸梭菌进行检测，各项目监测数据如表1所示。丁酸梭菌计数方法参考标准t/cswsl006-2019。
91.表1
[0092][0093]
由上述结果可知，采用本技术所限定的发酵方法得到的丁酸梭菌数量多，菌体浓度高，耐热芽孢比例高达93％以上。
[0094]
对比例1和2未使用本技术所限定的培养基配方，最终发酵得到的菌种数量少，耐热芽孢率低；对比例3中发酵原料采用常规处理，最终发酵效果一般，得到的菌种数量少，耐热芽孢比例较低。
[0095]
以上所述，仅为本技术的实施例而已，本技术的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本技术的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换。

技术特征：

1.一种丁酸梭菌的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、活化菌种：将丁酸梭菌活化，制备菌种摇瓶；s2、种子罐的消配：打开种子罐冲洗罐壁，将水排出，再加水启动搅拌，将原料投入罐内完全溶解并定容，向罐内通蒸汽灭菌，灭菌结束后，先关蒸汽阀，通入氮气，降温至37
±
1℃时，关闭搅拌保温保压，等待接种；s3、种子罐接种培养：(1)一级种子罐接种培养：点燃酒精火圈，缓慢打开接种口，在火焰保护下将活化后的种子液接入一级种子罐，关闭接种口，通入氮气开启搅拌，保持温度37
±
1℃，罐压≥0.02mpa；(2)二级种子罐接种培养：将一级种子罐的种子液通过移种管道转移到二级种子罐中，通入氮气，开启搅拌，保持温度37
±
1℃，罐压≥0.02mpa；s4、发酵罐的消配：打开发酵罐冲洗罐壁，将水排出，将酶解好的玉米粉和豆粕粉打入发酵罐内，加水搅拌，将其它原料倒入罐内，待培养基完全溶解后定容，向罐内通蒸汽灭菌，灭菌结束后，先关进蒸汽阀，通入无菌空气，降温至37
±
1℃时，关闭搅拌保温保压，等待接种；s5、发酵罐接种培养：将二级种子液通过移种管道转移到发酵罐中，关闭排气阀，开启搅拌，保持温度37.5
±
0.5℃，罐压≥0.02mpa。2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，s2种子罐的消配包括一级种子罐的消配和二级种子罐的消配，消配方法相同；消配方法：打开种子罐冲洗罐壁，每次冲洗2min，重复清洗2～3次，提高罐压至0.1mpa，将水排出，加水至罐内第一搅拌叶位置，然后启动搅拌，将原料投入罐内，完全溶解并定容，盖好罐盖，通入蒸汽，提高温度至120℃并维持温度121
±
1℃，压力在0.1～0.12mpa，时间30min，灭菌结束时，先关进蒸汽阀，通入氮气，控制罐压≥0.05mpa，打开冷却循环水阀门，降温至37
±
1℃时，关闭搅拌保温保压。3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，一级种子罐接种培养：当一级种子罐温度降到37
±
1℃时准备接种，打开排气阀将罐压降到0.02mpa，点燃酒精火圈，缓慢打开接种口，在火焰保护下迅速将活化后的种子液接入一级种子罐，关闭接种口，打开氮气进气阀门，调整罐压≥0.02mpa，开启搅拌，保持温度37
±
1℃，罐压≥0.02mpa；接种量为0.2％～4％，ph值为5.5～6.5，搅拌转速为30～150rpm，培养时间为4～10h。4.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，二级种子罐接种培养中接种量为3％～12％，ph值为5.5～6.5，搅拌转速为60～150rpm，培养时间为6～12h；发酵罐接种培养中接种量为5％～12％，ph值为5.5～6.0，搅拌转速为80～150rpm，培养时间为16～24h。5.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，发酵罐的消配：打开发酵罐冲洗罐壁，每次冲洗2min，重复清洗2～3次，提高罐压至0.1mpa，将水排出，将酶解好的玉米粉和豆粕粉打入发酵罐内，加水量为总罐体容积的70％，启动搅拌，将其它原料倒入罐内，待培养基完全溶解后定容，并调ph值，盖好罐盖，通入蒸汽，提高温度至120℃并维持温度121
±
1℃，压力在0.1～0.12mpa之间，时间30min，灭菌结束后，先关蒸汽阀，通入无菌空气，控制罐压≥0.05mpa，打开冷却循环水阀门，开始降温，待温度降至37
±
1℃时，关闭搅拌保温保压
0.02～0.06mpa，等待接种。6.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，一级种子罐的培养基包括以下成分：蛋白胨10.0g/l、牛肉粉10.0g/l、酵母粉3.0g/l、葡萄糖5.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、氯化钠5.0g/l、醋酸钠3.0g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，ph值为6.8
±
0.1。7.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，二级种子罐的培养基包括以下成分：蛋白胨10.0g/l、牛肉粉10.0g/l、酵母粉3.0g/l、葡萄糖5.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、氯化钠5.0g/l、醋酸钠3.0g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，ph值为6.8
±
0.1。8.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，发酵罐的培养基包括以下成分：玉米粉30.0g/l、豆粕粉25.0g/l、葡萄糖5.0g/l、氯化钠5.0g/l、醋酸钠3.0g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，ph值为6.8
±
0.1。9.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤s3和s5中移种前需要对移种管道进行灭菌，灭菌时间30min～60min。10.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，还包括发酵原料的预处理：将玉米粉和豆粕粉同时投入拌料罐，按20％的浓度加水拌料，搅拌均匀后调整ph值至6.8～7.2，升温至42～48℃，加入中性蛋白酶300～1500u/g，酶解30～90min，调ph值至5.5～6.5，再加入中温淀粉酶20～120u/g，升温至55～65℃，酶解20～60min。

技术总结

本申请公开了一种丁酸梭菌的发酵方法，包括以下步骤：S1、活化菌种：将丁酸梭菌活化，制备菌种摇瓶；S2、种子罐的消配：打开种子罐冲洗罐壁，将水排出，再加水启动搅拌，将原料投入罐内完全溶解并定容，向罐内通蒸汽灭菌，灭菌结束后，先关蒸汽阀，通入氮气，降温至37

技术研发人员：

郭芳坤 李勇 唐雨泽 陈吉伟 宋迪 林永康

受保护的技术使用者：

山东天润和生物工程有限公司

技术研发日：

2022.09.30

技术公布日：

2022/11/25