一种生物硫醇响应的AIE荧光探针及其制备方法与应用

一种生物硫醇响应的aie荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及荧光探针技术领域，尤其是指一种生物硫醇响应的aie荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术：

2.生物硫醇作为重要的信号分子，如半胱氨酸(cys)和谷胱甘肽(gsh)在生理活动中发挥重要作用。一些研究已经证实，生物硫醇的异常水平与神经毒性和心血管疾病高度相关。高水平的同型半胱氨酸是高血压、中风和心脏病发作的可靠风险因素。血清中gsh水平显著降低可作为早期帕金森病的诊断标志，同时，gsh水平与神经退行性疾病、糖尿病、hiv感染和癌症有关。cys分子水平的突然变化可能与肝脏损伤、皮肤病和阿尔茨海默病有关。因此，评估生物硫醇水平的护理点测试(poct)技术，尤其是可视化方法是非常必要的，并在分析科学中引起了更多的关注。
3.作为一类多孔晶体材料，沸石咪唑框架(zif-mofs)已被用于吸附和分离各种离子，或作为载体共同包封分子探针，如酶、碳点和金纳米材料。auncs发射效率的明显提高和zif-mofs外壳的保护作用为auncs在危害、特定分子传感和敏感poct评估方面的进一步应用铺平了道路。
4.在过去的十年中，纳米探针作为替代方法已经成为快速感应生物硫醇的有前途的策略。其中，金纳米簇(auncs)由于其简单的合成方法、良好的光稳定性、快速感应、化学稳定性和生物相容性，已经被标记为荧光输出的重要探针。尽管如此，到目前为止，大多数auncs的合成技术与普通荧光染料如罗丹明相比，总是显示出较低的荧光量子产率。
5.对auncs荧光性能的调控和量子产率的提高，是后期在传感、成像等领域的应用基础；目前，大多数auncs的合成技术总是显示出较低的荧光量子产率，因此，制备基于aie荧光响应的生物硫醇探针具有重要意义。

技术实现要素：

6.为了解决上述问题，本发明提供了一种生物硫醇响应的aie荧光探针及其制备方法与应用。本发明的aie荧光探针基于zif-8中auncs的竞争性调控，开发了一种独特的“开-关-增强开”方法，用于高灵敏度和快速感应生物硫醇。该荧光探针的合成简单，使用方便，能够实现对溶液中生物硫醇进行高灵敏检测，并体现了探针的特异性和选择性。
7.本发明是通过以下技术方案实现的：
8.本发明的第一个目的是提供一种生物硫醇响应的aie荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
9.将锌源、2-甲基咪唑分别与auncs溶液混合，得到溶液a和溶液b，将溶液a与溶液b混合反应，得到所述生物硫醇响应的aie荧光探针。
10.在本发明的一个实施例中，所述auncs溶液通过以下方法制备得到：
11.在反应液中，将四氯金酸三水合物溶液与谷胱甘肽混合加热，得到所述auncs溶
液。
12.在本发明的一个实施例中，所述四氯金酸与谷胱甘肽的摩尔比为1:1～1.5。
13.在本发明的一个实施例中，所述加热的条件：温度25℃～70℃；时间20h～24h。
14.在本发明的一个实施例中，所述锌源选自六水合硝酸锌和/或乙酸锌。
15.在本发明的一个实施例中，所述锌源与2-甲基咪唑的摩尔比为0.08：2～4。
16.本发明的第二个目的是提供所述制备方法得到的生物硫醇响应的aie荧光探针。
17.本发明第三个目的是提供所述生物硫醇响应的aie荧光探针在检测生物硫醇中的应用。
18.在本发明的一个实施例中，所述应用的测试方法包括以下步骤：
19.(1)将生物硫醇响应的aie荧光探针与淬灭剂混合孵育，得到含有淬灭剂的auncs@zif-8溶液；
20.(2)将生物硫醇与步骤(1)所得含有淬灭剂的auncs@zif-8溶液混匀，检测所得混合液的荧光强度，实现生物硫醇的定量或定性检测。
21.在本发明的一个实施例中，所述淬灭剂为hg
2+
。
22.在本发明的一个实施例中，所述生物硫醇为半胱氨酸和/或谷胱甘肽。
23.本发明的所述生物硫醇响应的aie荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
24.(1)将谷胱甘肽溶液缓慢滴入一定浓度的四氯金酸三水合物溶液中，两者充分混合后，，继续搅拌24h得到auncs溶液，反应结束后，将auncs溶液浓缩，并储存在4℃备用。
25.(2)将六水合硝酸锌与2-甲基咪唑分别溶解在auncs溶液，中配置得到溶液a和b。然后在25℃的磁力搅拌下将溶液a逐滴滴加入溶液b中，反应30min后，静置2h，洗涤得到auncs@zif-8荧光探针。
26.其中，所述的四氯金酸三水合物在水中的浓度为20mm；所述六水合硝酸锌溶液浓度为0.08m；所述2-甲基咪唑溶液浓度为2m～4m；所述auncs溶液的浓缩倍数为1.5倍。
27.在本发明的一种实施方式中，所述的溶液均为水体系。
28.在本发明的一种实施方式中，所述的充分混合是采用超声辅助溶解法进行。
29.在本发明的一种实施方式中，所述的浓缩是通过真空干燥，具体是将auncs样品置于60℃真空干燥箱内12h-24h，干燥后的auncs重新解溶，之后避光置于4℃条件下保存；其中重新溶解时的溶剂为水。
30.作为优选，其反应路线如下所示：
31.本发明所述的生物硫醇响应的aie荧光探针在半胱氨酸/谷胱甘肽的响应性检测和在血清中的半胱氨酸/谷胱甘肽的检测的应用。
32.作为优选，所述响应性检测的过程为：
33.(1)取auncs@zif-8荧光传感器，测定auncs@zif-8荧光传感器的荧光强度；
34.(2)向auncs@zif-8荧光探针溶液中加入16μl，浓度为3
×
10-4
m的hg
2+
溶液，搅拌孵育后以固定激发波长400nm，进行荧光发射光谱测定。
35.(3)向加入hg
2+
的auncs@zif-8荧光传感器溶液中加入待检测物生物硫醇(半胱氨酸，谷胱甘肽溶液)，搅拌孵育后以固定激发波长400nm，进行荧光发射光谱测定。
36.(4)建立标准体系与荧光强度的线性关系，计算实际样品血清中的半胱氨酸，谷胱甘肽含量。
37.本发明的机理：
38.本发明基于zif-8中auncs的竞争性调控，开发了一种独特的“开-关-增强开”方法，用于高灵敏度和快速感应生物硫醇。由于auncs的自我聚集，实现了强烈的聚集诱导发光。与传统的aie不同，聚集的发光是通过hg
2+
的预埋竞争因素来调节和淬灭的，用于开发视觉感应纳米探针。在生物硫醇的存在下，hg
2+
的介体在形成更强的hg
2+-s键的基础上与auncs竞争，从而导致荧光的恢复和产生增强。这样设计的纳米探针可以成功地对血清样品中的微量生物硫醇做出反应，重要的是，比起自由的auncs，它的固体稳定性保持了对生物硫醇的感应的巨大潜力，可以高度促进疾病诊断的进展。
39.本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
40.(1)本发明所述的aie荧光探针的合成简单，使用方便，能够实现对溶液中生物硫醇进行高灵敏检测，并体现了探针的特异性和选择性。
41.(2)本发明所述的aie荧光探针种auncs被封装在zif-8中，由于auncs的自我聚集，实现了强烈的聚集诱导发光。
42.(3)本发明通过hg
2+
的预埋竞争因素来调节和淬灭聚集的发光。在生物硫醇的存在下，hg
2+
的介体在形成更强的hg
2+-s键的基础上与auncs竞争，从而导致荧光的恢复和产生增强。
43.(4)本发明可用于开发视觉感应探针，基于zif-8中auncs的竞争性调控，开发了一种独特的“开-关-增强开”方法，用于高灵敏度和快速感应生物硫醇。
附图说明
44.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
45.图1是本发明实施例1中auncs@zif-8的高分辨透射电镜照片；
46.图2是本发明实施例1中zif-8和auncs@zif的x射线衍射图谱；
47.图3是本发明实施例4中auncs@zif/hg
2+
荧光传感半胱氨酸的线性拟合；
48.图4是本发明实施例4中auncs@zif/hg
2+
荧光传感谷胱甘肽的线性拟合；
49.图5是本发明实施例5中荧光探针auncs溶液和auncs@zif-8的荧光发射光谱图；
50.图6是本发明实施例5中荧光探针auncs@zif-8、auncs@zif-8分别与hg
2+
和cys共同孵育后的荧光发射光谱图；
51.图7是本发明实施例6中auncs@zif-8荧光探针对不同氨基酸的荧光强度变化。
具体实施方式
52.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
53.实施例1
54.(1)将四氯金酸三水合物(20mm，1ml)的水溶液与8.7ml超纯水混合。然后，将谷胱甘肽溶液(100mm，0.3ml)在25℃下慢慢滴入四氯金酸三水合物溶液。在500rpm的磁力搅拌5min后，温度上升到70℃并继续搅拌24h，浓缩1.5倍，得到auncs溶液，并储存在4℃备用。浓缩是利用真空干燥，具体是将auncs样品置于60℃真空干燥箱内干燥，干燥后的auncs重新
解溶，之后避光置于4℃条件下保存；其中重新溶解时的溶剂为水。
55.(2)将六水合硝酸锌(0.08m)和2-甲基咪唑(2m)分别溶解在浓缩的水溶液中，配置得到溶液a和b。然后在25℃的磁力搅拌(500rpm)下将溶液a逐滴滴加入溶液b中，反应30min后，放置2h，离心3次(10000rpm，10min)，得到zif-8探针。
56.(3)将六水合硝酸锌(0.08m)和2-甲基咪唑(2m)分别溶解在浓缩的auncs溶液中，配置得到溶液a和b。然后在25℃的磁力搅拌(500rpm)下将溶液a逐滴滴加入溶液b中，反应30min后，放置2h，离心3次(10000rpm，10min)，得到auncs@zif-8荧光探针。
57.图1为本实施例中zif-8和auncs@zif-8纳米颗粒的高分辨透射电镜图。由图1可以看出，zif-8具有规则的均匀的多面体形状，尺寸分布均匀，约为120nm，一锅合成的auncs@zif-8颗粒只显示了形状和尺寸的轻微增加。此外，auncs@zif-8颗粒图像表明，auncs颗粒被封装在zif-8框架内，而不是吸附在表面上，这为聚集诱导发光提供了证明。
58.图2为实施例1中zif-8和auncs@zif-8的x射线衍射图谱，结合zif-8和auncs@zif-8的x射线衍射图谱可以看出，auncs@zif-8的x射线衍射图谱与zif-8的射线衍射图谱几乎相同，auncs@zif-8中zif-8的骨架没有被内部auncs粒子破坏。
59.实施例2
60.(1)将四氯金酸三水合物(20mm，1ml)的水溶液与8.7ml超纯水混合。然后，将谷胱甘肽溶液(100mm，0.3ml)在25℃下慢慢滴入四氯金酸三水合物溶液。在500rpm的磁力搅拌5min后，温度上升到70℃并继续搅拌24h，浓缩1.5倍，得到auncs溶液，并储存在4℃备用。
61.(2)将六水合硝酸锌(0.08m)和2-甲基咪唑(4m)分别溶解在浓缩的auncs溶液中，配置得到溶液a和b。然后在25℃的磁力搅拌(500rpm)下将溶液a逐滴滴加入溶液b中，反应30min后，放置2h，离心3次(10000rpm，10min)，得到auncs@zif-8荧光探针。
62.实施例3
63.(1)将四氯金酸三水合物(20mm，1ml)的水溶液与8.7ml超纯水混合。然后，将谷胱甘肽溶液(100mm，0.1ml)在25℃下慢慢滴入四氯金酸三水合物溶液。在500rpm的磁力搅拌5min后，温度上升到70℃并继续搅拌24h，浓缩1.5倍，得到auncs溶液，并储存在4℃备用。
64.(2)将六水合硝酸锌(0.08m)和2-甲基咪唑(4m)分别溶解在浓缩的auncs溶液中，配置得到溶液a和b。然后在25℃的磁力搅拌(500rpm)下将溶液a逐滴滴加入溶液b中，反应30min后，放置2h，离心3次(10000rpm，10min)，得到auncs@zif-8荧光探针。
65.实施例4生物硫醇的响应性检测
66.(1)取auncs@zif-8荧光探针，测定auncs@zif-8荧光传感器的荧光强度；
67.(2)向auncs@zif-8荧光探针溶液中加入16μl、浓度为3
×
10-4
m的hg
2+
溶液，搅拌孵育后，得到含hg
2+
的auncs@zif-8溶液(auncs@zif-8/hg
2+
溶液)，以固定激发波长400nm，进行荧光发射光谱测定。
68.(3)将不同浓度的cys溶液(0.0μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、4.0μm、5.0μm、8.0μm、10.0μm、20.0μm和30.0μm)分别加入到5μl含hg
2+
的auncs@zif-8溶液中，摇匀后得到auncs@zif-8/hg
2+
/cys溶液，分别取1ml auncs@zif-8/hg
2+
/cys溶液，用荧光光谱仪检测荧光强度。参数设置:激发波长为500nm-750nm，扫描速度为1nm/min，激发发射狭缝为10nm。检测结果如图3所示。由图3可以看出cys的含量与荧光强度呈线性关系。
69.将不同浓度的gsh溶液(0.0μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、4.0μm、5.0μm、8.0μm、
10.0μm、20.0μm和30.0μm)分别加入到5μl含hg
2+
的auncs@zif-8(3
×
10-4
m,8μl)溶液中，摇匀后得到auncs@zif-8/hg
2+
/cys溶液，分别取1ml auncs@zif-8/hg
2+
/cys溶液，用荧光光谱仪检测荧光强度。参数设置:激发波长为500nm-750nm，扫描速度为1nm/min，激发发射狭缝为10nm。检测结果如图4所示。由图4可以得出看出谷胱甘肽的含量与荧光强度呈线性关系。
70.实施例5荧光可行性分析
71.对实施例1制备所得auncs溶液和auncs@zif-8用荧光光谱仪进行荧光检测可行性分析，结果如图5所示。由图5可以看出，auncs@zif-8的荧光强度与相同摩尔浓度的auncs溶液相比，大大增强，大约为6倍。
72.已有研究表明，auncs的发光增强与分子内运动受限导致的非辐射衰减减少有关。因此，zif-8中的有限空间阻止了分子内旋转，为auncs提供了一个不稳定的聚集，最终导致了聚集诱导发射(aie)现象。本发明对实施例1和实施例4中所得auncs@zif-8溶液、auncs@zif-8/hg
2+
溶液、auncs@zif-8/hg
2+
/cys溶液进行荧光检测可行性分析，结果如图6所示。由图6表明，当hg
2+
加入到荧光探针溶液中时，荧光强度会迅速下降。这可能是由于hg
2+
与auncs表面的au
+
之间形成了金属键所致。另一方面，当加入cys分子时，猝灭的荧光将逐渐恢复。这种猝灭和恢复的荧光可能源于hg
2+
离子与巯基之间的反应比aunc与hg
2+
之间的反应更强、更稳定。
73.实施例6荧光选择性分析
74.分别配置不同的氨基酸(asp、arg、lys、gly、val、ile、leu、his、phe、thr、pro、ala、glu、trp、ser、met、gln、asn、tyr)溶液(浓度为10倍的cys溶液)，将配置的氨基酸溶液分别加入到含hg
2+
的auncs@zif-8(3
×
10-4
m,8μl)5μl溶液中，摇匀后分别取1ml氨基酸溶液。最后用荧光光谱仪测量了荧光光谱。
75.其他氨基酸(asp,arg,lys,gly,val,ile,leu,his,phe,thr,pro,ala,glu,trp,ser,met,gln,asn和tyr)存在的条件下，荧光探针auncs@zif-8对生物硫醇(gsh、cys溶液)的荧光传感性能如图7所示。由图7可知，即使是在其他常见氨基酸存在的条件下，本发明的auncs@zif-8对生物硫醇(gsh、cys溶液)荧光检测依然具有良好的选择性，这说明其具有良好的抗干扰能力，可以用于生物硫醇(gsh、cys溶液)荧光传感。
76.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：

1.一种生物硫醇响应的aie荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将锌源、2-甲基咪唑分别与auncs溶液混合，得到溶液a和溶液b，将溶液a与溶液b混合反应，得到所述生物硫醇响应的aie荧光探针。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述auncs溶液通过以下方法制备得到：在反应液中，将四氯金酸与谷胱甘肽混合加热，得到所述auncs溶液。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述四氯金酸与谷胱甘肽的摩尔比为1:1～1.5。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述锌源选自六水合硝酸锌和/或乙酸锌。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述锌源与2-甲基咪唑的摩尔比为0.08：2～4。6.由权利要求1～5任一所述制备方法得到的生物硫醇响应的aie荧光探针。7.权利要求6所述生物硫醇响应的aie荧光探针在检测生物硫醇中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：(1)将生物硫醇响应的aie荧光探针与淬灭剂混合孵育，得到含有淬灭剂的auncs@zif-8溶液；(2)将生物硫醇与步骤(1)所得含有淬灭剂的auncs@zif-8溶液混匀，检测所得混合液的荧光强度，实现生物硫醇的定量或定性检测。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述淬灭剂为hg
2+
。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生物硫醇为半胱氨酸和/或谷胱甘肽。

技术总结

本发明涉及一种生物硫醇响应的AIE荧光探针及其制备方法与应用。本发明基于ZIF-8中AuNCs的竞争性调控，开发了一种独特的“开-关-增强开”方法，用于高灵敏度和快速感应生物硫醇。与传统的AIE不同，聚集的发光是通过Hg

技术研发人员：

皮付伟 万玉琪 亓俊洁 李姝琦

受保护的技术使用者：

江南大学

技术研发日：

2022.11.14

技术公布日：

2023/2/27