一种苯甲酰胺类化合物及其制备与应用

一种苯甲酰胺类化合物及其制备与应用
(一)技术领域
1.本发明属于药物化学合成和药物学领域，特别涉及一种苯甲酰胺类化合物及其制备方法和应用。
(二)

背景技术：

2.随着化疗疗程的增加肿瘤表现出的多药耐药性(multidrug resistance,mdr)长期困扰着临床医生，并直接威胁着广大患者(curr med chem.2012,19,1946-2025.)。其中，atp结合式(abc)转运蛋白家族中p-糖蛋白(p-glycoprotein,p-gp)的在肿瘤细胞膜表面过度表达是目前研究的最广泛的肿瘤mdr产生机制(eur j med chem.2016,118,219-229.)。p-gp作为一类常见的跨膜蛋白，随着化疗的进行会在肿瘤细胞细胞膜上过表达，是化疗持续有效的最大障碍。研究表明，抑制p-gp可提高化疗药物在细胞内的积累，提高耐药细胞对化疗药物的敏感性，发挥化疗药物的作用或诱导肿瘤细胞凋亡，进而逆转mdr。因此，寻和研究抑制p-gp的药物已成为克服恶性肿瘤mdr领域的研究热点之一，也是临床和市场亟需解决的难题。
3.p-gp抑制剂的研发经过数十年的努力，共经历了三个阶段。前三代抑制剂中也有进入临床试验阶段的药物分子，但其在临床应用中面临的主要问题有：1、抑制剂对p-gp的选择性差；2、抑制剂对p-gp抑制活性不足；3、抑制剂小分子自身的毒性不可忽略；4、抑制剂影响化疗药物药代动力学性质，增加了药物的毒副作用等。为了获得抗mdr活性更强的p-gp抑制剂，本发明设计、合成了一系列苯甲酰胺类化合物。生物活性测试结果表明，该类化合物具有显著的逆转多药耐药肿瘤细胞mdr作用，增加细胞对抗肿瘤药物盐酸阿霉素的敏感性。
(三)

技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种苯甲酰胺类化合物及其制备与应用，该化合物具有良好的生物活性，可以用于由多药耐药相关蛋白导致的恶性肿瘤细胞多药耐药的药物的开发利用。
5.本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：
6.本发明提供一种式(i)或式(ⅱ)所示苯甲酰胺类化合物：
[0007][0008]
式(i)或(ⅱ)中，所述r基均为为一个或多个取代，所述r基各自独立为为氢基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、苯氧基、苯基、硝基、三氟甲氧基、亚甲二氧基、氟、氯、溴、碘、三氟甲基、二氟甲基、甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、硝基、氰基等。
[0009]
优选的，所述式(i)或(ⅱ)中r各自独立为氢基、2-甲氧基、3-甲氧基、4-甲氧基、2-乙氧基、3-乙氧基、4-乙氧基、4-异丙氧基、2-甲基、3-甲基、4-甲基、2-氟、3-氟、4-氟、2-氯、3-氯、4-氯、2-溴、3-溴、4-溴、4-碘、4-氰基、4-苯基、4-硝基、2-三氟甲基、3-三氟甲基、4-三氟甲基、2-三氟甲氧基、3-三氟甲氧基、4-三氟甲氧基、3,4-二甲氧基、3,4,5-三甲氧基、3,5-二甲氧基、3,5-二三氟甲氧基。
[0010]
式(i)中r为氢基、2-氟、3-氟、4-氟、2-氯、3-氯、4-氯、4-溴、4-碘、4-氰基、4-苯基、4-三氟甲基、2-甲氧基、3-甲氧基、4-甲氧基、4-乙氧基、4-异丙氧基、4-三氟甲基、3,4-二甲氧基、3,4,5-三甲氧基，更优选为4-氯。式(ⅱ)中r为氢基、2-氟、3-氟、4-氟、2-氯、3-氯、4-氯、2-溴、3-溴、4-溴、2-三氟甲基、3-三氟甲基、4-三氟甲基、3-甲氧基、4-甲氧基、4-硝基、4-甲基、4-三氟甲氧基、3,5-二甲氧基、3,5-二三氟甲氧基。
[0011]
本发明还提供一种所述苯甲酰胺类化合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0012][0013]
s1、在稀释剂、缚酸剂和缩合剂存在下，式(iii)所示化合物与6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉盐酸盐在0～100℃反应12～48小时，纯化分离得到式(ⅳ)所示中间体；
[0014]
s2、在稀释剂、碱和催化剂存在下，式(ⅳ)所示中间体与4-氨基苯硼酸在80～160℃反应8～20小时，纯化分离得到式(
ⅴ
)所示中间体；
[0015]
s3、在稀释剂、缚酸剂和缩合剂存在下，式(
ⅴ
)所示化合物与式(ⅵ)所示化合物在0～100℃反应12～48小时，纯化分离得到式(i)化合物；
[0016]
s4、在稀释剂、碱存在下，式(i)化合物与式(ⅶ)所示化合物在0～100℃反应3～10小时，纯化分离得到式(ⅱ)所示化合物；
[0017]
式(ⅵ)或(ⅶ)中r基均为一个或多个取代，所述r基各自独立为氢基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、苯氧基、苯基、硝基、三氟甲氧基、亚甲二氧基、氟、氯、溴、碘、三氟甲基、二氟甲基、甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、硝基、氰基；式(ⅵ)中r同式(i)中r；式(ⅶ)中r同式(ⅱ)(i)中r。
[0018]
即经历如下反应：
[0019][0020]
步骤s1、s2、s3、s4中，所述稀释剂均为惰性有机溶剂，所述稀释剂选自苯、甲苯、二甲苯、氯苯、二氯苯、石油醚、己烷、环己烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、乙醚、二异丙醚、二恶烷、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、丙酮、丁酮、甲基异丁酮、乙腈、、、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、n-甲基-甲酰苯胺、n-甲基吡咯烷酮、六甲基磷酰三胺、乙酸甲酯、乙酸乙酯、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、二乙二醇单甲醚或二乙二醇单乙醚。优选所述稀释剂为二氯甲烷、苯、甲苯或四氢呋喃。
[0021]
步骤s1和s3中，所述缚酸剂为氢氧化钠、碳酸钾、乙醇钠、三乙胺、三甲胺、三丁胺、吡啶、n,n-二甲基苯胺、n,n-二甲基苄胺、n-甲基、n-甲基吗啉、n,n-二甲基氨基吡啶、二氮杂二环辛烷、二氮杂二环壬烯或二氮杂二环十一碳烯。优选所述缚酸剂为三乙胺。
[0022]
步骤s2和s4中，所述碱均为有机碱或无机碱，优选为氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、甲醇钠、乙醇钠、三甲胺、吡啶、n,n-二甲基苯胺、n,n-二甲基苄胺、n-甲基、n-甲基吗啉、n,n-二甲基氨基吡啶、二氮杂二环辛烷、二氮杂二环壬烯或二氮杂二环十一碳烯。更优选所述碱为碳酸钾。
[0023]
步骤s2中，所述催化剂为零价或二价金属钯催化剂，如pd(oac)2,pdcl2,pd(mecn)2cl2,pd(pph3)4,pd(tfa)2等。优选，所述催化剂为四(三苯基膦)钯即pd(pph3)4。
[0024]
步骤s1和s3中，所述缩合剂为二环己基碳二亚胺(dcc)、二异丙基碳二亚胺(dic)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edci)、1-羟基苯并三唑(hobt)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸(tbtu)、三苯基磷-多卤代甲烷、三苯基磷-六氯丙酮、三苯基磷-nbs、3-酰基-2-硫噻唑啉等。优选，所述缩合剂为1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edci)、或1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edci)与1-羟基苯并三唑(hobt)以物质的量之比1:1的混合。
[0025]
优选，步骤s1反应温度根据稀释剂的选择可以在较宽的范围下进行，优选为为0～30℃反应24小时。式(ⅲ)所示化合物与6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉盐酸盐投料物质的量之比为1:1-1.5，优选1:1；所述式(ⅲ)所示化合物与稀释剂投料物质的量之比为1:
40-80，优选1:55-60；所述式(ⅲ)所示化合物与缚酸剂投料物质的量之比为1：1-3，优选1:2；所述式(ⅲ)所示化合物与缩合剂投料物质的量之比为1：0.5-3，优选1:1。
[0026]
优选，步骤s1按如下步骤进行：在装有温度计的50ml三口烧瓶中，加入6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉盐酸盐与稀释剂，搅拌降温至0℃，加入缚酸剂和缩合剂；加完后搅拌30min，维持体系温度在0℃，同时加入式(iii)所示化合物，慢慢升至室温，在25℃反应18～24h，用滤纸过滤，有机层水洗后用无水硫酸镁干燥过夜，滤出干燥剂后蒸出溶剂，得到固体，用乙酸乙酯溶解后，上样硅胶层析柱(硅胶200-300目，柱高10cm，直径2cm)，以体积比5:1的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂，洗脱3个柱体积，以体积比1：1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂进行薄层层析监测，收集rf为0.3的流出液，蒸出溶剂后得到式(ⅳ)所示中间体；所述稀释剂为二氯甲烷；所述缚酸剂为三乙胺；所述缩合剂为1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺。
[0027]
步骤s2中，反应温度根据稀释剂的选择可以在较宽的范围下进行，优选为90～100℃反应12小时。式(ⅳ)所示化合物与4-氨基苯硼酸投料物质的量之比为1:1-1.5，优选1:1；式(ⅳ)所示化合物与催化剂投料物质的量之比为1：0.001-0.1，优选1:0.005；式(ⅳ)所示化合物与碱投料物质的量之比为1：2-5，优选1:3；式(ⅳ)所示化合物与稀释剂投料物质的量之比为1:30-80，优选1:35-40。
[0028]
步骤s2按如下步骤进行：在装有温度计的50ml三口烧瓶中，氮气保护下，依次加入4-氨基苯硼酸，催化剂，碱以及式(ⅳ)所示中间体与稀释剂，在85℃反应12h，用滤纸过滤，有机层水洗后用硫酸镁干燥过夜，滤出干燥剂后蒸出溶剂，得到固体，用乙酸乙酯溶解后，上样硅胶层析柱(硅胶200-300目，柱高10cm，直径2cm)，以体积比1:1的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂，洗脱3个柱体积，以体积比1：1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂进行薄层层析监测，收集rf为0.1的流出液，蒸出溶剂后得到式(
ⅴ
)所示中间体；所述催化剂为四(三苯基膦)钯；所述碱为碳酸钾；所述稀释剂为甲苯。
[0029]
步骤s3中，反应温度根据稀释剂的选择可以在较宽的范围下进行，优选为0～30℃反应24小时。式(
ⅴ
)所示中间体与缩合剂投料物质的量之比为1:0.2-1，优选1:1；式(
ⅴ
)所示中间体与稀释剂投料物质的量之比为1:40-80，优选1:55-60；式(
ⅴ
)所示中间体与缚酸剂投料物质的量之比为1:1-3，优选1:1；式(
ⅴ
)所示中间体与式(ⅵ)所示化合物投料物质的量之比为1:1-1.5，优选1:1。
[0030]
步骤s3按如下步骤进行：在装有温度计的50ml三口烧瓶中，加入式(
ⅴ
)所示中间体，搅拌降温至0℃，加入缩合剂与稀释剂a，滴加缚酸剂，维持体系温度在0℃，同时滴加式(ⅵ)所示化合物的稀释剂b溶液；控制滴加速度，使两者同时加完；滴加完毕，慢慢升至室温，在25℃反应18～24h，过滤，有机层水洗后用无水硫酸镁干燥过夜，滤出干燥剂后蒸出溶剂，得到固体，用乙酸乙酯溶解后，上样硅胶层析柱(硅胶200-300目，柱高10cm，直径2cm)，以体积比5:1的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂，洗脱3个柱体积，以体积比1：1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂进行薄层层析监测，收集rf为0.4的流出液，蒸出溶剂后得到式(i)所示化合物；所述稀释剂a和稀释剂b均为二氯甲烷，用量以稀释剂a和稀释剂b总量计；所述缩合剂为1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺与1-羟基苯并三唑以物质的量之比1:1的混合；所述缚酸剂为三乙胺。
[0031]
步骤s4中，反应温度根据稀释剂的选择可以在较宽的范围下进行，优选为0～30℃
反应5小时。式(i)所示化合物与式(ⅶ)所示化合物投料物质的量之比为1:1-1.5，优选1:1；式(i)所示化合物与碱投料物质的量之比为1:1-5，优选1:2；式(i)所示化合物与稀释剂投料物质的量之比为1:30-80，优选1:35-40。
[0032]
步骤s4按如下步骤进行：在装有温度计的50ml三口烧瓶中，依次加入式(ⅶ)所示化合物，碱以及式(i)所示化合物与稀释剂，在25℃反应5h，过滤，有机层水洗后用硫酸镁干燥过夜，滤出干燥剂后蒸出溶剂，得到固体，用乙酸乙酯溶解后，上样硅胶层析柱(硅胶200-300目，柱高10cm，直径2cm)，以体积比10:1的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂，洗脱3个柱体积，以体积比1：1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂进行薄层层析监测，收集rf为0.5的流出液，蒸出溶剂后得到式(ⅱ)所示化合物；所述碱为碳酸钾；所述稀释剂为甲苯。
[0033]
上述所有中间体或目标化合物均可按照重结晶或谱分离等常规分离技术纯化。
[0034]
本发明还提供一种式(i)或式(ⅱ)所示苯甲酰胺类化合物在制备p-gp抑制剂中的应用。所述抑制剂还包括药学上可接受的盐；所述抑制剂为肿瘤多药耐药逆转剂及肿瘤转移抑制剂。
[0035]
本发明所述化合物可以与如烷化剂(如环磷酰胺或顺铂)、抗代谢药(如5-氟尿嘧啶或羟基脲)、拓扑异构酶抑制剂(如喜树碱或拓扑替康)、细胞微管抑制剂(如紫杉醇或长春碱)、dna插入剂(如阿霉素或柔红霉素)及赖氨酸激酶抑制剂(如吉非替尼)等抗肿瘤药物(临床化疗药物)的联合应用。通过和抗肿瘤药物联合，增强多药耐药肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性，从而提高化疗效果。
[0036]
本发明所述化合物的制备方法简单，产率高，经实验证明，其对表现出耐药性的癌细胞株在单独用药没有细胞毒性的浓度下，与抗肿瘤药物联合用药表现出明显的增敏效应。作为一种优选方案所述癌细胞株为人乳腺癌耐阿霉素细胞株(mcf-7/adr)，化合物i或ⅱ与盐酸阿霉素联合用药，能有效提高盐酸阿霉素的药效。
[0037]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0038]
本发明公开一种苯甲酰胺类化合物，所述化合物的制备方法简单，产率高；同时，该类化合物具有良好的生物活性，可以用于p-gp抑制剂或肿瘤多药耐药逆转剂及肿瘤转移抑制剂或生物包容性良好的生物探针，临床上可作为恶性肿瘤肿瘤多药耐药逆转剂及化疗药物增敏剂应用，拓展了苯并呋喃和四氢异喹啉类结构在肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用前景。
(四)附图说明
[0039]
图1为核磁共振氢谱图，a为式(i-7)化合物；b为式(
ⅱ‑
1)所示化合物。
(五)具体实施方式
[0040]
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
[0041]
本发明所述室温为25-30℃。
[0042]
实施例1：4-氯-n-(4-(2-(6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)-1h-吲哚-5-基)苯基)苯甲酰胺(i-7)和n-(4-(1-苄基-2-(6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)-1h-吲哚-5-基)苯基)-4-氯苯甲酰胺(
ⅱ‑
1)制备
[0043][0044][0045]
s1、在装有温度计的50ml三口烧瓶中，加入6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉盐酸盐(7.5mmol)与30ml二氯甲烷，搅拌降温至0℃，加入三乙胺(15.0mmol)和edci(7.5mmol)，控制滴加速度，使温度保持在0℃左右。滴加完毕后搅拌30min。维持体系温度在0℃，随后加入式(iii)所示5-溴-2-吲哚甲酸(7.5mmol)。慢慢升至室温，在25℃反应18～24h。用滤纸过滤，有机层水洗后用无水硫酸镁干燥过夜。滤出干燥剂后蒸出溶剂，得到淡黄固体。淡黄固体用0.2ml乙酸乙酯溶解后，上样硅胶层析柱(硅胶200-300目，柱高10cm，直径2cm)，以体积比5:1的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂，洗脱3个柱体积，以体积比1：1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂进行薄层层析监测，收集rf为0.3的流出液，蒸出溶剂后得到3.03g式(ⅳ)所示中间体，即5-溴-2-(2
’‑
h-3,4-二氢-6,7-甲氧基异喹啉)吲哚-2-甲酰胺，用于下一步反应。
[0046]
s2、在装有温度计的50ml三口烧瓶中，氮气保护下，依次加入5mmol 4-氨基苯硼酸，0.025mmol四(三苯基膦)钯，15mmol碳酸钾以及5mmol式(ⅳ)所示中间体与20ml甲苯，在85℃反应12h。过滤，有机层水洗后用硫酸镁干燥过夜。滤出干燥剂后蒸出溶剂，得到白固体。白固体用0.1ml的用乙酸乙酯溶解后，上样硅胶层析柱(硅胶200-300目，柱高10cm，直径2cm)，以体积比1:1的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂，洗脱3个柱体积，以体积比1：1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂进行薄层层析监测，收集rf为0.1的流出液，蒸出溶剂后得到2.01g式(
ⅴ
)所示中间体，用于下一步反应。
[0047]
s3、在装有温度计的50ml三口烧瓶中，加入式(
ⅴ
)所示中间体(5mmol)搅拌降温至0℃，加入2.5mmol 1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edci)、2.5mmol 1-羟基苯并三唑(hobt)与18ml二氯甲烷，滴加5mmol三乙胺。维持体系温度在0℃，同时滴加2ml的2.5mmol/l式(
ⅵ‑
1)所示4-氯苯甲酸的二氯甲烷溶液(含有5mmol 4-氯苯甲酸)。控制滴加速度，使两者同时加完。滴加完毕，慢慢升至室温，在25℃反应18～24h。滤纸过滤，有机层水洗后用无水硫酸镁干燥过夜。滤出干燥剂后蒸出溶剂，得到淡黄固体。淡黄固体用0.2ml乙酸乙酯溶解后，上样硅胶层析柱(硅胶200-300目，柱高10cm，直径2cm)，以体积比5:1的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂，洗脱3个柱体积，以体积比1：1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂进行薄层层析监测，收集rf为0.4的流出液，蒸出溶剂后得到2.53g式(i-7)所示化合物。化
合物的外观、产率及高分辨质谱数据均列于表1中，核磁氢谱结果均列于表3中，核磁共振氢谱如图1所示。
[0048]
s4、在装有温度计的50ml三口烧瓶中，依次加入5mmol式(
ⅶ‑
1)所示苄溴，10mmol碳酸钾以及5mmol式(i-7)所示化合物与20ml甲苯，在25℃反应5h。过滤，有机层水洗后用硫酸镁干燥过夜。滤出干燥剂后蒸出溶剂，得到白固体。白固体用0.2ml用乙酸乙酯溶解后，上样硅胶层析柱(硅胶200-300目，柱高10cm，直径2cm)，以体积比10:1的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂，洗脱3个柱体积，以体积比1：1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂进行薄层层析监测，收集rf为0.5的流出液，蒸出溶剂后得到3.09g的式(
ⅱ‑
1)所示化合物。化合物的外观、产率及高分辨质谱数据均列于表1中，核磁氢谱结果均列于表3中，核磁共振氢谱如图1所示。
[0049]
按照实施例1的方法，仅将式ⅵ，ⅶ所示化合物中的r按照表1，2所示进行替换，得到相应的式i，ⅱ所示化合物。上述化合物的外观、产率及高分辨质谱数据均列于表1中，核磁氢谱结果均列于表3中。由上可知，上述化合物结构正确，均为式i，ⅱ所示化合物。
[0050]
表1式i所示化合物的理化常数及高分辨质谱数据
[0051][0052][0053]
表2式ⅱ所示化合物的理化常数及高分辨质谱数据
[0054][0055]
表3式i，ⅱ所示化合物的核磁共振氢谱数据
[0056]
[0057]
[0058]
[0059]
[0060][0061]
实施例2、式i和式ⅱ所示苯甲酰胺类化合物对mcf-7/adr的细胞毒性
[0062]
细胞株：mcf-7/adr(人乳腺癌耐阿霉素细胞株，购自购自南京建成生物工程研究所有限公司)。
[0063]
受试化合物：将实施例1制备的各个化合物用二甲基亚砜(dmso)配制成5μm的受试化合物溶液。
[0064]
阳性对照药：tariquidar用dmso配制成5μm的阳性对照药溶液。
[0065]
试验方法：采用mtt(四甲基偶氮唑盐)法，进行化合物的细胞增殖活性试验。
[0066]
mcf-7/adr细胞用含10％胎牛血清的rpmi 1640培养基在37℃、5％co2饱和湿度的条件下培养至对数生长期。取对数生长期的细胞并用含10％胎牛血清的rpmi 1640培养基悬浮，以1
×
105/ml密度接种于96孔培养板中，每孔100μl，分为空白对照组、受试化合物组、阳性对照组。受试化合物组中加入不同的受试化合物，终浓度均为5μmol/l；空白对照组给予等体积的pbs；阳性对照组加入阳性对照药，终浓度均为5μmol/l。在37℃、5％co2饱和湿度的条件下培养培养48小时，加入mtt工作液，4h后离心，倾去培养液，每孔加入100μl dmso溶解，然后在酶标仪上于波长490nm处读取吸光度，计算化合物对细胞的存活率的影响。
[0067]
细胞存活率＝(试验组od平均值/对照组od平均值)
×
100％
[0068]
mtt法测定受试化合物对mcf-7/adr细胞的细胞毒作用，结果见表4。由数据可知：大部分式i和式ⅱ所示苯甲酰胺类化合物对细胞的生长抑制远低于对照药物tariquidar，没有明显的细胞毒性。
[0069]
表4式i,ⅱ所述化合物5μm测试浓度下对mcf-7/adr细胞的抑制率
[0070]
[0071][0072]
实施例3、式i和式ⅱ所示苯甲酰胺类化合物对mcf-7/adr细胞的多药耐药逆转活性研究。
[0073]
细胞株：mcf-7/adr(人乳腺癌耐阿霉素细胞株，购自购自南京建成生物工程研究所有限公司)。
[0074]
受试化合物：将实施例1制备的各个化合物用二甲基亚砜(dmso)配制成5μm的受试化合物溶液。
[0075]
阳性对照药：环孢霉素a(cyclosporin a)和tariquidar分别用dmso配制成5μm的阳性对照药溶液。
[0076]
试验方法：采用mtt(四甲基偶氮唑盐)法，进行化合物与阿霉素联合用药的细胞增殖活性试验。
[0077]
mcf-7/adr细胞用含10％小牛血清的rpmi 1640培养基在37℃、5％co2饱和湿度的条件下培养至对数生长期。取对数生长期的细胞并用含10％胎牛血清的rpmi 1640培养基悬浮，以1
×
105/ml密度接种于96孔培养板中，每孔100μl，分为空白对照组、受试化合物组、阳性对照组。受试化合物组中加入阿霉素以及不同的受试化合物，阿霉素加入终浓度为0.001，0.01，0.1，1，10μm，受试化合物加入终浓度均为5μm；阳性对照组给予阿霉素以及不同的对照药，阿霉素加入终浓度为0.001，0.01，0.1，1，10μm，阳性对照药加入终浓度为5μm；空白对照组给予等体积的pbs。在37℃、5％co2饱和湿度的条件下培养48小时，加入mtt工作液，4h后离心，倾去培养液，每孔加入100μl dmso溶解，然后在酶标仪上于波长490nm处读取光密度，计算化合物对细胞的存活率的影响。计算出与5μm式i或式ⅱ所述化合物联合用药时阿霉素对mcf-7/adr细胞的抗增殖活性ic
50
(μm)和多药耐药逆转倍数(reversal fold,rf)。
[0078]
表5式i,ⅱ所示化合物5μm对mcf-7/adr细胞的多药耐药逆转活性结果
[0079]
[0080][0081]a阿霉素与测试化合物(5μm)联合用药的ic
50
值。b逆转系数(reversal fold)＝ic
50
(adr)/ic
50
(p-gp inhibitor+adr)。c阿霉素单独用药ic
50
(adr)。
[0082]
从表5中可以看出，式i,ⅱ所示化合物普遍有较好的逆转肿瘤细胞多药耐药活性，多个超过对照药物cyclosporin a和tariquidar的活性，其中式(i-7)所示化合物与阿霉素联用的抗多药耐药肿瘤增殖活性最好，有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种式(ⅰ)或式(ⅱ)所示苯甲酰胺类化合物：式(ⅰ)或(ⅱ)中，所述r基均为一个或多个取代，所述r基各自独立为氢基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、苯氧基、苯基、硝基、三氟甲氧基、亚甲二氧基、氟、氯、溴、碘、三氟甲基、二氟甲基、甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、硝基、氰基。2.如权利要求1所述的苯甲酰胺类化合物，其特征在于，所述r各自独立为氢基、2-甲氧基、3-甲氧基、4-甲氧基、2-乙氧基、3-乙氧基、4-乙氧基、4-异丙氧基、2-甲基、3-甲基、4-甲基、2-氟、3-氟、4-氟、2-氯、3-氯、4-氯、2-溴、3-溴、4-溴、4-碘、4-氰基、4-苯基、4-硝基、2-三氟甲基、3-三氟甲基、4-三氟甲基、2-三氟甲氧基、3-三氟甲氧基、4-三氟甲氧基、3,4-二甲氧基、3,4,5-三甲氧基、3,5-二甲氧基、3,5-二三氟甲氧基。3.一种权利要求1所述苯甲酰胺类化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：s1、在稀释剂、缚酸剂和缩合剂存在下，式(ⅲ)所示化合物与6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉盐酸盐在0～100℃反应12～48小时，纯化分离得到式(ⅳ)所示中间体；所述稀释剂为惰性有机溶剂；所述缚酸剂为氢氧化钠、碳酸钾、乙醇钠、三乙胺、三甲胺、三丁胺、吡啶、n,n-二甲基苯胺、n,n-二甲基苄胺、n-甲基、n-甲基吗啉、n,n-二甲基氨基吡啶、二氮杂二环辛烷、二氮杂二环壬烯或二氮杂二环十一碳烯；所述缩合剂为二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸、三苯基磷-多卤代甲烷、三苯基磷-六氯丙酮、三苯基磷-nbs、3-酰基-2-硫噻唑啉；s2、在稀释剂、碱和催化剂存在下，式(ⅳ)所示中间体与4-氨基苯硼酸在80～160℃反应8～20小时，纯化分离得到式(
ⅴ
)所示中间体；所述稀释剂同步骤s1；所述碱为有机碱或无机碱；所述催化剂为零价或二价金属钯催化剂；s3、在稀释剂、缚酸剂和缩合剂存在下，式(
ⅴ
)所示化合物与式(ⅵ)所示化合物在0～100℃反应12～48小时，纯化分离得到式(ⅰ)化合物；所述稀释剂同步骤s1；所述缚酸剂同步骤s1；所述缩合剂同步骤s1；s4、在稀释剂、碱存在下，式(ⅰ)化合物与式(ⅶ)所示化合物在0～100℃反应3～10小
时，纯化分离得到式(ⅱ)所示化合物；所述稀释剂同步骤s1；所述碱同步骤s2；式(ⅵ)或(ⅶ)中r基均为一个或多个取代，所述r基各自独立为氢基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、苯氧基、苯基、硝基、三氟甲氧基、亚甲二氧基、氟、氯、溴、碘、三氟甲基、二氟甲基、甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、硝基、氰基；式(ⅵ)中r同式(ⅰ)中r；式(ⅶ)中r同式(ⅱ)(ⅰ)中r。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述稀释剂选自苯、甲苯、二甲苯、氯苯、二氯苯、石油醚、己烷、环己烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、乙醚、二异丙醚、二恶烷、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、丙酮、丁酮、甲基异丁酮、乙腈、、、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、n-甲基-甲酰苯胺、n-甲基吡咯烷酮、六甲基磷酰三胺、乙酸甲酯、乙酸乙酯、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、二乙二醇单甲醚或二乙二醇单乙醚；步骤s2中碱为氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、甲醇钠、乙醇钠、三甲胺、吡啶、n,n-二甲基苯胺、n,n-二甲基苄胺、n-甲基、n-甲基吗啉、n,n-二甲基氨基吡啶、二氮杂二环辛烷、二氮杂二环壬烯或二氮杂二环十一碳烯。5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤s1按如下步骤进行：在装有温度计的50ml三口烧瓶中，加入6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉盐酸盐与稀释剂，搅拌降温至0℃，加入缚酸剂和缩合剂；加完后搅拌30min，维持体系温度在0℃，同时加入式(ⅲ)所示化合物，慢慢升至室温，在25℃反应18～24h，用滤纸过滤，有机层水洗后用无水硫酸镁干燥过夜，滤出干燥剂后蒸出溶剂，得到固体，用乙酸乙酯溶解后，上样硅胶层析柱，以体积比5:1的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂，洗脱3个柱体积，以体积比1：1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂
进行薄层层析监测，收集rf为0.3的流出液，蒸出溶剂后得到式(ⅳ)所示中间体；所述稀释剂为二氯甲烷；所述缚酸剂为三乙胺；所述缩合剂为1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺；式(ⅲ)所示化合物与6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉盐酸盐投料物质的量之比为1:1-1.5；所述式(ⅲ)所示化合物与稀释剂投料物质的量之比为1:40-80；所述式(ⅲ)所示化合物与缚酸剂投料物质的量之比为1：1-3；所述式(ⅲ)所示化合物与缩合剂投料物质的量之比为1：0.5-3。6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤s2按如下步骤进行：在装有温度计的50ml三口烧瓶中，氮气保护下，依次加入4-氨基苯硼酸，催化剂，碱以及式(ⅳ)所示中间体与稀释剂，在85℃反应12h，用滤纸过滤，有机层水洗后用硫酸镁干燥过夜，滤出干燥剂后蒸出溶剂，得到固体，用乙酸乙酯溶解后，上样硅胶层析柱，以体积比1:1的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂，洗脱3个柱体积，以体积比1：1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂进行薄层层析监测，收集rf为0.1的流出液，蒸出溶剂后得到式(
ⅴ
)所示中间体；所述催化剂为四(三苯基膦)钯；所述碱为碳酸钾；所述稀释剂为甲苯；式(ⅳ)所示化合物与4-氨基苯硼酸投料物质的量之比为1:1-1.5；式(ⅳ)所示化合物与催化剂投料物质的量之比为1：0.001-0.1；式(ⅳ)所示化合物与碱投料物质的量之比为1：2-5；式(ⅳ)所示化合物与稀释剂投料物质的量之比为1:30-80。7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤s3按如下步骤进行：在装有温度计的50ml三口烧瓶中，加入式(
ⅴ
)所示中间体，搅拌降温至0℃，加入缩合剂与稀释剂a，滴加缚酸剂，维持体系温度在0℃，同时滴加式(ⅵ)所示化合物的稀释剂b溶液；控制滴加速度，使两者同时加完；滴加完毕，慢慢升至室温，在25℃反应18～24h，过滤，有机层水洗后用无水硫酸镁干燥过夜，滤出干燥剂后蒸出溶剂，得到固体，用乙酸乙酯溶解后，上样硅胶层析柱，以体积比5:1的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂，洗脱3个柱体积，以体积比1：1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂进行薄层层析监测，收集rf为0.4的流出液，蒸出溶剂后得到式(ⅰ)所示化合物；所述稀释剂a和稀释剂b均为二氯甲烷，用量以稀释剂a和稀释剂b总量计；所述缩合剂为1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺与1-羟基苯并三唑以物质的量之比1:1的混合；所述缚酸剂为三乙胺；式(
ⅴ
)所示中间体与缩合剂投料物质的量之比为1:0.2-1；式(
ⅴ
)所示中间体与稀释剂投料物质的量之比为1:40-80；式(
ⅴ
)所示中间体与缚酸剂投料物质的量之比为1:1-3；式(
ⅴ
)所示中间体与式(ⅵ)所示化合物投料物质的量之比为1:1-1.5。8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤s4按如下步骤进行：在装有温度计的50ml三口烧瓶中，依次加入式(ⅶ)所示化合物，碱以及式(ⅰ)所示化合物与稀释剂，在25℃反应5h，过滤，有机层水洗后用硫酸镁干燥过夜，滤出干燥剂后蒸出溶剂，得到固体，用乙酸乙酯溶解后，上样硅胶层析柱，以体积比10:1的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂，洗脱3个柱体积，以体积比1：1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂进行薄层层析监测，收集rf为0.5的流出液，蒸出溶剂后得到式(ⅱ)所示化合物；所述碱为碳酸钾；所述稀释剂为甲苯；式(ⅰ)所示化合物与式(ⅶ)所示化合物投料物质的量之比为1:1-1.5；式(ⅰ)所示化合物与碱投料物质的量之比为1:1-5；式(ⅰ)所示化合物与稀释剂投料物质的量之比为1:30-80。9.一种权利要求1所述苯甲酰胺类化合物在制备p-gp抑制剂中的应用。10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为肿瘤多药耐药逆转剂及肿瘤转移抑制剂。

技术总结

本发明公开了一种苯甲酰胺类化合物及其制备方法和应用，该类化合物的结构通式如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示，所述化合物的制备方法简单，产率高；同时，该类化合物具有良好的生物活性，可以用于P-gp抑制剂或肿瘤多药耐药逆转剂及肿瘤转移抑制剂或生物包容性良好的生物探针，临床上可作为恶性肿瘤多药耐药逆转剂及化疗药物增敏剂应用，拓展了苯并呋喃和四氢异喹啉类结构在肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用前景。类结构在肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用前景。类结构在肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用前景。