中国对虾雌性特异性基因及其检测引物和应用的制作方法

1.本发明属于海洋虾类性别鉴定技术，具体涉及中国对虾雌性特异性基因及其检测引物和应用。

背景技术：

2.中国对虾(fenneropenaeus chinensis)属节肢动物门(arthropoda)、甲壳纲(crustacea)、十足目(decapoda)、对虾科(penaeidae)，又称东方对虾，俗称对虾、明虾，主要分布于黄渤海(包括朝鲜西岸)以及东海北部的嵊泗列岛和舟山岛一带，是我国最具代表性的海水经济养殖动物之一，并在国际市场上享有较高的声誉。中国对虾属广温、广盐性、一年生暖水性大型洄游虾类，在黄、渤海区有明显的洄游习性，分为越冬洄游和生殖洄游，其产卵期在4～6月间，怀卵量30～100万粒。近年来中国对虾的年养殖产量稳定在4-5万吨，养殖区域主要分布在长江以北的江苏、山东、天津、河北和辽宁等黄渤海沿岸地区。
3.目前，中国对虾主要通过外观辨别雌雄。性成熟的雌虾体长在18cm～23cm，体重60g～80g，呈青绿；成熟的雄虾体长在13cm～17cm，体重30g～40g，呈黄褐；雌虾平均体重比雄虾重一倍以上，因而其市场价值也大大高于雄性个体。并且中国对虾上市规格、等级的不同，也会极大地影响养殖经济效益。因此，建立中国对虾单性育种和养殖技术，将有助于提高养殖产量，增加渔民收入。但是，中国对虾幼虾特别是发育早期的幼体很难通过外观辨别雌雄，也尚无通过分子技术对中国对虾进行性别鉴定的方法，这极大阻碍了其单性育种和养殖产业的发展。
4.研究表明中国对虾性别决定类型为zw型，即雌性为zw型，而雄性为zz型。中国对虾已发布的参考基因组是基于雄性个体进行组装。本发明根据雌雄中国对虾重测序数据，组装了雌性w染体特异序列，并基于该特异序列开发了雌性特异性引物。

技术实现要素：

5.本发明提供了中国对虾雌性特异性基因及其检测引物和应用，其能够大规模快速准确地鉴定生长各种时期，尤其是发育早期的中国对虾的遗传性别。
6.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
7.本发明提供了中国对虾雌性特异性基因，其核苷酸序列如seq id no.6所示。
8.本发明还提供了中国对虾雌性特异性引物，用于检测所述的中国对虾雌性特异性基因，其核苷酸序列为：
9.female-specific-f：5
’‑
tggatgcagcaggattaagga-3’；
10.female-specific-r：5
’‑
acacacccatctctagcagg-3’。
11.本发明还提供了一种用于鉴定中国对虾遗传性别的试剂盒，所述试剂盒中包含权利要求2所述的中国对虾雌性特异性引物。
12.本发明还提供了所述的中国对虾雌性特异性引物在鉴定中国对虾遗传性别中的应用。
13.本发明还提供了一种鉴定中国对虾遗传性别的方法，所述方法包括利用所述的中国对虾雌性特异性引物进行检测的步骤。
14.进一步的，所述步骤具体为：提取中国对虾待测样本的基因组dna作为模板，利用权利要求2所述的中国对虾雌性特异性引物对模板进行pcr扩增；如果扩增产物出现大小分别为378bp和220bp的两条条带，则待测样本为雌性中国对虾，如果扩增产物仅出现一条大小为378bp的条带，则待测样本为雄性中国对虾。
15.进一步的，所述378bp的扩增条带对应的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述220bp的扩增条带为特异性扩增条带，其对应的核苷酸序列如seq id no.6所示。
16.进一步的，为了避免由模板出现问题而造成的鉴定结果误判，在利用所述的中国对虾雌性特异性引物对模板进行pcr扩增时，同时利用对照引物对模板进行pcr扩增；所述对照引物的核苷酸序列为：
17.control-f:5
’‑
agcgaaggatagagacgagc-3’；
18.control-r:5
’‑
aggcgagagaacaagaacga-3’。
19.进一步的，若利用对照引物扩增模板得到pcr产物，经电泳后出现一条大小为378bp的条带，则判定基因组dna模板不存在问题；若经电泳后得不到大小为378bp的条带，则判定基因组dna模板存在问题。
20.进一步的，所述pcr扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，重复35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
21.进一步的，所述pcr扩增体系包括7.5μl 2
×
taq pcr mix、上下游引物各0.3μl、dna模板1μl，补足灭菌双蒸水至15μl。
22.进一步的，所述中国对虾待测样本为中国对虾发育早期的幼体、中国对虾仔虾、中国对虾成虾的活体或冻存样本。
23.本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
24.本发明设计的中国对虾雌性特异性引物对中国对虾的遗传性别鉴定具有很强的特异性。所述特异性引物对以及相应的中国对虾遗传性别鉴定方法能够快速准确对不同时期的中国对虾进行鉴定，且鉴定方法简单有效，只需通过对扩增产物的电泳结果进行观察即可，当扩增产物出现220bp的特异性扩增条带和378bp的扩增条带判定为雌性中国对虾，当扩增产物仅出现378bp的扩增条带时判定为雄性中国对虾。并且，本发明的鉴定方法不局限于中国对虾的发育时期，尤其是能够在发育初期进行性别鉴别，克服了现在无法对中国对虾幼体进行性别鉴定的缺陷，而且无论是对虾的活体或者冻存样本也都能进行性别鉴定，因此本发明的使用范围广。本发明还设计了一对内参引物，将其同时与特异性异物一起扩增，即可简单的判断作为模板的基因组dna是否存在问题，避免对鉴定结果的误判，提高鉴定的正确率。本发明不仅拓展了中国对虾遗传性鉴定的方法，并且非常有利于中国对虾单性育种和养殖产业的发展。
附图说明
25.图1是基于本发明对20尾已知性别的“黄海1号”中国对虾遗传性别鉴定的凝胶电泳图；其中m为marker，左侧为雌性中国对虾，右侧为雄性中国对虾。
26.图2是基于本发明对12尾已知性别的海捕野生中国对虾遗传性别鉴定的凝胶电泳
图；其中m为marker，左侧为雌性中国对虾，右侧为雄性中国对虾。
具体实施方式
27.结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
28.实施例1
29.根据雌性中国对虾特异的dna片段为目标序列，设计了一对中国对虾雌性特异性引物(female-specific-f/female-specific-r)，其核苷酸序列如下：female-specific-f：5
’‑
tggatgcagcaggattaagga-3’(seq id no.1)；female-specific-r：5
’‑
acacacccatctctagcagg-3’(seq id no.2)。
30.为了避免由于模板问题出现的未扩增出条带的情况，造成结果的误判，本发明还设计了一对内参引物作为对照，其核苷酸序列如下：
31.control-f：5
’‑
agcgaaggatagagacgagc-3’(seq id no.3)；
32.control-r：5
’‑
aggcgagagaacaagaacga-3’(seq id no.4)。
33.实施例2
34.本实施例利用中国对虾活体样本对实施例1的引物的特异性进行实验验证。
35.供试样本：20尾已知性别的“黄海1号”中国对虾活体，其中雌雄各10尾。
36.1、取供试样本的肌肉组织，提取基因组dna，测定浓度后稀释至100ng/μl；
37.所述基因组dna的提取方法为：将样本的肌肉组织在裂解液中进行匀浆；加入蛋白酶k消化组织，在55℃水浴锅中消化至澄清；采用标准的酚-氯仿抽提法或者使用商业试剂盒提取dna。
38.2、以步骤1得到的基因组dna为模板，进行pcr扩增；其中，pcr扩增采用的中国对虾雌性特异性引物对的序列如下：
39.female-specific-f：5
’‑
tggatgcagcaggattaagga-3’(seq id no.1)；
40.female-specific-r：5
’‑
acacacccatctctagcagg-3’(seq id no.2)；
41.pcr扩增采用的对照引物对的序列如下：
42.control-f：5
’‑
agcgaaggatagagacgagc-3’(seq id no.3)；
43.control-r：5
’‑
aggcgagagaacaagaacga-3’(seq id no.4)。
44.pcr扩增采用的反应体系为15μl，包括7.5μl 2
×
taq pcr mix(含dntps、taq dna聚合酶、mgcl2、反应缓冲液)、pcr对照或雌性特异性上下游引物各0.3μl、dna模板1μl，补足灭菌双蒸水至15μl；
45.pcr扩增采用的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，重复35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
46.3、完成pcr扩增后，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，并将部分产物送去测序。
47.电泳结果见图1，利用本发明设计的引物，在雌性中国对虾样本中扩增得到大小分别为378bp和220bp的dna片段(两条条带)，经测序，其核苷酸序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示，而在雄性中国对虾样本中扩增仅得到大小为378bp的的dna片段(一条条带)。
表明该引物是雌性中国对虾特有的，可用于鉴定中国对虾的性别。
48.实施例3
49.本实施例利用中国对虾冻存样本对实施例1的引物的特异性进行实验验证。
50.供试样本：12尾已知性别的海捕野生中国对虾冻存样本，其中雌雄各6尾。
51.实施步骤和实验条件与实施例2相同。
52.电泳结果见图2，利用本发明设计的引物，在雌性中国对虾的6个样本中均扩增出了两条大小分别为378bp和220bp的条带，而在雄性中国对虾的6个样本中均只扩增出了大小为378bp的的条带。表明核苷酸序列如seq id no.6所示的dna片段是中国对虾雌性特异性基因。
53.由上述的结果说明，本发明实施例中得到的中国对虾雌性特异性基因及其引物(female-specific-f/female-specific-r)的特异性强，利用所述特异性引物以及相应的pcr检测方法能够快速、准确的对中国对虾活体或者冻存样本进行性别鉴定，并且操作简单，且不局限于中国对虾的发育时期，甚至是中国对虾发育早期的幼体也可以通过本发明的特异性引物鉴定出性别。
54.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

技术特征：

1.中国对虾雌性特异性基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.6所示。2.中国对虾雌性特异性引物，其特征在于，用于检测权利要求1所述的中国对虾雌性特异性基因，其核苷酸序列为：female-specific-f：5
’‑
tggatgcagcaggattaagga-3’；female-specific-r：5
’‑
acacacccatctctagcagg-3’。3.一种用于鉴定中国对虾遗传性别的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求2所述的中国对虾雌性特异性引物。4.权利要求2所述的中国对虾雌性特异性引物在鉴定中国对虾遗传性别中的应用。5.一种鉴定中国对虾遗传性别的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求2所述的中国对虾雌性特异性引物进行检测的步骤。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤具体为：提取中国对虾待测样本的基因组dna作为模板，利用权利要求2所述的中国对虾雌性特异性引物对模板进行pcr扩增；如果扩增产物出现大小分别为378bp和220bp的两条条带，则待测样本为雌性中国对虾，如果扩增产物仅出现一条大小为378bp的条带，则待测样本为雄性中国对虾。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述378bp的扩增条带对应的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述220bp的扩增条带对应的核苷酸序列如seq id no.6所示。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在利用权利要求2所述的中国对虾雌性特异性引物对模板进行pcr扩增时，同时利用对照引物对模板进行pcr扩增；所述对照引物的核苷酸序列为：control-f:5
’‑
agcgaaggatagagacgagc-3’；control-r:5
’‑
aggcgagagaacaagaacga-3’。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，重复35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述中国对虾待测样本为中国对虾发育早期的幼体、中国对虾仔虾、中国对虾成虾的活体或冻存样本。

技术总结

本发明公开了中国对虾雌性特异性基因及其检测引物和应用。所述特异性基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，用于检测的特异性引物的序列为：Female-specific-F：5

技术研发人员：

王琼 何玉英 任宪云 吕建建 王佳佳 刘萍 李健

受保护的技术使用者：

中国水产科学研究院黄海水产研究所

技术研发日：

2022.08.04

技术公布日：

2023/2/27