戊糖乳杆菌CQZC02及其在制备肝损伤药物中的应用

戊糖乳杆菌cqzc02及其在制备肝损伤药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及微生物学技术领域，特别是涉及戊糖乳杆菌cqzc02及其在制备肝损伤药物中的应用。

背景技术：

2.肝脏主要有分泌胆汁、储藏糖原、解毒和造血的作用，因此被认为是人体重要的解毒器官。药物、毒物、不规律的饮食、过度的饮酒等多种因素可对肝脏的健康造成威胁。其中，过度的饮酒是导致全球可预防疾病发病率和死亡率高的第五大原因。在饮酒后，通过肝脏的氧化作用代谢酒精，乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶作为两大关键酶在此过程中起着重要的作用。首先，在乙醇脱氢酶的作用下，通过乙醇脱氢酶系统、微粒体乙醇氧化酶系统和过氧化氢酶系统三种路径将乙醇氧化为乙醛，此过程中辅酶nad
+
还原为nadh，nadh/nad
+
的比值升高，进而抑制脂肪分解，积累甘油三酯，破坏肝细胞的正常功能。除此之外，乙醛作为一种高反应性和高毒性的分子，可以与磷脂、氨基酸残基和巯基结合从而导致脂质过氧化，产生氧自由基，使机体生物防御能力降低。之后，乙醛通过乙醛脱氢酶的氧化作用，氧化为乙酸，乙酸以乙酰coa的形式进入三羧酸循环，从而生成对机体无害的co2和h2o。由于人体或者消化道内微生物源的乙醇脱氢酶发挥作用，快速将乙醇氧化为乙醛，但是乙醛脱氢酶无法及时将乙醛氧化为乙酸，造成乙醛的大量积累而损伤肝脏。由此可见，过度饮酒是酒精性肝病(ald)发展的重要原因。
3.乳酸菌是食品工业中被广泛用作益生菌的微生物，具有预防腹泻、抗过敏和调节免疫系统等多种生理功能。在之前的研究中发现，乳杆菌mg590通过提升乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的含量来降低血中酒精浓度。根据另一项研究表明，在高脂血症小鼠中，乳酸菌具有降血脂和抗氧化的特性，通过调节酒精引起的肠道微生物生态系统失调从而保护肝脏。鼠李糖乳杆菌是乳酸菌的一种，它可以减少肝脏脂肪酸的含量，抑制促炎细菌的产物和内毒素的释放，显著抑制甘油三酯和胆固醇水平的升高，减少氧化应激并恢复肠道菌，对酒精性肝损伤有保护作用。经gany，chen x等人研究发现，利用乳酸菌来改善酒精性肝损伤，其机制主要是降低tnf-α、il-6、il-1β水平，通过降低mda水平，提高sod活性，调节keep-nrf2-are信号通路来改善酒精性肝损伤。目前，关于乳酸菌对于酒精性肝损伤的保护作用已有研究，但是，关于戊糖乳杆菌对于酒精性肝损伤的保护作用鲜有报道。

技术实现要素：

4.本发明的目的是提供戊糖乳杆菌cqzc02及其在制备肝损伤药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明发现戊糖乳杆菌cqzc02(lp-cqzc02)通过抑制小鼠体重的下降，缓解肝重和肝脏指数的上升，促进酒精的代谢、减轻炎症状况、加速脂质代谢、减少脂肪的合成，并上调抗氧化水平来改善肝脏的受损伤情况。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一株戊糖乳杆菌(lactobacilluspentosus)，命名为lp-cqzc02，所述
戊糖乳杆菌于2020年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.20177。
7.本发明提供上述的戊糖乳杆菌cqzc02在分解乙醇中的应用。
8.本发明还提供上述的戊糖乳杆菌cqzc02在制备肝损伤的药物中的应用。
9.优选的是，所述肝损伤为乙醇诱导的肝损伤。
10.本发明还提供上述的戊糖乳杆菌cqzc02在制备调节炎症反应的药物中的应用。
11.优选的是，所述炎症反应为乙醇诱导的炎症反应。
12.本发明还提供上述的戊糖乳杆菌cqzc02在制备加速脂质代谢、减少脂肪合成的药物中的应用。
13.本发明公开了以下技术效果：
14.本发明通过实验证实，戊糖乳杆菌lp-cqzc02通过抑制小鼠体重的下降，缓解肝重和肝脏指数的上升，促进酒精的代谢、减轻炎症状况、加速脂质代谢、减少脂肪的合成，并上调抗氧化水平来改善肝脏的受损伤情况。综上所述，lp-cqzc02对酒精性肝损伤具有明显的保护作用。本发明为今后开发与lp-cqzc02相关的功能性食品以预防并缓解酒精性肝损伤提供了基础。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1为戊糖乳杆菌lp-cqzc02菌株菌落形态；
17.图2为戊糖乳杆菌lp-cqzc02菌株革兰氏染情况。
18.图3为光镜下各组小鼠肝组织的病理改变；
19.图4为小鼠血清adh和aldh的含量；
20.图5为小鼠肝脏adh和aldh的含量；
21.图6为小鼠血清alt和ast的含量；
22.图7为小鼠血清il-1β、il-6、tnf-α、ifn-γ和il-10的含量；
23.图8为小鼠血清tc、tg和ins的含量；
24.图9为小鼠肝脏tc和tg的含量；
25.图10为小鼠血清mda、sod、ros、gsh和cat的含量；
26.图11为小鼠肝脏sod、gsh、cat和mda的含量；
27.图12为nrf-2、nqo1、ho-1、sod1的mrna表达含量；
28.图13为sod2、ppar-γ的mrna表达含量；
29.图14为cat、adh1、aldh1a1、aldh2的mrna表达含量；
30.图15为gsh、gclc、cpt1a、cpt1b的mrna表达含量；
31.图16为hnf4-α、il-10的mrna表达含量；
32.图17为il-6、tnf-α、fas、srebp-1c的mrna表达含量；
33.图18为ifn-γ和il-1β的mrna表达含量；
具体实施方式
34.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
35.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
36.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
37.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
38.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
39.实施例1戊糖乳杆菌lp-cqzc02的获取
40.一、实验材料
41.采自重庆涪陵的家庭自制榨菜腌制水，无菌勺子充分搅匀腌制水后，用无菌注射器吸取50ml到已灭菌的离心管中，装入低温食品采样箱内带回实验室冷冻保藏于-80℃的超低温冰箱中备用。
42.二、实验方法
43.1.乳酸菌的分离与鉴定
44.1.1乳酸菌的分离纯化
45.分别取1ml腌制水样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-6
，然后取10-4
、10-5
、10-6
3个梯度的菌液100μl进行平板涂布，37℃培养24-48h，观察并记录菌落形态。挑取平板上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48h后，再次挑取平板上不同形态的单菌落进行划线分离，如此重复多次，直至得到形态一致的纯的单菌落。
46.1.2乳酸菌的初步鉴定
47.挑取平板上的纯菌落接种于5ml mrs液体培养基中，37℃培养24h。取上述含菌培养基1ml于无菌离心管中，4000r/min离心10min后弃去上层培养基，菌体沉淀重悬于无菌生理盐水并进行革兰氏染镜检，革兰氏染镜检为阳性的初步鉴定为乳酸菌。
48.1.3乳酸菌dna提取
49.将已纯的疑似目标菌株接种于mrs肉汤中，37℃培养18-24h后，采用细菌基因组dna提取试剂盒进行dna提取。将提取完成的dna做好编号，放于-20℃冰柜保藏备用。
50.1.4基因组dnapcr扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
51.提取完的dna进行pcr扩增，其中上游引物27f(5'－aga gtt tga tcc tggctcag－
3')1μl、下游引物1495r(5'－ctacgg ctaccttgt tac ga－3')1μl，2
×
taqplus buffer 12.5μl、模板dna 1μl，用无菌ddh2o将体系补足至25μl。并以无菌超纯水替代模板dna作为阴性对照。扩增条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共29个循环，最后72℃延伸5min。
52.然后取5μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖浓度为1.2％，电泳条件为110v，45min。将检测成功的pcr产物送往韩国macrogen集团公司进行测序，测序成功的序列使用ncbi中的blast(basic local alignment search tool)程序进行比对分析。
53.1.5乳酸菌体外抗性筛选
54.1.5.1乳酸菌耐受0.3％胆盐的能力
55.在mrs-thio培养基(含0.2％巯基乙酸钠的mrs肉汤)中添加猪胆盐使其浓度为0.3％，121℃灭菌15min，将活化好的5ml菌种以2％(v/v)的接种量分别接入不含胆盐(0.0％)的mrs-thio培养基和含0.3％胆盐的mrs-thio培养基中，以空白培养基(未接菌的mrs-thio培养基)为对照，37℃培养24h后，分别测定上述不同浓度培养基的od
600nm
值，按公式1计算菌株对胆盐的耐受力：
[0056][0057]
1.5.2人工胃液耐受性试验
[0058]
人工胃液的配制：人工胃液由0.2％nacl和0.35％胃蛋白酶组成，按照对应的质量体积比分别称取试验所需nacl和胃蛋白酶进行配制，用1mol/l的hcl将配制好的人工胃液ph调整为3.0，再用0.22μm的滤膜过滤除菌备用。
[0059]
在超净工作台中吸取5ml培养好的含菌培养基于10ml无菌离心管中，经3000r/min离心10min，弃去上层培养基并收集菌体，加入等体积(5ml)无菌生理盐水混匀制成菌悬液，然后取1ml菌悬液与9mlph 3.0的人工胃液混匀，此时取1ml上述混合液作为人工胃液处理0h的样品，剩余9ml混合液置于恒温水浴摇床(37℃，150r/min)中培养3h。0h和3h的样品分别经10倍梯度稀释，选择合适梯度采用平板涂布的方法测定活菌数，在mrs固体培养基上37℃培养48h，按公式2计算存活率(％)
[0060][0061]
2.样品中乳酸菌的测定结果
[0062]
从样品中分离纯化出的一株乳酸菌，革兰氏染呈现阳性。通过形态学观察和16srdna种属分析可鉴定为乳酸杆菌，编号cqzc02。
[0063]
本发明的戊糖乳杆菌cqzc02于2020年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.20177。
[0064]
2.1乳酸杆菌菌落形态及细胞形态
[0065]
如图1所示，乳酸菌菌落颜多为白或乳白，形状为圆形，边缘整齐，表面湿润光滑。
[0066]
在100倍油镜下，乳酸菌菌株细胞形态如图2所示，细胞形态有长杆、短杆、球状，且不存在出芽生殖。
[0067]
2.2乳酸菌16s rdna分析结果
[0068]
如表1所示，经blast程序比对分析表明，cqzc02为lactobacillus pentosus，且与gene bank数据库中已知乳酸菌的同源性均达99％以上。
[0069]
表1株菌的16s rdna序列分析结果
[0070][0071]
2.3 cqzc02体外抗性结果
[0072]
由表2可知，cqzc02在ph 3.0人工胃液中的存活率接近90％；cqzc02在0.3％胆盐中的存活率超过50％，表明其具有较强的耐受胃酸和胆盐能力。
[0073]
表2 cqzc02在ph 3.0人工胃液及0.3％胆盐中的存活率
[0074][0075]
实施例2 lp-cqzc02在乙醇中的存活率和体外分解乙醇的能力
[0076]
将无水乙醇用22μm滤膜过滤后加入到5ml已灭菌后的mrs液体培养基中，乙醇添加量为8％(v/v)。向mrs培养基中接入200μl活化好的lp-cqzc02，并在0h时用平板计数法计算活菌数，培养24h后再次计算活菌数。
[0077]
存活率(％)＝[24h时活菌数(cfu/ml)/0h时活菌数(cfu/ml)]
×
100％公式3
[0078]
按照标准配制重铬酸钾-硫酸溶液和乙醇标准溶液。将1.0ml重铬酸钾-硫酸溶液加入装有体积浓度分别为0％，2％，4％，6％，8％，10％的乙醇标准溶液中，充分摇匀，于沸水浴中加热10min，使乙醇充分挥发，并被重铬酸钾-硫酸溶液氧化，在610nm波长处测定重铬酸钾-硫酸溶液的吸光度值。以乙醇体积浓度(v/v)为横坐标，吸光度为纵坐标，制作乙醇标准曲线。
[0079]
以mrs液体培养基为溶剂，配制乙醇浓度(v/v)为10％、20％的mrs乙醇培养液，现配现用。接取200μl的lp-cqzc02加入到不同浓度的含10％和20％乙醇的mrs液体培养基中，37℃培养24h后，以未加入乳酸菌的含乙醇培养基为对照，利用重铬酸钾-浓硫酸标准曲线，测定乙醇残留量，比较各乳酸菌对酒精的分解能力。
[0080]
表3 lp-cqzc02在酒精中的存活率
[0081][0082]
如表3可知，将戊糖乳杆菌lp-cqzc02梯度稀释，分别在0小时和24小时时记录菌落数，运用公式3计算lp-cqzc02在酒精中的存活率。根据结果，lp-cqzc02在酒精中的存活率较高，为71.00％，所以将lp-cqzc02作为保护酒精性肝损伤小鼠的乳酸菌。
[0083]
表4 lp-cqzc02体外分解乙醇的能力
[0084][0085]
如表4所示，加入lp-cqzc02后，酒精剩余量明显降低(p＜0.05)。在酒精浓度分别为10％和20％时，lp-cqzc02分别降解了mrs液体培养基中53.04％和43.46％的乙醇含量，说明lp-cqzc02分解乙醇的能力显著。
[0086]
实施例3lp-cqzc02对酒精性肝损伤小鼠体重变化、肝重和肝脏指数的影响
[0087]
1、动物实验
[0088]
1.1健康icr小鼠50只(重庆医科大学实验动物中心)，雄性，3周龄，体重为18～25g，每五只小鼠放在同一个笼子中，保持温度为(25
±
2)℃、相对湿度为(50
±
5)％，维持常规的昼夜节律。在提供标准饲料和饮水，进行适应性喂养7天的基础上，将50只小鼠随机分为正常组、酒精模型组、药物组、保加利亚乳杆菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心)组、戊糖乳杆菌lp-cqzc02组，每组10只。
[0089]
1.2药物组灌胃异甘草酸镁30(mg/kg.bw)，保加利亚乳杆菌组灌胃(1
×
109cfu/ml)保加利亚乳杆菌，戊糖乳杆菌lp-cqzc02组灌胃(1
×
109cfu/ml)戊糖乳杆菌lp-cqzc02，正常组和酒精模型组灌胃等体积的蒸馏水。在整个实验周期，早上灌胃蒸馏水、药物和益生菌，下午灌胃5g/kg bw酒精溶液，小鼠正常饮水和自由进食，连续28天。
[0090]
1.3每天记录小鼠体重。灌胃周期最后一天，记录小鼠的体重后取血样和组织，将血清于4℃条件下离心，取上层血清。
[0091]
1.4取血后断颈使小鼠完全死亡，立即解剖并完整地取出肝脏并称重，再将每组10个肝脏于质量分数为10％的中性甲醛溶液中固定24小时，通过乙醇脱水后，用石蜡包埋肝脏组织，待其凝固后，切成约5μm的常规切片，脱蜡水化，用苏木素-伊红染(h&e染)进行形态学病理检查。在光学显微镜下观察肝组织的状况，并拍照记录如图3所示。其余肝脏于-80℃超低温冰箱保存，待后续试验使用。
[0092]
运用公式4计算肝脏指数：
[0093]
肝脏指数(％)＝[肝脏重量(g)/小鼠体重(g)]
×
100％公式4
[0094]
如图3所示，分别代表的是正常组、酒精模型组、药物组、保加利亚乳杆菌组和lp-cqzc02组的肝组织h&e切片染后在显微镜下的状况，观察其损伤程度，进一步研究戊糖乳杆菌lp-cqzc02对酒精性肝损伤小鼠的保护作用。正常组小鼠肝细胞以中央静脉为中心，呈放射状排列，结构完整。细胞质均匀排列，细胞核大、明显且呈椭圆形，边界清晰，并染呈蓝。用酒精处理后，模型组、药物组、保加利亚乳杆菌组和lp-cqzc02组的小鼠肝细胞均在不同程度上变性和坏死。其中，模型组小鼠肝细胞损伤最为严重，部分细胞处于裂解状态且混浊肿胀，受到严重损伤的区域发生严重浸润。细胞排列紊乱，细胞质疏松化，细胞核边界不清晰，并且溶解、固缩、颜变深。其他四组小鼠的肝细胞均在不同程度上得到了保护，肝细胞结构较为完整，排列较为整齐，坏死数量减少，炎症细胞浸润情况得到改善，以中央静脉为中心呈现出轻度水肿。其中以lp-cqzc02组小鼠肝细胞损伤程度得到了最大的改善。由
实验可知，lp-cqzc02可以缓解酒精对小鼠肝脏的病理学损伤。
[0095]
表5实验小鼠体重、肝重和肝脏指数
[0096]
组别肝重/g体重/g肝脏指数正常组1.31
±
0.26c36.24
±
1.17a3.51
±
0.03c酒精模型组1.79
±
0.11a27.42
±
1.23c5.92
±
0.24a药物组1.54
±
0.06b31.61
±
0.28b4.16
±
0.25b保加利亚乳杆菌1.55
±
0.12b32.98
±
0.72b4.32
±
0.14blp-cqzc02组1.40
±
0.11c35.66
±
1.10a3.78
±
9.94c[0097]
由表5可知：酒精模型组小鼠体重显著低于正常组，药物组、保加利亚乳杆菌组和lp-cqzc02组的小鼠体重略低于正常组，并且lp-cqzc02组小鼠体重最接近正常组，lp-cqzc02显著地抑制了小鼠体重的降低(p＜0.05)。酒精模型组小鼠肝重和肝脏指数明显高于正常组，药物组、保加利亚乳杆菌组和lp-cqzc02组小鼠肝重和肝脏指数高于正常组，并且lp-cqzc02组小鼠肝重和肝脏指数最接近正常组，lp-cqzc02显著地缓解了小鼠肝重和肝脏指数的上升(p＜0.05)。说明药物、保加利亚和lp-cqzc02可缓解由酒精引起的肝脏损伤的现象，并且lp-cqzc02对肝脏损伤的缓解效果最显著。
[0098]
实施例4血清和肝脏指标测定
[0099]
1、利用实施例3中1.3所获得的血清进行以下实验：
[0100]
1.1根据elisa试剂盒说明书中的方法测定小鼠血清adh、aldh、il-1β、il-6、tnf-α、ifn-γ、il-10、ins、tc和tg的水平。
[0101]
1.2根据elisa试剂盒说明书中的方法测定小鼠肝脏adh、aldh、tc和tg的水平。
[0102]
1.3根据生化试剂盒说明书中的方法测定小鼠血清ast、alt、ros、sod、cat、gsh和mda的水平。
[0103]
1.4根据生化试剂盒说明书中的方法测定小鼠肝脏sod、cat、gsh和mda的水平。
[0104]
2、数据处理
[0105]
运用spss 25.0软件对实验数据进行统计学处理并绘图后进行分析，结果以平均值
±
标准差表示。显著性水平为0.05，当p＜0.05的时候，表示实验数据有统计学意义。不同字母a-e表示平均值有显著性差异(p《0.05)。
[0106]
如图4和图5所示，酒精模型组小鼠血清中adh和aldh含量分别为6.36miu/l和5.82miu/l，lp-cqzc02组小鼠血清中的adh和aldh含量分别为19.22miu/l和14.80miu/l。酒精模型组小鼠肝脏中adh和aldh含量分别为12.98u/mgprot和9.56u/mgprot，lp-cqzc02组小鼠肝脏中的adh和aldh含量分别为59.33u/mgprot和30.33u/mgprot。实验结果表明，药物组、保加利亚乳杆菌组和lp-cqzc02组血清和肝脏中的adh和aldh含量都高于酒精模型组，其中，lp-cqzc02组含量最高，达到显著性水平(p＜0.05)。血清adh和aldh的含量相比于酒精模型组上升了2.02倍和1.55倍，肝脏adh和aldh的含量相比于酒精模型组上升了3.57倍和2.17倍。表明lp-cqzc02加速小鼠肝脏酒精代谢的效果最明显。
[0107]
如图6所示，酒精模型组的alt和ast含量分别为112.12u/l和108.82u/l，lp-cqzc02处理后，alt和ast含量分别为59.91u/l和47.27u/l。实验结果表明，与酒精模型组相比，lp-cqzc02在不同程度上缓解了alt和ast活性的升高，alt和ast活性分别下降了46.56％和56.56％。药物组和保加利亚乳杆菌组也有同样的趋势，但是lp-cqzc02组效果更
显著(p＜0.05)。由此可见，戊糖乳杆菌lp-cqzc02可以有效缓解酒精性肝损伤，对受到损伤的肝脏进行保护。
[0108]
如图7所示，酒精模型组的il-1β、il-6、tnf-α和ifn-γ含量分别为117.52pg/ml、107.15pg/ml、432.25pg/ml和1218.23pg/ml，lp-cqzc02处理后，il-1β、il-6、tnf-α、ifn-γ含量分别为58.05pg/ml、40.38pg/ml、213.91pg/ml和604.94pg/ml。il-1β、il-6、tnf-α、ifn-γ四种炎症因子介导的反应中，药物组、保加利亚乳杆菌组和lp-cqzc02组中四个炎症因子的含量均低于酒精模型组，其中，lp-cqzc02组的含量最低，达到显著性水平(p＜0.05)，il-1β、il-6、tnf-α和ifn-γ水平分别下降了50.60％、62.31％、50.51％和50.34％。在抗炎症因子il-10介导的反应中，酒精模型组含量最低，lp-cqzc02组缓解了il-10含量的降低，酒精模型组和lp-cqzc02组il-10含量分别为284.03pg/ml和873.15pg/ml，lp-cqzc02组il-10水平显著上升(p＜0.05)，上升了2.07倍。药物组和保加利亚乳杆菌组也有同样的趋势，但是lp-cqzc02组效果更显著。由此可见，过量饮酒会导致炎症因子的释放，对肝脏造成损伤。同时，抗炎症因子的分泌会对肝脏进行保护。
[0109]
如图8和图9所示，酒精模型组小鼠血清中tc和tg的含量分别为18.01mmol/ml和13.22mmol/ml，lp-cqzc02组小鼠血清中的tc和tg含量分别为8.47mmol/ml、5.92mmol/ml。与酒精模型组相比，药物组和保加利亚乳杆菌组tc和tg水平虽然也呈下降期趋势，但是lp-cqzc02组效果更显著(p＜0.05)，分别下降了52.96％、55.26％。酒精模型组小鼠血清中ins含量为3.18mu/l，lp-cqzc02组ins含量为11.01mu/l，经lp-cqzc02处理后，小鼠血清中ins的含量上升了2.46倍。此外，酒精模型组小鼠肝脏中tc和tg含量分别为7.20mg/g和54.04mg/g，lp-cqzc02组小鼠肝脏中的tc和tg含量分别为3.80mg/g和30.03mg/g。与酒精模型组相比，药物组、保加利亚乳杆菌组和lp-cqzc02组肝脏中tc和tg含量呈下降趋势，但是lp-cqzc02组下降趋势最显著(p＜0.05)，分别下降了47.15％和44.44％。说明过量饮酒时，机体的肝脏脂质代谢受到影响，并且血糖含量上升，从而受到损伤，lp-cqzc02可以较好地促进小鼠脂质的代谢和胰岛素的释放。
[0110]
如图10所示，酒精模型组的mda、sod、ros、gsh和cat的含量分别为188.18nmol/ml、106.21u/ml、11566.21
×
104、0.64umol/g和17.34u/ml，lp-cqzc02处理后，mda、sod、ros、gsh和cat含量分别为82.21nmol/ml、383.82u/ml、5233.821
×
104、2.75umol/g和53.16u/ml。由实验数据可知，正常组小鼠mda和ros水平在五组中最低，sod、gsh和cat水平在五组中最高。与正常组相比，酒精模型组的mda和ros水平显著升高(p＜0.05)，sod、gsh和cat水平显著下降(p＜0.05)。lp-cqzc02处理后，血清mda和ros水平降低，分别下降了56.31％和54.75％。血清sod、gsh和cat活性上升，分别上升了2.61倍、3.30倍和2.07倍。药物组和乳酸杆菌组也有同样的趋势，但是lp-cqzc02组趋势更加显著，水平更接近正常组，效果更明显。
[0111]
如图11所示，酒精模型组肝脏中的sod、gsh、cat和mda含量分别为156.21u/mgprot、9.64umol/gprot、8.01u/mgprot和4.85nmol/mgprot，lp-cqzc02处理后，sod、gsh、cat和mda含量分别为409.82u/mgprot、28.99umol/gprot、38.77u/mgprot和2.41nmol/mgprot。实验结果表明，lp-cqzc02组肝脏中sod、gsh和cat含量在不同程度上高于酒精模型组，分别上升了1.62倍、2.01倍和3.84倍。与酒精模型组相比，lp-cqzc02组小鼠肝脏中mda含量明显低于酒精模型组，其含量下降了50.31％。说明摄入过量酒精使小鼠肝脏处于氧化应激状态，药物和乳酸菌均可在不同程度上缓解氧化应激，其中，lp-cqzc02缓解效果最明
显。
[0112]
实施例5mrna表达水平的测定
[0113]
采用实时定量pcr技术测定mrna的表达水平。将实施例3中1.4超低温保存的小鼠肝脏组织激活，使用trizol从小鼠的肝脏中提取出rna。使用逆转录酶试剂盒将rna逆转录为cdna模板，取2μl的cdna模板与10μl的sybr green pcr master mix和1μl的上下引物，以如下的条件进行反应：95℃下反应60s，95℃下反应15s，55℃下反应30s，72℃下反应35s，循环40次。最后，在95℃下进行30s，在55℃下进行35s，使用steponeplus real-time pcr系统扩增cdna。以gapdh为内参基因，使用2
‑△△
ct
方法计算mrna表达水平的变化。
[0114]
表4 qpcr引物序列
[0115]
[0116][0117]
如图12-图18所示，在乙醇诱导的氧化应激后，分别灌胃药物、保加利亚菌和lp-cqzc02的情况下，上调了nrf2、nqo1、ho-1、sod1、sod2、ppar-γ、cat、adh1、aldh1a1、aldh2、gsh、gclc、cpt1a、cpt1b、hnf4-α、il-10的mrna表达水平，下调了il-6、tnf-α、il-1β、fas、srebp-1c、ifn-γ的mrna表达水平。根据基因的表达情况可知：cpt1a这个目的基因上调lp-cqzc02组相对于酒精模型组的mrna表达含量的程度最大，增加了6.58倍。目的基因fas的lp-cqzc02组相对于酒精模型组mrna表达含量被下调的程度较大，下调了66％。总的来说，药物组、保加利亚乳杆菌组和lp-cqzc02组均在不同程度上增加或降低了相对于酒精模型组mrna的表达含量。其中以lp-cqzc02的效果最为显著。
[0118]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：

1.一株戊糖乳杆菌(lactobacilluspentosus)cqzc02，其特征在于，所述戊糖乳杆菌于2020年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.20177。2.权利要求1所述的戊糖乳杆菌cqzc02在分解乙醇中的应用。3.权利要求1所述的戊糖乳杆菌cqzc02在制备肝损伤的药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肝损伤为乙醇诱导的肝损伤。5.权利要求1所述的戊糖乳杆菌cqzc02在制备调节炎症反应的药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述炎症反应为乙醇诱导的炎症反应。7.权利要求1所述的戊糖乳杆菌cqzc02在制备加速脂质代谢、减少脂肪合成的药物中的应用。

技术总结

本发明公开了戊糖乳杆菌CQZC02及其在制备肝损伤药物中的应用，属于微生物学技术领域。LP-CQZC02通过抑制小鼠体重的下降，缓解肝重和肝脏指数的上升，促进酒精的代谢、减轻炎症状况、加速脂质代谢、减少脂肪的合成，并上调抗氧化水平来改善肝脏的受损伤情况。LP-CQZC02对酒精性肝损伤具有明显的保护作用。本发明为今后开发与LP-CQZC02相关的功能性食品以预防并缓解酒精性肝损伤提供了基础。以预防并缓解酒精性肝损伤提供了基础。以预防并缓解酒精性肝损伤提供了基础。