抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂及其制备方法与应用

1.本发明涉及一种抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂及其制备方法与应用。

背景技术：

2.蜜蜂同其它畜禽动物一样，也受到细菌、真菌、病毒、寄生虫等多种病害的侵袭，其中蜜蜂病毒病是最为特殊、致病机制最复杂、引起大量蜜蜂爬蜂的一种疾病。目前为止，尚没有一种针对蜜蜂某种病毒病的特效药，可以完全清除病毒，市场上现有的药物虽然能够起到一定的作用，减轻蜜蜂因病毒引起的爬蜂，但是药效并不显著，从而导致病毒很容易在蜂中潜伏感染，在次年再次大爆发大流行，造成生产上极大损失。
3.目前全球范围内可用防治蜜蜂病毒病的机理主要是针对病毒rna依赖的rna聚合酶或解旋酶的抑制或阻断。但是目前为止尚没有开发出真正的rna药物。天然产物，一直以来被认为最广泛应用于药物研发或病害防控的原料，无毒无害无毒副作用，容易降解，不残留。同rna药物相比，其成本低，使用方便，如能最大程度发挥其天然产物功能分子的作用，天然产物药物仍然是防治蜜蜂病毒病的最佳选择。
4.现有的蜜蜂病毒病防控药物存在着毒副作用大、配伍不精准的问题，往往治标不治本，很难根除病毒，也不能起到抑制蜜蜂病毒扩散的作用，从而造成蜂免疫力低下，最后造成蜂大量蜜蜂爬蜂，甚至大量死亡。

技术实现要素：

5.本发明是根据生物技术原理，采用新工艺提炼获得的天然产物，经过科学配伍，获得的可以有效抑制蜜蜂因病毒引起的爬蜂综合征。经长期的实验验证，证明了本发明获得的提取物在以列蜜蜂麻痹病毒、蜜蜂慢性麻痹病毒、黑蜂王台病毒等病毒感染中有巨大的潜力。
6.本发明的目的是提供一种抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂及其制备方法与应用。本发明的组合物用药配伍得当并且采用具有原功效的天然成份，具有抗病毒、增强免疫、提高蜂健康等功效，适用于抑制因以列蜜蜂麻痹病毒、蜜蜂慢性麻痹病毒、黑蜂王台病毒等一种或多种病毒引起的蜜蜂爬蜂综合征。
7.本发明的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂，由下述质量百分含量的组分组成：灵芝粉1-5％、黄芪多糖1-2％，l-抗坏血酸100-200ppm、板蓝根多糖15-25％，余量的水。
8.作为本发明的优选方案，所述抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂由下述质量百分含量的组分组成：灵芝粉5％、黄芪多糖2％、l-抗坏血酸200ppm和板蓝根多糖25％，余量的水。
9.作为本发明的优选方案，所述黄芪多糖是使用纤微素酶通过酶提法从黄芪中提取的。所述酶提法包括在75℃用纤微素酶酶解黄芪来制备黄芪多糖。
10.作为本发明的优选方案，所述板蓝根多糖是通过醇提法从板蓝根提取的作为本发明的优选方案，所述灵芝粉末的颗粒大小为80目-120目。
11.本发明的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂可用于制备预防和蜜蜂爬蜂病的药物。
12.本发明所提供的制备抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂的方法，包括将灵芝粉1-5％、黄芪多糖1-2％、l-抗坏血酸100-200ppm和板蓝根多糖15-25％加入水中混匀形，成所述组合物。
13.本发明的组合物用药配伍得当并且采用具有原功效的天然成份，具有抗病毒、增强免疫、提高蜂健康等功效，适用于抑制因以列蜜蜂麻痹病毒、蜜蜂慢性麻痹病毒、黑蜂王台病毒等一种或多种病毒引起的蜜蜂爬蜂综合征，效果优异。
附图说明
14.图1为由实施例3的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂制成的粉剂在不同浓度下抑制以列急性麻痹病毒(iapv)的抗病毒实验结果；
15.图2为由实施例3的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂制成的粉剂在不同浓度下抑制慢性蜜蜂麻痹病毒(cbpv)的抗病毒实验结果；
16.图3为由实施例3的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂制成的粉剂在不同浓度下抑制黑蜂王台病毒(bqcv)的抗病毒实验结果。
具体实施方式
17.下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
18.本发明实施例中所用的材料如下：
19.灵芝粉：购自阿里巴巴网上商城，重量以干重计。
20.黄芪：购自阿里巴巴网上商城，重量以干重计。
21.板蓝根：购自阿里巴巴网上商城，重量以干重计。
22.l-抗坏血酸：购自阿里巴巴网上商城，重量以mg计。
[0023]“ppm”是指每百万分中的一部分，即表示百万分之(几)，或称百万分率。
[0024]
实施例1、抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂1
[0025]
本实施例中，抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂由下述质量百分含量的组分组成：灵芝粉1％、黄芪多糖1％，l-抗坏血酸100ppm、板蓝根多糖25％，余量为水。
[0026]
板蓝根多糖按照如下方法制备：
[0027]
称取板蓝根25克，板蓝根用体积百分浓度为60％的乙醇溶液作溶剂进行浸提，浸提16小时，可溶性成分完全渗出，渗液回收乙醇，并在55℃下浓缩成相对密度为1.25的板蓝根提取液备用；板蓝根提取液的主要成分是板蓝根多糖。
[0028]
黄芪多糖按照如下方法制备：
[0029]
黄芪100g、纤微素酶0.8g，酶解温度为75℃，酶解时间为2h。向黄芪中加入其10倍重量的水，加热煮沸黄芪，降温至(55
±
1)℃，加入纤微素酶，酶量为0.4％，用0.5％na2so4调节至ph《6.0，恒温1h，煎煮提取；再次向其中加入黄芪重量6倍的水，重复提取1次，获得黄芪多糖液备用。
[0030]
抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂按照如下方法制备:
[0031]
(1)称取灵芝粉1克，灵芝粉按80目-120目粉碎，过筛，备用；
[0032]
(2)称取上述制备的黄芪多糖1克、上述制备的板蓝根多糖提取液25克和l-抗坏血酸0.01g；
[0033]
(3)将上述制备的灵芝粉和l-抗坏血酸、上述制备的板蓝根多糖提取液以及上述制备的黄芪多糖加入水(72.99g)中，混匀，制成抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂1。
[0034]
实施例2、抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂2
[0035]
本实施例中，所述抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂，由下述质量百分含量的组分组成：灵芝粉1％、黄芪多糖1％，l-抗坏血酸200ppm、板蓝根多糖15％、余量的水。
[0036]
板蓝根多糖按照如下方法制备：
[0037]
称取板蓝根25克，板蓝根用体积百分浓度为60％的乙醇溶液作溶剂进行浸提，浸提16小时，可溶性成分完全渗出，渗液回收乙醇，并在55℃下浓缩成相对密度为1.50的板蓝根提取液备用；板蓝根提取液的主要成分是板蓝根多糖。
[0038]
黄芪多糖多糖按照如下方法制备：
[0039]
黄芪100g、纤微素酶0.8g，酶解温度为75℃，酶解时间为2h。之后，采用纤微素酶量为0.4g，使用前按1:10的比例，用40℃温水活化，煮沸的黄芪降温至(55
±
1)℃，用0.5％na2so4调节至ph《6.0，恒温1h，煎煮提取；重复提取2次，第1次加10倍量水，第2次加6倍量水，每次1h。获得黄芪多糖液备用。
[0040]
抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂按照如下方法制备:
[0041]
(4)称取灵芝粉1克，灵芝粉按80目-120目粉碎，过筛，备用；
[0042]
(5)称取上述制备的黄芪多糖1克、上述制备的板蓝根多糖提取液15克和l-抗坏血酸0.02g；
[0043]
(6)将上述制备的灵芝粉和l-抗坏血酸、上述制备的板蓝根多糖提取液以及上述制备的黄芪多糖加入水(82.98g)中，混匀，抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂2。
[0044]
实施例3、抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂3
[0045]
本实施例中，所述抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂，它由下述质量百分含量的组分组成灵芝粉5％、黄芪多糖2％，l-抗坏血酸200ppm，板蓝根多糖25％、余量的水。
[0046]
板蓝根多糖按照如下方法制备：
[0047]
称取板蓝根25克，板蓝根用体积百分浓度为60％的乙醇溶液作溶剂进行浸提，浸提16小时，可溶性成分完全渗出，渗液回收乙醇，并在55℃下浓缩成相对密度为1.25-1.50的板蓝根提取液备用；板蓝根提取液的主要成分是板蓝根多糖。
[0048]
黄芪多糖多糖按照如下方法制备：
[0049]
黄芪200g、纤微素酶0.8g，酶解温度为75℃，酶解时间为2h。之后，采用纤微素酶量为0.4g，使用前按1:10的比例，用40℃温水活化，煮沸的黄芪降温至(55
±
1)℃，用0.5％na2so4调节至ph《6.0，恒温1h，煎煮提取；重复提取2次，第1次加10倍量水，第2次加6倍量水，每次1h。获得黄芪多糖液备用。
[0050]
抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂按照如下方法制备:
[0051]
(7)称取灵芝粉5克，灵芝粉按80目-120目粉碎，过筛，备用；
[0052]
(8)称取上述制备的黄芪多糖2克、上述制备的板蓝根多糖提取液25克和l-抗坏血酸0.02g；
[0053]
(9)将上述制备的灵芝粉和l-抗坏血酸、上述制备的板蓝根多糖提取液以及上述
制备的黄芪多糖加入水(67.98g)中，混匀，抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂3。
[0054]
实施例4、抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂的在预防和蜜蜂爬蜂综合征中的应用
[0055]
对实施例1-3制备的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂1-3进行过滤，除去杂质，滤液在55℃下浓缩至相对密度为1.25的浓缩液；浓缩液经喷雾干燥后制成粉剂1-3。
[0056]
一、安全性实验
[0057]
(1)以0.1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和500μg/ml的终浓度分别将上述制成的粉剂1-3添加到50％蔗糖溶液中饲喂健康的蜜蜂，每组蜜蜂30只，每个剂量3组，连续饲喂10天。
[0058]
(2)另外有两组，一组为只饲喂pbs缓冲溶液作为阴性对照，另一组为只饲喂上述50％蔗糖溶液，作为空白对照。每天记录每组蜜蜂死亡个体数及并计算死亡率。
[0059]
结果表明，任何组均未发现个体死亡，此抗病毒药物对蜂的健康不会造成影响。
[0060]
二、抑制病毒检测
[0061]
(1)根据上面的实验数据，以10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的终浓度作为实验剂量，分别将上述制成的粉剂1-3添加到含病毒的50％蔗糖溶液中饲喂蜜蜂作为实验组。
[0062]
以列急性麻痹病毒(iapv):
[0063]
病毒+d100(粉剂的终浓度为100μg/ml，iapv+d100)、病毒+d50(粉剂的终浓度为50μg/ml，iapv+d50)、病毒+d10(粉剂的终浓度为10μg/ml，iapv+d10)。三组对照，一组为只饲喂pbs缓冲溶液作为阴性对照(pbs组)，一组只饲喂不含病毒的50％蔗糖溶液作为空白对照组，另一组为只饲喂入含病毒的50％蔗糖溶液作为病毒组(iapv组)。上述实验组和对照组的每种病毒是通过超速离心获得，并以每微升约10
12
拷贝数添加到50％蔗糖溶液中进行饲喂。另外用已知之前已证明能够对蜜蜂多种病毒有抑制作用的抗病毒一号药物(有效成分为盐酸金刚烷胺)，作为病毒+阳物对照组。每天都记录每组蜜蜂死亡个体数并计算死亡率。图1示出了实施例3的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂在不同浓度下抑制以列急性麻痹病毒(iapv)的抗病毒实验结果。
[0064]
慢性蜜蜂麻痹病毒(cbpv):
[0065]
病毒+d100(粉剂的终浓度为100μg/ml，cbpv+d100)、病毒+d50(粉剂的终浓度为50μg/ml，cbpv+d50)、cbpv+d10(粉剂的终浓度为10μg/ml，cbpv+d10)。三组对照，一组为只饲喂pbs缓冲溶液作为阴性对照(pbs组)，一组只饲喂不含病毒的50％蔗糖溶液作为空白对照，另一组为只饲喂入含病毒的50％蔗糖溶液，作为病毒组(cbpv组)。上述实验组和对照组的每种病毒是通过超速离心获得，并以每微升约10
12
拷贝数添加到50％蔗糖溶液中进行饲喂。另外用已知之前已证明能够对蜜蜂多种病毒有抑制作用的抗病毒一号药物，作为病毒+阳物对照组。每天都记录每组蜜蜂死亡个体数并计算死亡率。图2出了实施例3的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂在不同浓度下抑制慢性蜜蜂麻痹病毒(cbpv)的抗病毒实验结果。
[0066]
黑蜂王台病毒(bqcv):
[0067]
病毒+d100(粉剂的终浓度为100μg/ml，bqcv+d100)、病毒+d50(粉剂的终浓度为50μg/ml，bqcv+d50)、病毒+d10(粉剂的终浓度为10μg/ml，bqcv+d10)。三组对照，一组为只饲喂pbs缓冲溶液作为阴性对照(pbs组)，一组只饲喂不含病毒的50％蔗糖溶液作为空白对
照，另一组为只饲喂入含病毒的50％蔗糖溶液，作为病毒组(bqcv组)。上述实验组和空白组的每种病毒是通过超速离心获得，并以每微升约10
12
拷贝数添加到50％蔗糖溶液中进行饲喂。另外用已知之前已证明能够对蜜蜂多种病毒有抑制作用的抗病毒一号药物，作为病毒+阳物对照组。每天都记录每组蜜蜂死亡个体数并计算死亡率。图3示出了实施例3的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂在不同浓度下抑制黑蜂王台病毒(bqcv)的抗病毒实验结果。
[0068]
(2)采用荧光定量pcr检测死亡的蜜蜂。
[0069]
荧光定量pcr检测iapv病毒的正向引物为：5'-gttgtcggaactgtggcagcta-3'，
[0070]
反向引物为：5'-gccgcaaacataccctgtagcc-3'，
[0071]
目的片段长度为216bp。
[0072]
荧光定量pcr检测cbpv病毒的正向引物为：5'-ccagccgtgaaacatgttcttacc-3'，
[0073]
反向引物为：5'-acatagttgcacgccaatacgagaac-3'，
[0074]
目的片段长度为226bp。
[0075]
荧光定量pcr检测bqcv病毒的正向引物为：5'-tatgcggttggtgcgggagat-3'，反向引物为；5'-gagcattgaggaacgccgtacc-3'，
[0076]
目的片段长度为181bp。
[0077]
用正向引物β-actin 5'-ttgtatgccaacactgtccttt-3'和反向引物actin 5'-tggcgcgatgatcttaattt-3'扩增的管家基因。
[0078]
pcr反应条件为95℃30秒，60℃30秒，72℃20秒，40个循环。采用相对定量的方法对所得数据进行计算。
[0079]
荧光定量结果如表1所示，结果发现病毒+d100、病毒+d10和病毒+d50的蜜蜂感染病毒滴度明显低于病毒组。表明有较好的病毒抑制效果。
[0080]
表1-1.荧光定量测量病毒iapv滴度结果
[0081][0082]
注：e(代表指数)表示将前面的数字乘以10的n次幂
[0083]
表1-2.荧光定量测量病毒cbpv滴度结果
[0084][0085]
注：e(代表指数)表示将前面的数字乘以10的n次幂
[0086]
表1-3.荧光定量测量病毒bqcv滴度结果
[0087][0088]
注：e(代表指数)表示将前面的数字乘以10的n次幂
[0089]
实施例4、抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂在改善蜂整体抗蜜蜂麻痹病毒能力中的应用。
[0090]
根据上面的实验数据，选取10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml作为实验剂量，将含终浓度为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的粉剂3的蔗糖溶液饲喂蜜蜂作为实验组(表2-4中的病毒+d100组、病毒+d50组、病毒+d10组)。另外有三组，一组为只饲喂pbs缓冲溶液，作为阴性对照，另一组为只饲喂正常的糖水，作为空白对照，用已知之前已证明能够对蜜蜂麻痹病毒有抑制作用的抗病毒一号药物，作为病毒加阳物对照组。每组有3蜂，每约7框蜂。处理组每7天饲喂一次，共计喂2次，观察20天。每天都记录每组蜂箱前死亡个体数并计算蜜蜂死亡率。每天清晨清扫蜂箱前死蜂，并记录有出现麻痹症状的蜜蜂数。
[0091]
采用荧光定量pcr检测死亡的蜜蜂，计算抗病毒药物的抑制作用。
[0092]
荧光定量pcr检测iapv病毒的正向引物为：5'-gttgtcggaactgtggcagcta-3'；
[0093]
荧光定量pcr检测iapv病毒的反向引物为：5'-gccgcaaacataccctgtagcc-3'；
[0094]
目的片段长度为216bp。
[0095]
荧光定量pcr检测cbpv病毒的正向引物为：5'-ccagccgtgaaacatgttcttacc-3'；
[0096]
荧光定量pcr检测cbpv病毒的反向引物为：5'-acatagttgcacgccaatacgagaac-3'；
[0097]
目的片段长度为226bp。
[0098]
荧光定量pcr检测bqcv病毒的正向引物为：5'-tatgcggttggtgcgggagat-3'；
[0099]
荧光定量pcr检测bqcv病毒的反向引物为：5'-gagcattgaggaacgccgtacc-3'；
[0100]
目的片段长度为181bp。
[0101]
用正向引物β-actin 5'-ttgtatgccaacactgtccttt-3'和反向引物actin 5'-tggcgcgatgatcttaattt-3'扩增管家基因。
[0102]
pcr反应条件为95℃30秒，60℃30秒，72℃20秒，40个循环。
[0103]
采用相对定量的方法对所得数据进行计算。
[0104]
结果如表2-1、表2-2、表2-3所示，发现病毒+d100组、病毒+d50组、病毒+d10组的蜜蜂感染病毒滴度明显低于病毒组的滴度。同时对表现麻痹症状的蜂与健康的蜂进行比较，结果如表3和表4所示，存活率有差异，表明有较好的病毒抑制效果。
[0105]
表2-1.荧光定量结果(iapv)
[0106][0107]
注：e(代表指数)表示将前面的数字乘以10的n次幂.
[0108]
表2-2.荧光定量结果(cbpv)
[0109][0110]
注：e(代表指数)表示将前面的数字乘以10的n次幂
[0111]
表2-3.荧光定量结果(bqcv)
[0112][0113]
注：e(代表指数)表示将前面的数字乘以10的n次幂
[0114]
表3-1.存活率(iapv)
[0115]
[0116]
表3-2.存活率(cbpv)
[0117][0118]
表3-3.存活率(bqcv)
[0119][0120]
表4-1.表现出爬蜂症状的蜜蜂数比较(iapv)
[0121][0122][0123]
表4-2.表现出爬蜂症状的蜜蜂数比较(cbpv)
[0124][0125]
表4-3.表现出爬蜂症状的蜜蜂数比较(bqcv)
[0126]

技术特征：

1.一种抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂，其特征在于，由下述质量百分含量的组分组成：灵芝粉1-5％、黄芪多糖1-2％、l-抗坏血酸100-200ppm和板蓝根多糖15-25％、余量的水。2.根据权利要求1所述的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂，其特征在于，所述组合物由下述质量百分含量的组分组成：灵芝粉5％、黄芪多糖2％、l-抗坏血酸200ppm和板蓝根多糖25％、余量的水。3.根据权利要求1所述的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂，其特征在于，所述黄芪多糖是使用纤微素酶通过酶提法从黄芪中提取的。4.根据权利要求1所述的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂，其特征在于，所述板蓝根多糖是通过醇提法从板蓝根提取的相对密度为1.25-1.50的板蓝根醇提取液。5.根据权利要求4所述的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂，其特征在于，所述醇提法包括使用体积百分浓度为60-75％的乙醇溶液作溶剂浸提所述板蓝根，然后浓缩提取液获得所述板蓝根多糖。6.根据权利要求3所述的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂，其特征在于，所述酶提法包括在75℃用纤微素酶酶解黄芪来制备黄芪多糖。7.根据权利要求1所述的组合物，所述灵芝粉末的颗粒大小为80目-120目。8.根据权利要求1所述的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂，其特征在于，所述蜜蜂病毒包括以列急性麻痹病毒、慢性蜜蜂麻痹病毒、黑蜂王台病毒中任一种或两种以上。9.权利要求1-7中任一项所述的组合物在制备预防和蜜蜂爬蜂综合征的药物中的应用。10.一种制备抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂的方法，包括将灵芝粉1-5％、黄芪多糖1-2％、l-抗坏血酸100-200ppm和板蓝根多糖15-25％加入水中，混匀，形成所述组合物。

技术总结

本发明公开了一种抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂及其制剂与应用。该抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂，其特征在于，它由下述质量百分含量的组分组成：灵芝粉1-5％、黄芪多糖1-2％，L-抗坏血酸100-200ppm，板蓝根多糖15-25％、余量的水。本发明的抑制蜜蜂病毒引起的爬蜂综合征的制剂适用于预防和蜜蜂因病毒引起的爬蜂及改善蜂整体抗病毒能力。因病毒引起的爬蜂及改善蜂整体抗病毒能力。