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基于至少两种糖胺聚糖的组合物的制作方法

1.本发明涉及一种基于透明质酸(hyaluronic acid)的水性凝胶，所述水性凝胶包含至少交联的透明质酸和至少一种类型的水溶性透明质酸。本发明进一步涉及一种用于制备基于糖胺聚糖、特别是基于透明质酸的经补充的组合物的方法，所述经补充的组合物是软的、稳定的、无菌的和可注射的。如此获得的水性凝胶和组合物包含至少两种类型的糖胺聚糖，包括从非交联的高摩尔质量糖胺聚糖制备的至少一种交联的糖胺聚糖、特别是至少一种交联的透明质酸，和至少一种非交联的低摩尔质量糖胺聚糖，特别是从至少一种非交联的高摩尔质量透明质酸制备的至少一种交联的透明质酸和至少一种非交联的低摩尔质量透明质酸。

背景技术：

2.多糖诸如糖胺聚糖被广泛用于生物医学领域。具体地，大多数销售用于美学和/或美容应用的产品是基于透明质酸。
3.为了改善皮肤质量，未改性的透明质酸凝胶具有吸引力，因为它们具有完美生物相容性的优势。但是，在体内植入后，它们会非常迅速地降解。因此，这样的凝胶的作用只持续短时间。
4.为了增加其在体内的耐久性及其对降解的抗性，通常通过交联对透明质酸进行改性。交联的透明质酸凝胶可以通过不同的制备方法获得。多糖诸如透明质酸可以与不同的交联剂诸如环氧试剂、醛类如戊二醛、二乙烯基砜(dvs)或多胺类交联。目前，用于交联透明质酸的最常用试剂是环氧试剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)。
5.这些交联方法需要两个主要步骤，即多糖的水合和交联。
6.基于如此制备的透明质酸的商业产品通常包含，并且根据其适应症，交联的透明质酸的级分和在1％至10％范围内的改性程度。
7.尽管如此，透明质酸交联的增加导致更多化学改性的凝胶的制备，因此其生物相容性可能更低。另一方面，这些组合物的机械性能是有限的，并导致非常有弹性的和/或易碎的最终产品。
8.但是，出于产品安全性和性能的原因，人们对获得包含生物相容性多糖的持久体内组合物感兴趣，所述组合物是尽可能天然的和尽可能少地改性，因此尽可能少地交联。
9.除了交联度之外，所用糖胺聚糖的浓度是决定组合物的机械和抗性性能的关键参数。因此，增加基于多糖的组合物的体内耐久性和降解抗性的一种替代方法是增加其在最终组合物中的总浓度。
10.但是，除了增加其抗性和其耐久性之外，所述糖胺聚糖的总浓度的增加导致组合物增稠，其粘度显著增加。这种粘度增加因此使凝胶难以注射并且不能自然地整合到组织中。特别是，已知总透明质酸浓度的增加是注射后丘疹发生的根源。
11.因此，由于所有这些原因，迄今为止市售的大多数交联的透明质酸产品具有仅约25或26mg/g的总透明质酸浓度。然而，尽管可能对丰盈皮肤填充应用有用，但这样的凝胶不
适用于皮肤的再生和外观改善的皮肤应用，其中机械填充不是追求的主要效果，并且需要在皮肤的表层区域进行注射。对于后一类注射，实际上希望制备具有较低弹性(g')和粘性(g")模量的凝胶，即软的、易于注射和易于扩散到组织中。
12.仍然在增加基于糖胺聚糖(诸如透明质酸)的产品的抗性和持久性的背景下，还已经提出了添加对透明质酸具有保护性能的各种化合物。因此，针对透明质酸在热下的降解，申请wo2014/032804提出添加抗坏血酸磷酸酯镁，申请wo2013/186493提出添加蔗糖八硫酸酯，且申请wo2007/077399提出添加甘油。但是，这类稳定化合物的添加会增加关于产品生物相容性的不确定性。
13.因此，仍然需要基于糖胺聚糖和更特别是基于透明质酸的无菌凝胶，其是软的、易于注射和易于扩散到组织中，同时对于皮肤的再生和/或外观改善具有足够的持久性和有效性。
14.具体地，仍然需要增加基于糖胺聚糖(诸如透明质酸)的组合物的抗性和耐久性，以克服现有技术的问题。本发明提出满足这些需求。
15.发明概述
16.根据第一方面，本发明涉及一种基于透明质酸的水性凝胶，其包含交联的透明质酸，特征在于，所述凝胶至少包含：
[0017]-具有在0.02mda至0.30mda范围内的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha lmw”，其量相对于透明质酸的总质量按质量计为30％至70％；和
[0018]-任选的，具有大于0.30mda的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha hmw”，
[0019]
并且特征在于，所述水溶性透明质酸具有小于或等于5％、优选地小于或等于3％、更优选地小于或等于1％的改性程度，
[0020]
可溶性透明质酸的各个百分比如下确定：将所述水性凝胶在含有0.02％nan3的150nm硝酸钠的ph 7.2溶液内在25℃稀释5天，并将它在4400rpm离心10分钟，并将这样的稀释过的凝胶在0.45mm过滤以得到滤液，然后用配备多角度光散射(mals)检测器和折射率(ri)检测器(具有设定在0.165ml/g的折射率增量(dn/dc))的尺寸排阻谱仪器以及配备两组尺寸排阻柱(适用于具有在0.001da至20mda范围内的质量平均摩尔质量的分子)的液体谱泵送站分析所述滤液，其中ph 7.2硝酸钠流动相的流速为0.3ml/min。
[0021]
本文描述了一种用于制备水性凝胶的方法，所述水性凝胶包含至少一种交联的糖胺聚糖和至少一种非交联的糖胺聚糖，所述方法至少包含以下步骤：
[0022]
a)获得水性溶液，该溶液包含至少一种交联的糖胺聚糖，其被称作“交联的糖胺聚糖hmw”，其从具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的摩尔质量的非交联的糖胺聚糖和从交联剂形成；
[0023]
b)获得水性溶液，该溶液包含具有在0.04mda至0.30mda、优选0.08mda至0.20mda、更优选0.08mda至0.15mda、再更优选0.08mda至0.10mda范围内的摩尔质量的至少一种非交联的糖胺聚糖，其被称作“非交联的糖胺聚糖lmw”；和，
[0024]
c)形成来自步骤a)和b)的所述溶液的全部或部分的均质混合物。
[0025]
根据第二方面，本发明涉及一种用于制备水性凝胶的方法，所述水性凝胶包含至少一种交联的透明质酸和至少一种非交联的透明质酸，所述方法至少包含以下步骤：
[0026]
a)获得水性溶液，该溶液包含至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”，其从具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的非交联的透明质酸以及交联剂形成；
[0027]
b)获得水性溶液，该溶液包含至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”，其具有在0.04mda至0.30mda、优选0.08mda至0.20mda、更优选0.08mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量；和，
[0028]
c)形成步骤a)和b)的所述溶液的全部或部分的均质混合物；
[0029]
特征在于，它包含以1:3至2:1的“非交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用透明质酸。
[0030]
意外地，发明人已经发现，给包含至少一种交联的糖胺聚糖(其从至少一种非交联的高摩尔质量糖胺聚糖制备)的组合物补充至少一种非交联的低摩尔质量糖胺聚糖，特别是给包含至少一种交联的透明质酸(其从至少一种非交联的高摩尔质量透明质酸制备)的组合物补充至少一种非交联的低摩尔质量透明质酸，会增强最终组合物的抗性。
[0031]
如在以下实施例中所示，结果是：
[0032]
与不含添加的非交联的低摩尔质量糖胺聚糖、和更具体地不含添加的非交联的低摩尔质量透明质酸的相同组合物相比，改进的对降解的抗性；和
[0033]
与具有糖胺聚糖、更具体地透明质酸的相同总浓度以及交联的糖胺聚糖、更具体地交联的透明质酸的级分的相同交联程度的组合物相比，更好的对降解的抗性。
[0034]
由于这种改进的对降解的抗性，根据本发明的组合物更耐热灭菌。因此，在灭菌前具有相似流变学性能的两种无菌和可注射组合物之间，一种根据本发明，且另一种根据现有技术的教导制备，前者在灭菌后显示出的流变学性能优于后者在灭菌后显示出的流变学性能。
[0035]
由于它们的增加的对降解的抗性，根据本发明的组合物有利地能够承受变化的温度，特别是在它们的运输和储存期间。
[0036]
此外，补充至少一种非交联的低摩尔质量糖胺聚糖，特别是补充至少一种非交联的低摩尔质量透明质酸，使得可能制备软的、易于注射的和易于扩散的组合物，其具有增加的总糖胺聚糖浓度，因此对皮肤生理学具有一种或多种显著的生物力学和/或生物学效应。
[0037]
此外，根据本发明制备的组合物的使用允许同时施用具有不同摩尔质量的糖胺聚糖、特别是透明质酸，这有助于糖胺聚糖、特别是透明质酸在部位处的生理效应的多样化。
[0038]
根据第三方面，本发明涉及可根据本发明的方法得到的糖胺聚糖、特别是透明质酸的水性凝胶。
[0039]
根据第四方面，本发明涉及一种美容和/或皮肤病学组合物，其包含在本发明中定义的水性凝胶。
[0040]
本发明还涉及根据本发明的方法得到的组合物。
[0041]
本发明还涉及用于预防和/或皮肤的粘弹性或生物力学性能的改变的根据本发明的水性凝胶或根据本发明的组合物。
[0042]
本发明还涉及用于预防和/或皮肤的表面外观的改变的根据本发明的水性凝胶或根据本发明的皮肤病学组合物，所述改变例如由外界因素诸如应激、大气污染、烟草或
长时间暴露于紫外(uv)线诱导。
[0043]
优选地，本发明涉及用于软组织增大和/或填充的根据本发明的水性凝胶或根据本发明的皮肤病学组合物。
[0044]
它还涉及在本发明中定义的水性凝胶或在本发明中定义的美容组合物用于预防和/或皮肤的表面外观的改变(例如年龄老化的皮肤征象)的非性美容用途。
[0045]
它还涉及在本发明中定义的水性凝胶或在本发明中定义的美容组合物用于增大和/或填充软组织、特别是填充皱纹的非性美容用途。
[0046]
附图简述
[0047]
[图1]图1是样品1-1至1-3在高压釜灭菌后的弹性模量(g
′
)损失(δg
′
(％))、非交联的低摩尔质量透明质酸的浓度以及交联的和非交联的高摩尔质量透明质酸的浓度的图解表示。
[0048]
[图2]图2的图显示了不含添加的非交联的透明质酸的样品3-5以及分别包含0.04mda、0.10mda、0.20mda和1.50mda摩尔质量的添加的非交联的透明质酸的样品3-6至3-9的在高压釜灭菌后的弹性模量(g
′
)损失(δg
′
(％))。
[0049]
[图3]图3的图显示了不含添加的非交联的透明质酸的样品3-5以及分别包含0.04mda、0.10mda、0.20mda和1.50mda摩尔质量的添加的非交联的透明质酸的样品3-6至3-9在高压釜灭菌后的弹性模量(g
′
)损失的改善百分比。
[0050]
[图4]图4是样品4-1(没有补充)和样品4-2至4-4在高压釜灭菌后的弹性模量(g
′
)损失(δg
′
(％))、非交联的低摩尔质量透明质酸的浓度以及交联的和非交联的高摩尔质量透明质酸的浓度的图解表示。
[0051]
[图5]图5的图显示了不含添加的非交联的透明质酸的样品6-1以及分别包含0.10mda和1.50mda摩尔质量的添加的非交联的透明质酸的样品6-2和6-3在透明质酸酶处理之前和之后弹性模量(g
′
)的差异(δg
′
(％))。
[0052]
详细描述
[0053]
根据本发明的术语的定义：
[0054]
‑“
糖胺聚糖”被定义为由重复二糖单元组成的长链，其中两个碳水化合物残基之一是氨基碳水化合物(n-乙酰基葡糖胺或n-乙酰基半乳糖胺)，且第二个是糖醛酸(葡糖醛酸或艾杜糖醛酸)或半乳糖。糖胺聚糖包括透明质酸、heparosan、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素。一种特别优选的糖胺聚糖是透明质酸。
[0055]
‑“
透明质酸”是指透明质酸或玻尿酸(hyaluronan)、及其衍生物。因此，术语“透明质酸”也包括透明质酸盐诸如透明质酸钠和已经化学改性的透明质酸，例如通过氧化、还原、脱乙酰化、硫酸化或酰胺化。透明质酸是一种线性多糖，具有通过交替的β-1,3糖苷键和β-1,4糖苷键连接的交替的d-葡糖醛酸和n-乙酰基-d-葡糖胺单元。
[0056][0057]
它天然存在于人体的多种组织中，并被同样存在于体内的酶透明质酸酶和/或通
过氧化机制而降解。
[0058]
‑“
水溶性透明质酸”或“可溶性透明质酸”或“可提取的透明质酸”(也称作“sha”)是指当基于透明质酸的凝胶在过量水性介质中溶胀时可以从所述凝胶中提取的透明质酸。可溶性透明质酸的各个百分比如下确定：将所述水性凝胶在含有0.02％nan3的150nm硝酸钠的ph 7.2溶液内在25℃稀释5天，并将它在4400rpm离心10分钟，并将这样的稀释过的凝胶在0.45mm过滤以得到滤液，然后用配备多角度光散射(mals)检测器和折射率(ri)检测器(具有设定在0.165ml/g的折射率增量(dn/dc))的尺寸排阻谱仪器以及配备两组尺寸排阻柱(适用于具有在0.001da至20mda范围内的质量平均摩尔质量的分子)的液体谱泵送站分析所述滤液，其中ph 7.2硝酸钠流动相的流速为0.3ml/min。实际上，本领域技术人员随着上清液组成变化而适当调整稀释步骤的流动相中凝胶的浓度以及sec中的注射体积，以最大化信噪比(signal-to-bruise ratio)和避免柱过载。
[0059]
相反，“非水溶性透明质酸”或不可溶性透明质酸”或“不可提取的透明质酸”(也称作“nsha”)是指当基于透明质酸的凝胶在过量水性介质中溶胀时不可从所述凝胶中提取的透明质酸。
[0060]-糖胺聚糖、特别是透明质酸的“质量平均摩尔质量”(以g/mol或da为单位表示，并缩写为mw)表示使用的糖胺聚糖分子的质量平均摩尔质量。通过本领域技术人员已知的各种方法，诸如通过毛细管电泳、通过尺寸排阻谱法或通过测量固有粘度，可以确定糖胺聚糖的质量平均摩尔质量。在本文中，表述“摩尔质量”、“平均摩尔质量”、“质量平均摩尔质量”或“质量摩尔质量”可以互换使用。
[0061]-糖胺聚糖、特别是透明质酸的“固有粘度”([η])(以ml/g或m3/kg为单位表示)表示糖胺聚糖对溶液粘度的贡献。它可以通过在毛细管粘度计中的流动来测量。它代表聚合物的流体动力学比体积。糖胺聚糖的固有粘度越低，其摩尔质量越低。对于给定的糖胺聚糖，固有粘度通过经验关系式与摩尔质量相关，所述关系式即mark-houwink关系式，其可以被本领域的任何技术人员理解且其公式如下：
[0062]
[η]＝k x mw
α
[0063]
其中：
[0064]-k是所研究的聚合物、使用的溶剂和温度的常函数，特别是，k与所研究的聚合物的链的尺寸有关；
[0065]-α是所研究的聚合物、使用的溶剂和温度的常函数，特别是，α与所研究的聚合物的构象有关；且，
[0066]-mw是聚合物的质量平均摩尔质量，以道尔顿(da)为单位表示。
[0067]
‑“
低摩尔质量糖胺聚糖”，也称作“糖胺聚糖lmw”或“lmw糖胺聚糖”，是指作为原料的糖胺聚糖，其具有在0.04至0.30mda、优选0.08mda至0.20mda、更优选0.08mda至0.15mda、再更优选0.08mda至0.10mda范围内的质量平均摩尔质量。
[0068]
‑“
低摩尔质量透明质酸”，也称作“透明质酸lmw”或“ha lmw”或“lmw透明质酸”或“lmw ha”，是指作为原料的透明质酸，其具有在0.04至0.30mda、优选0.08至0.20mda、更优选0.08至0.15mda范围内的摩尔质量，这对应于低固有粘度的透明质酸，即，根据欧洲药典(01/2017:1472版)所指出的方法测得具有在0.10至0.8m3/kg、优选0.2至0.5m3/kg、更优选0.2至0.4m3/kg范围内的固有粘度。
[0069]
‑“
低摩尔质量水溶性透明质酸”或“低摩尔质量可溶性透明质酸”，也称作“sha lmw”或“lmw sha”，是指根据在权利要求1中详述的方法在最终凝胶上测得具有在0.02mda至0.30mda、优选0.04mda至0.20mda、更优选0.04mda至0.15mda范围内的摩尔质量的可溶性透明质酸，就是说，通过将所述水性凝胶在含有0.02％nan3的150nm硝酸钠的ph 7.2溶液内在25℃稀释5天，并将它在4400rpm离心10分钟，并将这样的稀释过的凝胶在0.45mm过滤以得到滤液，然后用配备多角度光散射(mals)检测器和折射率(ri)检测器(具有设定在0.165ml/g的折射率增量(dn/dc))的尺寸排阻谱仪器以及配备两组尺寸排阻柱(适用于具有在0.001da至20mda范围内的质量平均摩尔质量的分子)的液体谱泵送站分析所述滤液，其中ph 7.2硝酸钠流动相的流速为0.3ml/min。实际上，本领域技术人员随着上清液组成变化而适当调整稀释步骤的流动相中凝胶的浓度以及sec中的注射体积，以最大化信噪比和避免柱过载。
[0070]
‑“
高摩尔质量糖胺聚糖”，也称作“糖胺聚糖hmw”或“hmw糖胺聚糖”，是指作为原料的糖胺聚糖，其具有大于0.50mda、优选地大于1.00mda和更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的摩尔质量。
[0071]
‑“
高摩尔质量透明质酸”，也称作“透明质酸hmw”或“ha hmw”或“hmw透明质酸”或“hmw ha”，是指作为原料的透明质酸，其具有大于0.50mda、优选地大于1.00mda和更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的摩尔质量，这对应于高固有粘度的透明质酸，即，根据欧洲药典(01/2017:1472版)所指出的方法测得具有大于0.8m3/kg、优选地大于1.2m3/kg、更优选地在1.2m3/kg至3.5m3/kg范围内的固有粘度。
[0072]
‑“
高摩尔质量可溶性透明质酸”或“高摩尔质量水溶性透明质酸”也称作“sha hmw”或“hmw sha”，是指根据在权利要求1中详述的方法在最终凝胶上测得具有高于0.30mda、优选地高于0.30mda且低于或等于4.00mda的摩尔质量的可溶性透明质酸，就是说，通过将所述水性凝胶在含有0.02％nan3的150nm硝酸钠的ph 7.2溶液内在25℃稀释5天，并将它在4400rpm离心10分钟，并将这样的稀释过的凝胶在0.45mm过滤以得到滤液，然后用配备多角度光散射(mals)检测器和折射率(ri)检测器(具有设定在0.165ml/g的折射率增量(dn/dc))的尺寸排阻谱仪器以及配备两组尺寸排阻柱(适用于具有在0.001da至20mda范围内的质量平均摩尔质量的分子)的液体谱泵送站分析所述滤液，其中ph 7.2硝酸钠流动相的流速为0.3ml/min。实际上，本领域技术人员随着上清液组成变化而适当调整稀释步骤的流动相中凝胶的浓度以及sec中的注射体积，以最大化信噪比和避免柱过载。
[0073]
‑“
交联的糖胺聚糖”表示在交联反应期间用交联剂改性的糖胺聚糖。相反，“非交联的糖胺聚糖”表示未用交联剂改性并因此未发生交联反应的糖胺聚糖。
[0074]
‑“
交联的透明质酸”表示在交联反应期间用交联剂改性的透明质酸。相反，“非交联的透明质酸”表示未用交联剂改性并因此未发生交联反应的透明质酸。
[0075]
‑“
非交联的”和“未交联的”是同义术语并可以在本文中互换使用。
[0076]-表述“糖胺聚糖hmw”或“hmw糖胺聚糖”表示在水性凝胶中的“交联的糖胺聚糖hmw”组分和“非交联的糖胺聚糖hmw”组分，如果存在的话。
[0077]-表述“透明质酸hmw”，也称作“ha hmw”或“hmw ha”，表示在水性凝胶中的“交联的透明质酸hmw”(也称作“交联的ha hmw”或“交联的hmw ha”)组分和如果适用的话“非交联的透明质酸hmw”(也称作“非交联的ha hmw”或“非交联的hmw ha”)组分，如果存在的话。
[0078]-在制备“交联的糖胺聚糖”、特别是“交联的透明质酸”的过程中应用的“交联率”对应于交联剂的质量(或重量)与用于制备所述交联的糖胺聚糖、特别是所述交联的透明质酸的糖胺聚糖、特别是透明质酸的质量之间的比率。它表示为百分比。
[0079]-交联的糖胺聚糖和包含这样的交联的糖胺聚糖、特别是交联的透明质酸的组合物以及包含这样的交联的透明质酸的组合物可以通过它们的“改性程度”(mod)来限定。该改性程度对应于通过其一个或多个末端连接到所述糖胺聚糖的改性剂的摩尔量，以每100摩尔在组合物内的糖胺聚糖的二糖重复单元表示，特别是以每100摩尔在组合物内的透明质酸的二糖重复单元表示。用于确定该改性程度的参考方法是核磁共振光谱法(1h nmr)。通过交联剂信号与糖胺聚糖二糖单元信号(已经参与或未参与交联的糖胺聚糖)的摩尔比确定所述改性程度。
[0080]
‑“
交联的高摩尔质量(hmw)糖胺聚糖”或“交联的高摩尔质量(hmw)糖胺聚糖”表示从非交联的高摩尔质量糖胺聚糖制备的交联的糖胺聚糖。优选地，交联的hmw糖胺聚糖具有小于或等于8％、优选地小于或等于5％和更优选地小于2％的交联率。
[0081]
‑“
交联的高摩尔质量(hmw)透明质酸”或“交联的高摩尔质量(hmw)透明质酸”表示从非交联的高摩尔质量透明质酸制备的交联的透明质酸。优选地，交联的hmw透明质酸具有小于或等于8％、优选地小于或等于5％和更优选地小于2％的交联率。
[0082]
‑“
糖胺聚糖对皮肤生理学的生物力学和生物学性能”尤其包括水合和成纤维细胞活化。例如，由于其生物力学和生物学性能，透明质酸参与皮肤重建、再生和/或嫩肤(rejuvenation)。
[0083]-给组合物“补充”代表向该组合物添加至少一种非交联的低摩尔质量糖胺聚糖。优选地，补充对应于向组合物添加至少一种非交联的低摩尔质量透明质酸。
[0084]
‑“
总糖胺聚糖浓度”是指交联的高摩尔质量糖胺聚糖和任选的非交联的高摩尔质量糖胺聚糖的浓度与用于补充的糖胺聚糖的浓度的总和。以毫克糖胺聚糖/克凝胶表示该浓度。
[0085]
‑“
总透明质酸浓度”是指交联的高摩尔质量透明质酸和任选的非交联的高摩尔质量透明质酸的浓度与用于补充的透明质酸的浓度的总和。以毫克糖胺聚糖/克凝胶表示该浓度。
[0086]-当溶液的颜、视觉外观和粘度被肉眼和触觉感知为均匀时，则认为溶液是“均质的”。
[0087]
‑“
水性介质”是指至少含有水作为溶剂并且具有溶解糖胺聚糖、特别是透明质酸的性能的任何液体介质。
[0088]
‑“
交联剂”是指能够在不同糖胺聚糖链之间引入交联的任何化合物。作为适用于实施本发明的交联剂，可以特别提及双官能或多官能环氧或非环氧交联剂。在环氧试剂中可以提及丁二醇二缩水甘油醚(bdde)、二环氧辛烷、1,2-双(2,3-环氧丙基)-2,3-乙烯、1,2-双(2,3-环氧丙基)-2,3-emylene及其混合物。在非环氧试剂中，可以提及内源性多胺诸如精胺、精脒和腐胺、醛、碳二亚胺和二乙烯基砜。
[0089]
‑“
水性凝胶”是指可通过根据本发明的方法获得的水性凝胶或根据本发明的水性凝胶，当没有另外说明时。
[0090]
‑“
软凝胶”是指以下特征的凝胶：其粘弹性分布保持适度弹性，就是说，具有在15
°
至50
°
之间的相角(δ)的足够粘性和低弹性模量g
′
，换而言之，小于或等于150pa、优选地在20至150pa之间的g
′
，这使用具有锥/板几何形状(锥角1
°
/板直径40mm)的流变仪(ta instruments dhr2)用5pa的应力在室温应用1hz频率的振动应力摆动测量，；以及小于或等于18n、优选地小于15n的挤出力，这在具有大于或等于6.3mm的内径的注射器中，用具有小于或等于0.3mm(30g)的外径和1/2
″
长度的针头，在室温以约12.5mm/min的固定速度测量。
[0091]
‑“
易于注射”是指，当用测力计如下测量时，具有小于18n、优选地小于15n的平均挤出力的凝胶：在具有大于或等于6.3mm的外径的注射器中,用具有小于或等于0.3mm(30g)的外径和1/2
″
长度的针头，在室温以约12.5mm/min的固定速度。
[0092]
‑“
易于扩散到组织中”的组合物或凝胶是指用于皮肤的再生和外观改善的皮肤应用的组合物，其在注射到皮肤的表层区域(即上真皮和中真皮)中以后不促进丘疹形成。
[0093]
‑“
体内耐久性”是指凝胶在其注射后随时间保留在部位的能力。体内耐久凝胶是能够在部位保留至少1个月、优选地至少3个月、更优选地至少6个月的凝胶，即能够在应用后维持整体美学改善至少1个月、优选地至少3个月、更优选地至少6个月，换而言之，能够在应用后维持在整体美学改善评价的主观量表上的至少等级1或2改善，所述主观量表包含5个等级：1.非常改善；2.改善；3.未变化；4.降级；5.非常降级，并维持至少1个月、优选地至少3个月、更优选地至少6个月。
[0094]-术语“稳定性”表征组合物在至少一年的储存期间根据其规范维持物理化学性能(颜、ph、同质性、浊度、流变学等)的能力。通常通过观察和/或测量其物理化学参数中的一种或多种、特别是其流变学参数中的一种或多种诸如其弹性模量(g
′
)或粘度(η)来监测组合物的稳定性。
[0095]
‑“
无菌凝胶”是指在皮肤的表层区域(即上真皮和中真皮)中或通过其施用时安全的凝胶。特别是，要通过注射技术施用的凝胶必须不含任何可能在宿主生物体中引发不希望的继发反应的污染物。
[0096]-术语“添加剂”、“另外组分”和“赋形剂”互换使用并表示与皮肤内和/或表面上的应用相容的任何组分。所用添加剂的量取决于所述组分的性能、期望的作用和根据本发明的组合物的用途。该添加剂可以是以下组分之一或其衍生物之一：麻醉剂、抗氧化剂、氨基酸、维生素、矿物质、核酸、核苷酸、核苷、辅酶、肾上腺素能衍生物、磷酸二氢钠一水合物和/或二水合物或氯化钠。
[0097]-作为“麻醉剂”，可以提及氨布卡因、阿莫卡因、异戊卡因(amylein)、阿普林定、阿托卡因、阿替卡因、苯佐卡因、贝托卡因、布比卡因、布他卡因、氨苯丁酯、布坦卡因、氯丁醇、氯普鲁卡因、辛、氯达卡因、、克立氟烷、环美卡因、地昔卡因、二胺卡因、地哌冬、达克罗宁、依替卡因、尤普罗辛(euprocine)、febuerine、福莫卡因、胍非卡诺、heptacaine、海克卡因、羟普鲁卡因、羟丁卡因、异布坦本、亮氨卡因、左布比卡因、左沙屈尔、利达脒、利多卡因、洛土卡因、孟格立酯、甲哌卡因、美普卡因、麦替卡因、奥他卡因、奥托君、奥昔卡因、奥布卡因、对乙氧卡因、哌多卡因、非那卡因、哌罗卡因、匹多卡因、聚多卡醇、普莫卡因、丙胺卡因、普鲁卡因、丙泮卡因、丙哌卡因、丙氧卡因、丙美卡因、吡咯卡因、夸他卡因、奎尼卡因、利索卡因、罗多卡因、罗哌卡因、丁卡因、托利卡因、三甲卡因、及其盐。
[0098]-作为“抗氧化剂”，可以提及谷胱甘肽、鞣花酸、精胺、白藜芦醇、视黄醇、l-肉碱、多元醇、多酚、黄酮醇、茶黄素、儿茶素、、泛醇、泛醌、α-硫辛酸。
[0099]-作为“氨基酸”，可以提及精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、氨酸、半胱氨酸。
[0100]-作为“维生素”，可以提及维生素e、a、c、b和特别是维生素b4、b5、b6、b8、b9、b7、b12和优选地吡多辛。
[0101]-作为“矿物质”，可以提及锌、镁、钙、钾、锰、钠、铜的盐。
[0102]-作为“辅酶”，可以提及辅酶q10、coa、nad、nadp。
[0103]-作为“肾上腺素能衍生物”，可以提及肾上腺素和去甲肾上腺素。
[0104]
最后，应当理解，并非严格考虑所有指示的数值，而是根据一般惯例近似地考虑，即，数值的最后一位指示的数字对应于测量的精确度。例如，对于0.04mda的摩尔质量，误差界限是0.035-0.044mda。
[0105]
根据本发明的方法
[0106]
如上所述，本文描述了一种用于制备水性凝胶的方法，一方面，其需要包含至少一种交联的糖胺聚糖(也称作“交联的糖胺聚糖hmw”)的水性溶液，因为它从高摩尔质量的非交联的糖胺聚糖和交联剂形成，且另一方面，其需要包含至少一种低摩尔质量的非交联的糖胺聚糖(称作“非交联的糖胺聚糖lmw”)的水性溶液，并形成所述溶液的全部或部分的均质混合物。
[0107]
在根据本发明的方法中使用的糖胺聚糖可以选自透明质酸、heparosan、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素及其混合物。
[0108]
在本发明的方法中使用的糖胺聚糖可以具有相同的或不同的化学性能。
[0109]
在一个具体实施方案中，在本发明的方法中使用的糖胺聚糖具有相同的化学性能，且优选地都是透明质酸。
[0110]
更具体地，本发明涉及一种用于制备水性凝胶的方法，一方面，其需要包含至少一种交联的透明质酸(也称作“交联的ha hmw”)的水性溶液，因为它从高摩尔质量的非交联的透明质酸和交联剂形成，且另一方面，其需要包含低摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸(其被称作“非交联的ha lmw”)的水性溶液，并形成所述溶液的全部或部分的均质混合物，
[0111]
特征在于，它包含以1:3至2:1的“非交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用透明质酸。
[0112]
在一个具体实施方案中，在本发明的方法中使用的透明质酸没有被化学改性。
[0113]
如前面指出的，根据本发明的方法以水性溶液的形式使用这些糖胺聚糖和优选这些透明质酸，具体地如在根据本发明的方法的步骤a)和b)中所定义。
[0114]
糖胺聚糖、特别是透明质酸的这些溶液有利地是均质的。
[0115]
它们可以根据常规方法制备，例如通过在水性介质(诸如磷酸盐缓冲盐水)中溶解和/或稀释糖胺聚糖、特别是透明质酸(交联的或没有交联的)。这些制备有利地在室温、优选在15℃至25℃之间的温度在机械或手动搅拌下进行。
[0116]
步骤a)
[0117]
关于在步骤a)中考虑的“交联的糖胺聚糖hmw”和特别是“交联的ha hmw”的水性溶液，首先如下得到它们：将具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选1.00mda至4.00mda的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的糖胺聚糖与至少一种交联剂交联；和特
别是首先如下得到它们：将具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选1.00mda至4.00mda的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸与至少一种交联剂交联。
[0118]
这样的交联的实现显然在技术人员的能力范围内。
[0119]
有利地，以按质量计小于或等于8％、优选地小于或等于5％、更优选地小于2％的交联率引入交联剂。
[0120]
有利地，以相对于糖胺聚糖单元的总摩尔数、特别是相对于透明质酸单元的总摩尔数为0.001至0.25的摩尔比引入交联剂。
[0121]
因而，根据一个优选的实施方案，以按质量计小于或等于8％、优选地小于或等于5％和更优选地小于2％的交联率制备所述“交联的ha hmw”。
[0122]
这种交联在各种温度和时间下进行以获得预期的改性程度。
[0123]
因此，在室温(即从15℃至25℃变化的温度)进行的交联可能需要超过5h或甚至10h或更长的反应时间。
[0124]
另一方面，通过刺激要素诸如加热、紫外暴露、微波暴露或催化剂、优选通过使用加热刺激的交联，可以具有显著提高的交联度和小于5小时的持续时间。
[0125]
在一个具体实施方案中，在大于40℃、优选地大于50℃、更具体地在45℃至60℃或再更好地50℃至55℃范围内的温度进行具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的摩尔质量的未交联的糖胺聚糖、特别是未交联的透明质酸的交联。
[0126]
这样的交联有利地具有30-300分钟、优选100-240分钟的持续时间。
[0127]
在一个特别优选的实施方案中，在室温，即，在15℃至25℃范围内的温度，进行具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的摩尔质量的未交联的透明质酸的交联。
[0128]
这样的交联有利地具有超过5h、或甚至大于10h、特别是在10h至100h之间的反应时间。
[0129]
优选地，在根据本发明的方法中使用的交联剂是环氧交联剂，优选1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)。
[0130]
在所使用的交联剂是双官能或多官能环氧交联剂诸如bdde的具体实施方案中，水性介质的ph被碱化或酸化以活化交联反应。根据一个具体实施方案，水性介质通常用含有氢氧化钠的溶液碱化，且优选地，水性介质的ph大于或等于11，更优选地水性介质的ph大于或等于12。
[0131]
根据一个优选的实施方案，调节步骤a)的水性介质的“交联的hmw糖胺聚糖”、更具体地“交联的hmw ha”的浓度，以在步骤c)结束时形成水性凝胶，其中相对于所述水性凝胶的总质量，“交联的hmw糖胺聚糖”、更具体地“交联的hmw ha”的浓度为至少5mg/g。
[0132]
优选地，根据本发明的方法使用包含5-15mg/g的“交联的ha hmw”的水性溶液。
[0133]
步骤b)
[0134]
本发明的方法的步骤b)就其本身而言需要获得包含至少一种“非交联的糖胺聚糖lmw”、特别是至少一种“非交联的ha lmw”的水性溶液。
[0135]
优选地，调节在步骤b)的水性溶液中考虑的“非交联的糖胺聚糖lmw”、特别是“非交联的ha lmw”的浓度以在步骤c)结束时形成水性凝胶，其中相对于所述水性凝胶的总质
量，“非交联的糖胺聚糖lmw”浓度、特别是“非交联的ha lmw”浓度为至少3mg/g，优选10mg/g。
[0136]
优选地，根据本发明的方法使用包含50-60mg/g的“未交联的ha lmw”的水性溶液。
[0137]
如下面详述的，根据本发明的方法还可以包含使用糖胺聚糖、特别是透明质酸，其不同于关于步骤a)和b)所定义的那些。
[0138]
步骤c)
[0139]
如上所述，步骤c)在于从在步骤a)和b)中获得的至少一些或所有溶液形成均质混合物。
[0140]
在步骤c)中考虑的均质混合物的形成有利地涉及至少一种均质化步骤。
[0141]
有利地在温和条件下进行均质化以防止所用的糖胺聚糖链的降解。
[0142]
根据常规均质化方法，诸如三维搅拌、桨式混合器搅拌、刮勺搅拌和/或通过至少一个网格挤出的步骤，可以实现形成至少一种交联的糖胺聚糖和至少一种非交联的糖胺聚糖、特别是至少一种交联的透明质酸和至少一种非交联的透明质酸的均质混合物的该步骤c)。
[0143]
根据一个优选实施方案，步骤c)包含至少一个将形成的混合物通过至少一个网格挤出的步骤。这样的网格的特征的调整是技术人员的一般知识的一部分。通常，随着要形成的混合物的期望性能的变化而选择它们，并考虑混合在一起的糖胺聚糖溶液、特别是透明质酸溶液的各自特性。
[0144]
根据一个具体实施方案，该步骤c)因此包含至少一个借助于桨式混合器的均质化步骤，随后是至少一个通过至少一个网格挤出混合物的步骤。
[0145]
当所获得的凝胶在肉眼上和触觉上具有宏观上均匀的颜、一致的粘度并且没有附聚物时，均质化被认为是令人满意的。本领域技术人员根据其一般知识评估均质化的持续时间。所述均质化可以包含几个循环，任选地在时间上被静止阶段隔开，特别是为了评估在所述凝胶内的糖胺聚糖、特别是透明质酸的均质化质量。
[0146]
更具体地，根据本发明的步骤c)可以包含总持续时间小于200分钟、优选地小于150分钟、或甚至持续时间在5-100分钟范围内的均质化。
[0147]
非交联的hmw糖胺聚糖、特别是非交联的hmw透明质酸
[0148]
在一个具体实施方案中，根据本发明的方法也考虑使用具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的摩尔质量的至少一种非交联的糖胺聚糖，其被称作“非交联的hmw糖胺聚糖”，特别是使用具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”。
[0149]
优选地，所述“非交联的hmw糖胺聚糖”、特别是所述“非交联的ha hmw”在水性溶液中实现。该水性溶液可以与在步骤a)和b)中考虑的水性溶液之一不同或共同。
[0150]
根据一个替代实施方案，在步骤b)的水性溶液中使用所述“未交联的糖胺聚糖hmw”、特别是所述“未交联的ha hmw”的全部或部分。
[0151]
根据另一个替代实施方案，以不同于步骤a)和b)的水性溶液的水性溶液的形式使用所述“非交联的hmw糖胺聚糖”、特别是所述“非交联的ha hmw”的全部或部分。根据该替代实施方案，将含有所述“非交联的hmw糖胺聚糖”、特别是所述“非交联的ha hmw”的全部或部
分的水性溶液和步骤b)的水性溶液同时地或接连地与步骤a)的水性溶液混合。
[0152]
优选地，根据本发明的方法在步骤b)中使用包含5-15mg/g的“未交联的ha hmw”的水性溶液。
[0153]
添加剂
[0154]
在一个具体实施方案中，本发明涉及如上所述的方法，其进一步包含实施至少一种添加剂，所述添加剂选自麻醉剂、抗氧化剂、氨基酸、维生素、矿物质、核酸、核苷酸、核苷、辅酶、肾上腺素能衍生物、磷酸二氢钠一水合物和/或二水合物和氯化钠。
[0155]
灭菌
[0156]
因此，根据本发明的一个方面，为了维持所述凝胶的无菌性，所使用的原材料是无菌的，并且所述凝胶的制备包括在受控的大气条件下进行其在其施用装置中的包装。
[0157]
根据另一个方面，本发明涉及一种用于制备无菌的和可注射的水性凝胶的方法，其包含至少一个在于实现通过根据本发明的方法得到的水性凝胶或在本发明中定义的水性凝胶的步骤和一个灭菌步骤，特别是在高压釜中。
[0158]
更具体地，根据本发明的一种用于制备水性凝胶的方法至少包含以下步骤：
[0159]
a)获得水性溶液，该溶液包含至少一种交联的糖胺聚糖，其被称作“交联的糖胺聚糖hmw”，其从具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的摩尔质量的非交联的糖胺聚糖和从交联剂形成，
[0160]
b)获得水性溶液，该溶液包含具有在0.04mda至0.30mda、优选0.08mda至0.20mda、更优选0.08mda至0.15mda、再更优选0.08mda至0.10mda范围内的摩尔质量的至少一种非交联的糖胺聚糖；被称作“非交联的糖胺聚糖lmw”，
[0161]
c)形成来自步骤a)和b)的所述溶液的全部或部分的均质混合物，将其灭菌，特别是在高压釜中。
[0162]
更具体地，根据本发明的一种用于制备水性凝胶的方法至少包含以下步骤：
[0163]
a)获得水性溶液，该溶液包含至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”，其从具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的非交联的透明质酸以及交联剂形成；
[0164]
b)获得水性溶液，该溶液包含至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”，其具有在0.04mda至0.30mda、优选0.08mda至0.20mda、更优选0.08mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量，
[0165]
c)形成步骤a)和b)的所述溶液的全部或部分的均质混合物，将其灭菌，特别是在高压釜中，
[0166]
特征在于，它包含以1:3至2:1的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用透明质酸。
[0167]
该灭菌优选地在已经包装在其施用装置(通常是注射器)中的产品上进行。
[0168]
因此，有利地，可通过根据本发明的方法获得的水性凝胶在其灭菌之前包装在注射器中。
[0169]
优选地，所述方法包含单个灭菌步骤。
[0170]
优选地，所述灭菌步骤通过热方式进行，例如在高压釜中，特别是在120℃至140℃之间的温度。
[0171]
具体地，在高压釜中，在湿热条件下，在大于或等于121℃、优选地在121℃至135℃之间的平台温度进行灭菌步骤，其中f0大于15(灭菌值)。根据本发明，灭菌值f0对应于在121℃将在待灭菌产品中存在的90％的微生物体灭活所需的时间，以分钟计。
[0172]
水性凝胶
[0173]
如上所述，本发明的一个方面是基于透明质酸的水性凝胶，其包含交联的透明质酸，特征在于，所述凝胶至少包含：
[0174]-具有在0.02mda至0.30mda范围内的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha lmw”，其量相对于透明质酸的总质量按质量计为30％至70％；和
[0175]-任选的，具有大于0.30mda的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha hmw”，
[0176]
且特征在于，总水溶性透明质酸具有小于或等于5％、优选地小于或等于3％、更优选地小于或等于1％的改性程度，可溶性透明质酸的各个百分比如下确定：将所述水性凝胶在含有0.02％nan3的150nm硝酸钠的ph 7.2溶液内在25℃稀释5天，并将它在4400rpm离心10分钟，并将这样的稀释过的凝胶在0.45mm过滤以得到滤液，然后用配备多角度光散射(mals)检测器和折射率(ri)检测器(具有设定在0.165ml/g的折射率增量(dn/dc))的尺寸排阻谱仪器以及配备两组尺寸排阻柱(适用于具有在0.001da至20mda范围内的质量平均摩尔质量的分子)的液体谱泵送站分析所述滤液，其中ph 7.2硝酸钠流动相的流速为0.3ml/min。
[0177]
在一个具体实施方案中，根据本发明的水性凝胶是软凝胶，即具有以下特征的凝胶：在15
°
至50
°
之间的相角(δ)以及小于或等于150pa、优选地在20至150pa之间的弹性模量g
′
，这使用具有锥/板几何形状(锥角1
°
/板直径40mm)的流变仪(ta instruments dhr2)用5pa的应力在室温应用1hz频率的振动应力摆动测量；以及小于或等于18n、优选地小于15n的挤出力，这在具有大于或等于6.3mm的内径的注射器中，用具有小于或等于0.3mm(30g)的外径和1/2
″
长度的针头，在室温以约12.5mm/min的固定速度测量。
[0178]
在一个具体实施方案中，相对于所述水性凝胶的总质量，根据本发明的水性凝胶包含按质量计35％至65％的“sha lmw”。
[0179]
在一个具体实施方案中，在根据本发明的水性凝胶中，所述水溶性透明质酸(被称作“sha lmw”)具有在0.04mda至0.20mda、优选0.04mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量。
[0180]
在一个具体实施方案中，在根据本发明的水性凝胶中，所述水溶性透明质酸(被称作“sha hmw”)具有大于0.30mda且低于或等于4.00mda的质量平均摩尔质量。
[0181]
在一个具体实施方案中，相对于所述水性凝胶的总质量，根据本发明的水性凝胶包含按质量计10％至30％、优选按质量计15％至20％的“sha hmw”。
[0182]
在一个具体实施方案中，在根据本发明的水性凝胶中，相对于所述水性凝胶的总质量，所述交联的透明质酸以至少5mg/g的量存在。
[0183]
在一个具体实施方案中，在根据本发明的水性凝胶中，相对于所述水性凝胶的总质量，所述水溶性透明质酸(被称作“sha lmw”)以至少3mg/g、优选10mg/g的量存在。
[0184]
在一个具体实施方案中，在根据本发明的水性凝胶中，相对于所述水性凝胶的总质量，总透明质酸浓度为10-40mg/g，优选15-35mg/g，更优选20-30mg/g。
[0185]
在一个具体实施方案中，在根据本发明的水性凝胶中，总透明质酸的改性程度小于或等于5％，优选地小于或等于3％，更优选地小于或等于1％。
[0186]
根据一个具体实施方案，在本发明定义的水性凝胶中：
[0187]-相对于所述水性凝胶的总质量，所述交联的透明质酸以在6mg/g至12mg/g范围内的量存在，
[0188]-相对于所述水性凝胶的总质量，所述水溶性透明质酸(被称作“sha lmw”)以在12mg/g至20mg/g范围内的量存在，
[0189]-相对于所述水性凝胶的总质量，所述水溶性透明质酸(被称作“sha hmw”)以在3mg/g至6mg/g范围内的量存在，
[0190]
相对于所述水性凝胶的总质量，所述水性凝胶包含20-30mg/g的总透明质酸浓度。
[0191]
在一个具体实施方案中，对根据本发明的水性凝胶进行热灭菌步骤，例如在高压釜中。
[0192]
已知透明质酸对强酸性和碱性ph、高温(例如在热灭菌过程中)、氧化(例如活性氧物质)和酶活性高度敏感(stern r,kogan g,jedrzejas mj,等人.the many ways to cleave hyaluronan.biotechnol adv 2007；25:537-57)。
[0193]
所以，用于生产包含交联的透明质酸的组合物的制备方法、尤其是交联条件易于降解透明质酸链，从而释放lmw可溶性透明质酸。这样的lmw透明质酸片段至少部分地被所用的交联剂例如被bdde改性。
[0194]
相反，来自在制备方法过程中添加的非交联的lmw透明质酸中的可溶性透明质酸没有被bdde改性。
[0195]
bdde改性可以通过改性程度测量(mod)可视化。在该背景下，可溶性透明质酸的mod越高，在所研究的凝胶的制备方法中产生的lmw透明质酸片段的比例越高，且来自在制备方法中添加的lmw透明质酸中的可溶性透明质酸的比例越低。
[0196]
这在实施例7中进行了解释。
[0197]
上述透明质酸裂解解释了在加热灭菌前加入凝胶内的透明质酸的摩尔质量高于在灭菌的凝胶内测得的可溶性透明质酸的摩尔质量。
[0198]
这样的敏感性也适用于其它糖胺聚糖。
[0199]
实际上，“sha”对应于：
[0200]-在交联步骤a)之后在凝胶制备方法中添加的未交联的ha lmw；和，
[0201]-当存在时，在交联步骤a)之后在凝胶制备方法中添加的未交联的ha hmw；和，
[0202]-在凝胶制备方法中释放的ha片段，所述ha片段至少部分地被交联剂诸如bdde改性。
[0203]
因而，“sha lmw”量至少等于以下物质的量：
[0204]-在交联步骤a)之后在凝胶制备方法中添加的未交联的ha lmw；和，
[0205]-当存在时，在交联步骤a)之后在凝胶制备方法中添加的未交联的ha hmw。
[0206]-相反，“nsha”对应于交联的ha。
[0207]
根据一个具体实施方案，根据本发明的水性凝胶至少包含：
[0208]-具有在0.04mda至0.20mda范围内的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha lmw”，其量相对于透明质酸的总质量按质量计为30％至70％；和
[0209]-任选的，具有大于0.30mda且低于或等于4.00mda的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha hmw”，
[0210]
并且特征在于，总水溶性透明质酸具有小于或等于5％、优选地小于或等于3％、更优选地小于或等于1％的改性程度，
[0211]
可溶性透明质酸的各个百分比如下确定：将所述水性凝胶在含有0.02％nan3的150nm硝酸钠的ph 7.2溶液内在25℃稀释5天，并将它在4400rpm离心10分钟，并将这样的稀释过的凝胶在0.45mm过滤以得到滤液，然后用配备多角度光散射(mals)检测器和折射率(ri)检测器(具有设定在0.165ml/g的折射率增量(dn/dc))的尺寸排阻谱仪器以及配备两组尺寸排阻柱(适用于具有在0.001da至20mda范围内的质量平均摩尔质量的分子)的液体谱泵送站分析所述滤液，其中ph 7.2硝酸钠流动相的流速为0.3ml/min。根据一个具体实施方案，根据本发明的水性凝胶至少包含：
[0212]-具有在0.04mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha lmw”，其量相对于透明质酸的总质量按质量计为30％至70％；和
[0213]-任选的，具有大于0.30mda且低于或等于4.00mda的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha hmw”，
[0214]
并且特征在于，总水溶性透明质酸具有小于或等于5％、优选地小于或等于3％、更优选地小于或等于1％的改性程度，
[0215]
可溶性透明质酸的各个百分比如下确定：将所述水性凝胶在含有0.02％nan3的150nm硝酸钠的ph 7.2溶液内在25℃稀释5天，并将它在4400rpm离心10分钟，并将这样的稀释过的凝胶在0.45mm过滤以得到滤液，然后用配备多角度光散射(mals)检测器和折射率(ri)检测器(具有设定在0.165ml/g的折射率增量(dn/dc))的尺寸排阻谱仪器以及配备两组尺寸排阻柱(适用于具有在0.001da至20mda范围内的质量平均摩尔质量的分子)的液体谱泵送站分析所述滤液，其中ph 7.2硝酸钠流动相的流速为0.3ml/min。
[0216]
根据一个具体实施方案，根据本发明的水性凝胶至少包含：
[0217]-具有在0.02mda至0.30mda范围内的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha lmw”，其量相对于透明质酸的总质量按质量计为35％至65％；和
[0218]-任选的，具有大于0.30mda的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha hmw”，
[0219]
并且特征在于，总水溶性透明质酸具有小于或等于5％、优选地小于或等于3％、更优选地小于或等于1％的改性程度，
[0220]
可溶性透明质酸的各个百分比如下确定：将所述水性凝胶在含有0.02％nan3的150nm硝酸钠的ph 7.2溶液内在25℃稀释5天，并将它在4400rpm离心10分钟，并将这样的稀释过的凝胶在0.45mm过滤以得到滤液，然后用配备多角度光散射(mals)检测器和折射率(ri)检测器(具有设定在0.165ml/g的折射率增量(dn/dc))的尺寸排阻谱仪器以及配备两组尺寸排阻柱(适用于具有在0.001da至20mda范围内的质量平均摩尔质量的分子)的液体谱泵送站分析所述滤液，其中ph 7.2硝酸钠流动相的流速为0.3ml/min。
[0221]
根据一个具体实施方案，根据本发明的水性凝胶至少包含：
[0222]-具有在0.04mda至0.20mda范围内的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha lmw”，其量相对于透明质酸的总质量按质量计为35％至65％；和
[0223]-任选的，具有大于0.30mda且低于或等于4.00mda的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha hmw”，
[0224]
并且特征在于，总水溶性透明质酸具有小于或等于5％、优选地小于或等于3％、更优选地小于或等于1％的改性程度，
[0225]
可溶性透明质酸的各个百分比如下确定：将所述水性凝胶在含有0.02％nan3的150nm硝酸钠的ph 7.2溶液内在25℃稀释5天，并将它在4400rpm离心10分钟，并将这样的稀释过的凝胶在0.45mm过滤以得到滤液，然后用配备多角度光散射(mals)检测器和折射率(ri)检测器(具有设定在0.165ml/g的折射率增量(dn/dc))的尺寸排阻谱仪器以及配备两组尺寸排阻柱(适用于具有在0.001da至20mda范围内的质量平均摩尔质量的分子)的液体谱泵送站分析所述滤液，其中ph 7.2硝酸钠流动相的流速为0.3ml/min。
[0226]
根据一个具体实施方案，根据本发明的水性凝胶至少包含：
[0227]-具有在0.04mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha lmw”，其量相对于透明质酸的总质量按质量计为35％至65％；和
[0228]-任选的，具有大于0.30mda且低于或等于4.00mda的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha hmw”，
[0229]
并且特征在于，总水溶性透明质酸具有小于或等于5％、优选地小于或等于3％、更优选地小于或等于1％的改性程度，
[0230]
可溶性透明质酸的各个百分比如下确定：将所述水性凝胶在含有0.02％nan3的150nm硝酸钠的ph 7.2溶液内在25℃稀释5天，并将它在4400rpm离心10分钟，并将这样的稀释过的凝胶在0.45mm过滤以得到滤液，然后用配备多角度光散射(mals)检测器和折射率(ri)检测器(具有设定在0.165ml/g的折射率增量(dn/dc))的尺寸排阻谱仪器以及配备两组尺寸排阻柱(适用于具有在0.001da至20mda范围内的质量平均摩尔质量的分子)的液体谱泵送站分析所述滤液，其中ph 7.2硝酸钠流动相的流速为0.3ml/min。如上所述，本发明还涉及可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶。
[0231]
在步骤c)结束时，获得均质的水性凝胶，其含有至少一种“非交联的lmw糖胺聚糖”和“hmw糖胺聚糖”，包括至少一种“交联的hmw糖胺聚糖”。
[0232]
有利地，可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶包含相对于其总质量在10-40mg/g、优选15-35mg/g、更优选20-30mg/g范围内的总糖胺聚糖浓度。
[0233]
可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶也可以通过在1:4至4:1、优选1:3至5:3、更优选1:2至2:1范围内的“未交联的糖胺聚糖lmw”:“糖胺聚糖hmw”的质量比来表征。
[0234]
根据一个具体实施方案，所述水性凝胶具有小于5％、优选地小于3％、更优选地小于1％的所述糖胺聚糖的改性程度。
[0235]
更具体地，在步骤c)结束时，得到均质的水性凝胶，其含有至少一种“未交联的ha lmw”和“ha hmw”，包括至少一种“交联的ha hmw”。
[0236]
有利地，可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶包含相对于其总质量在10-40mg/g、优选15-35mg/g、更优选20-30mg/g范围内的总透明质酸浓度。
[0237]
根据一个实施方案，可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶也通过在1:3至5:3、优选1:2至5:3范围内的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比来表征。
[0238]
根据一个具体实施方案，所述水性凝胶具有小于或等于5％、优选地小于或等于
3％、更优选地小于或等于1％的所述透明质酸的改性程度。
[0239]
根据另一个具体实施方案，通过根据本发明的方法得到的所述水性凝胶是软凝胶，就是说具有以下特征的凝胶：在15
°
至50
°
之间的相角(δ)以及小于或等于150pa、优选地在20至150pa之间的弹性模量g
′
，这使用具有锥/板几何形状(锥角1
°
/板直径40mm)的流变仪(ta instruments dhr2)用5pa的应力在室温应用1hz频率的振动应力摆动测量；以及小于或等于18n、优选地小于15n的挤出力，这在具有大于或等于6.3mm的内径的注射器中，用具有小于或等于0.3mm(30g)的外径和1/2
″
长度的针头，在室温以约12.5mm/min的固定速度测量。
[0240]
根据本发明的一个实施方案，所述水性凝胶在实施以下步骤的方法结束时获得：
[0241]-在步骤a)中，包含5-15mg/g的“交联的糖胺聚糖hmw”的水性溶液；
[0242]-在步骤b)中，包含50-60mg/g的“未交联的糖胺聚糖lmw”和5-20mg/g的“未交联的糖胺聚糖hmw”的水性溶液，和，
[0243]
形成的所述凝胶具有相对于其总质量20-30mg/g的总糖胺聚糖浓度。
[0244]
根据本发明的一个实施方案，所述水性凝胶在实施以下步骤的方法结束时获得：
[0245]-在步骤a)中，包含5-15mg/g的“交联的ha hmw”的水性溶液；
[0246]-在步骤b)中，包含50-60mg/g的“未交联的ha lmw”和5-20mg/g的“未交联的ha hmw”的水性溶液，且其中，
[0247]
形成的所述凝胶具有相对于其总质量为20-30mg/g的总透明质酸浓度。
[0248]
可通过根据本发明的方法得到并具有相对于其总质量为10-40mg/g、优选15-35mg/g、更优选20-30mg/g的总糖胺聚糖浓度的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0249]-从具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的摩尔质量的至少一种非交联的糖胺聚糖形成的至少一种交联的糖胺聚糖，其被称作“交联的糖胺聚糖hmw”；
[0250]-具有0.04mda至0.30mda、优选0.08mda至0.20mda、更优选0.08mda至0.15mda、再更优选0.08mda至0.10mda的摩尔质量的至少一种非交联的糖胺聚糖，其被称作“非交联的糖胺聚糖lmw”；和，
[0251]-任选的，具有大于或等于0.50mda、优选地大于1mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的摩尔质量的至少一种非交联的糖胺聚糖，其被称作“非交联的糖胺聚糖hmw”。
[0252]
可通过根据本发明的方法得到并具有相对于其总质量为20-30mg/g的总透明质酸浓度的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0253]-在步骤a)中，包含5-15mg/g的“交联的ha hmw”的水性溶液；
[0254]-在步骤b)中，包含50-60mg/g的“未交联的ha lmw”和5-20mg/g的“未交联的ha hmw”的水性溶液。
[0255]
可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0256]-至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”，其从具有大于1.00mda的质量平均摩尔质量的非交联的透明质酸和交联剂形成；
[0257]-至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”，其具有在0.08mda至
0.20mda范围内的质量平均摩尔质量；和
[0258]-任选的，至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”，其具有大于1.00mda的质量平均摩尔质量，
[0259]
以1:3至2:1的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0260]
可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0261]-至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”，其从具有在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的非交联的透明质酸和交联剂形成；
[0262]-至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”，其具有在0.08mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量；和
[0263]-任选的，至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”，其具有在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量，
[0264]
以1:3至2:1的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0265]
可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0266]-至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”，其从具有大于或等于0.50mda的质量平均摩尔质量的非交联的透明质酸和交联剂形成；
[0267]-至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”，其具有在0.04mda至0.30mda范围内的质量平均摩尔质量；和
[0268]-任选的，至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”，其具有大于或等于0.50mda的质量平均摩尔质量，
[0269]
以1:3至5:3的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0270]
可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0271]-至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”，其从具有大于1.00mda的质量平均摩尔质量的非交联的透明质酸和交联剂形成；
[0272]-至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”，其具有在0.08mda至0.20mda范围内的质量平均摩尔质量；和
[0273]-任选的，至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”，其具有大于1.00mda的质量平均摩尔质量，
[0274]
以1:3至5:3的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0275]
可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0276]-至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”，其从具有在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的非交联的透明质酸和交联剂形成；
[0277]-至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”，其具有在0.08mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量；和
[0278]-任选的，至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”，其具有在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量，
[0279]
以1:3至5:3的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0280]
可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0281]-至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”，其从具有大于或等于0.50mda的质量平均摩尔质量的非交联的透明质酸和交联剂形成；
[0282]-至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”，其具有在0.04mda至0.30mda范围内的质量平均摩尔质量；和，
[0283]-任选的，至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”，其具有大于或等于0.50mda的质量平均摩尔质量，
[0284]
以1:2至5:3的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0285]
可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0286]-至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”，其从具有大于1.00mda的质量平均摩尔质量的非交联的透明质酸和交联剂形成；
[0287]-至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”，其具有在0.08mda至0.20mda范围内的质量平均摩尔质量；和，
[0288]-任选的，至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”，其具有大于1.00mda的质量平均摩尔质量，
[0289]
以1:2至5:3的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0290]
可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0291]-至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”，其从具有在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的非交联的透明质酸和交联剂形成；
[0292]-至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”，其具有在0.08mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量；和，
[0293]-任选的，至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”，其具有在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量，
[0294]
以1:2至5:3的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0295]
可通过根据本发明的方法得到并具有相对于其总质量为10-40mg/g、优选15-35mg/g、更优选20-30mg/g的总透明质酸的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0296]-从具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸和交联剂形成的至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”；
[0297]-具有在0.04mda至0.30mda、优选0.08mda至0.20mda、更优选0.08mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”；和，
[0298]-任选的，具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”，
[0299]
以1:3至2:1的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0300]
可通过根据本发明的方法得到并具有相对于其总质量为10-40mg/g的总透明质酸的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0301]-从具有大于1.00mda的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸和交联剂形成的至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”；
[0302]-具有在0.08mda至0.20mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”；和，
[0303]-任选的，具有大于1.00mda的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，
其被称作“非交联的ha hmw”[0304]
以1:3至2:1的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0305]
可通过根据本发明的方法得到并具有相对于其总质量为20-30mg/g的总透明质酸的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0306]-从具有大于1.00mda的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸和交联剂形成的至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”；
[0307]-具有在0.08mda至0.20mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”；和，
[0308]-任选的，具有大于1.00mda的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”，
[0309]
以1:3至2:1的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0310]
可通过根据本发明的方法得到并具有相对于其总质量为10-40mg/g的总透明质酸的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0311]-从具有在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸和交联剂形成的至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”；
[0312]-具有在0.08mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”；和，
[0313]-任选的，具有在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”，
[0314]
以1:3至2:1的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0315]
可通过根据本发明的方法得到并具有相对于其总质量为20-30mg/g的总透明质酸的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0316]-从具有在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸和交联剂形成的至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”；
[0317]-具有在0.08mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”；和，
[0318]-任选的，具有在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”，
[0319]
以1:3至2:1的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0320]
可通过根据本发明的方法得到并具有相对于其总质量为10-40mg/g、优选15-35mg/g、更优选20-30mg/g的总透明质酸的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0321]-从具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸和交联剂形成的至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”；
[0322]-具有在0.04mda至0.30mda、优选0.08mda至0.20mda、更优选0.08mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”；和，
[0323]-任选的，具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”，
[0324]
以1:3至5:3的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0325]
可通过根据本发明的方法得到并具有相对于其总质量为10-40mg/g、优选15-35mg/g、更优选20-30mg/g的总透明质酸的水性凝胶的代表源自尤其是以下内容的实现：
[0326]-从具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸和交联剂形成的至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”；
[0327]-具有在0.04mda至0.30mda、优选0.08mda至0.20mda、更优选0.08mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”；和，
[0328]-任选的，具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”，
[0329]
以1:2至5:3的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用所述透明质酸。
[0330]
当然，可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶还可以包含一种或多种在这种类型的制剂中常规地考虑的添加剂，且特别是一种或多种如上定义的添加剂。
[0331]
当然，调整添加剂的选择和量，以不增加与根据本发明的凝胶中所用的其它化合物、特别是与所述透明质酸的任何不相容性风险，并且与如下所述的用途相容。这些调整是在本领域技术人员的一般能力范围内。
[0332]
在一个具体实施方案中，本发明还涉及一种组合物，其包含至少一种根据本发明所定义的水性凝胶和如果需要的话至少一种添加剂，所述添加剂选自麻醉剂、抗氧化剂、氨基酸、维生素、矿物质、核酸、核苷酸、核苷、辅酶、肾上腺素能衍生物、磷酸二氢钠一水合物和/或二水合物和氯化钠。
[0333]
在一个优选的实施方案中，所述添加剂是如上定义的麻醉剂，且特别是利多卡因、甲哌卡因或其盐诸如盐酸盐。
[0334]
根据本发明的方法得到的凝胶和根据本发明的水性凝胶作为用于预防和/或皮肤表面外观的改变的组合物是特别有用的。
[0335]
根据本发明的组合物可以是美容和/或皮肤病学组合物。
[0336]
这些组合物可以局部地施用，但是也可以通过注射施用，特别是在皮肤的表层区域中，即在上真皮和中真皮中。
[0337]
当考虑注射时，当然需要所述组合物和/或水性凝胶是无菌的和可注射的。
[0338]
当根据本发明的组合物是局部组合物时，它可以是适合其应用的任何盖仑制剂形式，例如乳膏剂、软膏剂、洗剂、精华(serum)、凝胶或分散体的形式。
[0339]
本领域技术人员众所周知的任何合适的赋形剂，根据预期适应症以适当的量，可以被包含在根据本发明的组合物中。
[0340]
根据另一个方面，本发明涉及根据如上所述的灭菌方法灭菌的可注射水性凝胶。
[0341]
可通过根据本发明的方法得到的这样的水性凝胶的代表特别是包含以下物质的那些：
[0342]-相对于所述水性凝胶的总质量，按质量计0.6-0.8％的至少一种“交联的糖胺聚糖hmw”；
[0343]-相对于所述水性凝胶的总质量，按质量计1.4-1.8％的至少一种“非交联的糖胺
聚糖lmw”；和，
[0344]-相对于所述水性凝胶的总质量，按质量计0.2-0.4％的至少一种“非交联的糖胺聚糖hmw”；
[0345]
且具有20至30mg/g之间的总糖胺聚糖浓度、在15
°
至50
°
之间的相角(δ)和在20至150pa之间的g
′
，这使用具有锥/板几何形状(锥角1
°
/板直径40mm)的流变仪(ta instruments dhr2)用5pa的应力在室温应用1hz频率的振动应力摆动测量，，以及当用测力计如下测量时具有小于或等于15n的挤出力：在具有大于或等于6.3mm的外径的注射器中，用具有小于或等于0.3mm(30g)的外径和1/2
″
长度的针头，在室温以约12.5mm/min的固定速度。
[0346]
可通过根据本发明的方法得到的这样的水性凝胶的代表特别是包含以下物质的那些：
[0347]-相对于所述水性凝胶的总质量，按质量计0.6-1.0％的至少一种“交联的ha hmw”；
[0348]-相对于所述水性凝胶的总质量，按质量计1.4-1.8％的至少一种“非交联的ha lmw”；和，
[0349]-相对于所述水性凝胶的总质量，按质量计0.2-0.6％的至少一种“非交联的ha hmw”；
[0350]
且具有20至30mg/g之间的总透明质酸浓度、在15
°
至50
°
之间的相角(δ)和在20至150pa之间的g
′
，这使用具有锥/板几何形状(锥角1
°
/板直径40mm)的流变仪(ta instruments dhr2)用5pa的应力在室温应用1hz频率的振动应力摆动测量，以及当用测力计如下测量时具有小于或等于18n的挤出力：在具有大于或等于6.3mm的外径的注射器中，用具有小于或等于0.3mm(30g)的外径和1/2
″
长度的针头，在室温以约12.5mm/min的固定速度。
[0351]
试剂盒
[0352]
具体地，本发明涉及一种预装注射器，其包含可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶或在本发明中定义的水性凝胶或根据本发明的美容和/或皮肤病学组合物。
[0353]
根据另一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含预装注射器和使用说明书，所述预装注射器包含可通过根据本发明的方法得到的水性凝胶或在本发明中定义的水性凝胶或根据本发明的美容和/或皮肤病学组合物。
[0354]
用途
[0355]
根据另一个方面，本发明涉及用于预防和/或皮肤表面外观的改变的根据本发明的水性凝胶或根据本发明的皮肤病学组合物。优选地，本发明涉及用于增大和/或填充软组织的在本发明中定义的水性凝胶或在本发明中定义的皮肤病学组合物。
[0356]
还描述了用于预防和/或皮肤的改变的粘弹性或生物力学性能的在本发明中定义的水性凝胶或根据本发明的皮肤病学组合物。
[0357]
还描述了用于预防和/或由外界因素诸如应力、空气污染、烟草或长时间暴露于紫外(uv)线诱导的皮肤征象的在本发明中定义的水性凝胶或根据本发明的皮肤病学组合物。
[0358]
本发明还涉及在本发明中定义的水性凝胶或根据本发明的美容组合物用于预防
和/或皮肤的表面外观的改变诸如用于预防和/或年龄老化的皮肤征象的非性美容用途。
[0359]
本发明还涉及在本发明中定义的水性凝胶或根据本发明的美容组合物用于增大和/或填充软组织、特别是填充皱纹的非性美容用途。
[0360]
本发明还涉及一种用于预防和/或皮肤的表面外观的改变的方法，其包含至少一个在受试者诸如有此需要的患者上局部施用有效量的在本发明中定义的水性凝胶或根据本发明的皮肤病学组合物的步骤，或通过向受试者诸如有此需要的患者的体内注射而施用有效量的在本发明中定义的水性凝胶或根据本发明的皮肤病学组合物的步骤。
[0361]
本发明还涉及一种用于增大和/或填充软组织、特别是用于填充皱纹的方法，其包含至少一个在受试者诸如有此需要的患者上局部施用有效量的在本发明中定义的水性凝胶或根据本发明的美容和/或皮肤病学组合物的步骤，或通过向受试者诸如有此需要的患者的体内注射而施用有效量的在本发明中定义的水性凝胶或根据本发明的美容和/或皮肤病学组合物的步骤。
实施例
[0362]
材料
[0363]
为以下不同实施例制备了单独样品组。在这些系列之间存在不可避免的差异，尤其是由于使用了不同批次的透明质酸或不同的灭菌周期。因此，重要的是要注意这些系列之间的实施例间对比是不适当的。
[0364]
方法
[0365]
以下方案用于研究在实施例中分析的组合物的粘弹性性能。
[0366]
样品的流变学表征
[0367]
在室温用流变仪(ta instruments dhr2)测量组合物的粘弹性性能，所述流变仪具有锥/板几何形状(锥角1
°
/板直径40mm)。执行1hz频率的振动应力摆动测量。在5pa的应力下测量弹性模量(g
′
，以pa为单位)、相角(δ，以
°
为单位)和复态粘度(η*)
[0368]
样品的挤出力的表征
[0369]
使用测力计如下确定样品挤出力：25-mm下落路径，在具有6.4mm内径的1ml coc注射器中，用30g 1/2
″
针头在室温以12.5mm/min的固定速度。
[0370]
样品随时间和在热下的降解抗性的表征
[0371]
通常通过高压釜(湿热灭菌方法)进行透明质酸可注射凝胶的灭菌。
[0372]
通过高温强迫降解试验(astm f1980-16)，可以以加速方式评价这些组合物的储存稳定性。
[0373]
通过弹性模量(g
′
)的显著损失来表征凝胶的降解。
[0374]
在该背景下，在灭菌后g'的损失百分比(δg
′
(％))是随着时间和在热灭菌下凝胶对降解的抗性的相关指标。
[0375]
为此，如下计算在灭菌时g'的变化：
[0376]
δg
′
(％)＝[(灭菌后的g'-灭菌前的g')/灭菌前的g']x 100
[0377]
另外，g'的改善百分比定义如下：
[0378]g′
改善(％)＝[(δg
′
参照样品-δg
′
研究样品)/δg
′
参照样品]x 100
[0379]
样品对酶促降解的抗性的表征
[0380]
为了研究样品对酶促降解的抗性，将2g试验凝胶与在磷酸盐缓冲盐水中的透明质酸酶(ha酶)溶液(0.5u/ml的凝胶)接触并均质化，然后放入烘箱中在37℃保持24h。
[0381]
通过酶处理之前和之后的流变学测量来表征每个样品，并如下计算降解之前/之后g'的变化：δg
′
＝[(最终g
′‑
初始g
′
)/初始g
′
]x 100。g'的这种变化是在有ha酶存在下凝胶降解程度的直接指标。
[0382]
存在于样品中的水溶性和非水溶性透明质酸的尺寸和分布表征
[0383]
通过配备多角度激光散射检测器(dawn neon mals,wyatt technology corp)和折射率检测器(optilab,wyatt technology corp)的尺寸排阻谱法(sec)确定从ha凝胶释放的sha的mw和量。该仪器使用配备两组保持串联流的尺寸排阻柱ohpak lb-806m(shodex)的agilent infinity lc系统，所述尺寸排阻柱覆盖宽范围的质量平均摩尔质量(从0.001mda至20mda)。以0.3ml/min的流速使用150mm硝酸钠(含有0.02％nan3)的ph 7.2流动相作为洗脱液。在这些条件下，将折射率增量(dn/dc)设置为0.165ml/g。使用astra软件(wyatt technology corp)获得并分析谱图。
[0384]
样品制备在于：将所述水性凝胶在含有0.02％nan3的150nm硝酸钠的ph 7.2溶液内在25℃稀释5天，然后将它在4400rpm离心10分钟并将它在0.45mm过滤以得到滤液，然后用如上所述配备的sec分析所述滤液。
[0385]
根据上清液组成的变化适当调整用于稀释步骤的流动相中的凝胶浓度以及sec中的注射体积，以最大化信噪比和避免柱过载。
[0386]
确定的sha百分比对应于水溶性ha的质量与样品中ha的总质量之比。
[0387]
通过1h nmr确定存在于样品中的水溶性透明质酸的改性程度
[0388]
将3g的每种样品与10ml注射用水一起在室温温育5天。然后将样品稍微离心(4400rpm，10min)以将凝胶与上清液(含有水溶性ha)分离并在0.45mm过滤以除去不溶性凝胶聚集体。将上清液冷冻干燥并用1ml的d2o溶解。在500mhz bruker avance波谱仪上进行1h nmr分析。通过交联剂信号与ha二糖单元信号(ha是交联的或非交联的)的摩尔比确定改性程度。
[0389]
实施例1
[0390]
给交联的hmw透明质酸组合物补充非交联的lmw透明质酸的效果
[0391]
所研究的样品如下所示。
[0392]
对比样品1-1是一种交联的透明质酸凝胶，其在注射器中在高压釜中灭菌并从hmw透明质酸(4.00mda，htl，欧洲药典药用/医用级)和bdde(sigma aldrich,≥95％)制备，具有20mg/g的总透明质酸浓度和2％的改性程度。
[0393]
根据本发明的样品1-2是一种交联的透明质酸凝胶，其在注射器中在高压釜中灭菌，具有20mg/g的总透明质酸浓度并从灭菌前的样品1-1与未交联的lmw透明质酸钠(0.10mda，htl，欧洲药典药用/医用级)的20mg/g溶液的1:1混合物制备。
[0394]
对比样品1-3是一种交联的透明质酸凝胶，其在注射器中在高压釜中灭菌，具有10mg/g的总透明质酸浓度并从灭菌之前的样品1-1与不含非交联的透明质酸的磷酸盐缓冲盐水溶液的1:1混合物制备。
[0395]
样品的特征、它们的g
′
和它们在灭菌后的g
′
损失总结在下面表1和图1中。
[0396]
表1
[0397][0398]
结果表明，与具有相同总透明质酸浓度但不包含lmw透明质酸的组合物(样品1-1(参照))相比，包含lmw透明质酸的组合物(根据本发明的样品1-2)具有更好的降解抗性。
[0399]
此外，看起来交联的hmw透明质酸的浓度越高，组合物的稳定性越大。因此，与包含20mg/g hmw透明质酸的样品1-1(对比)(δg
′
＝-10.8％)相比，样品1-3(对比,10mg/g hmw透明质酸)显示出更大的g
′
损失(δg
′
＝-21.6％)。尽管如此，这种稳定性增加远低于对包含非交联的lmw透明质酸的样品1-2(本发明)所见(δg
′
＝-2.4％)。
[0400]
因此，与组合物的降解抗性的增加相关的不是总透明质酸浓度的简单增加，而是给有关的hmw透明质酸组合物的补充。
[0401]
实施例2
[0402]
给基于交联的hmw透明质酸、任选地包含非交联的hmw透明质酸的组合物补充lmw透明质酸的效果
[0403]
如下制备样品2-1。
[0404]
在基础介质中从未交联的hmw透明质酸(htl,4.00mda，欧洲药典药用/医用级)制备bdde交联的透明质酸凝胶。将得到的交联的级分中和并在磷酸盐缓冲盐水中溶胀以得到具有15mg/g naha的最终凝胶。然后将它透析。在该阶段，所述凝胶具有约80pa至120pa的弹性模量g
′
和7
°
至10
°
的相角δ。
[0405]
将未交联的hmw透明质酸钠(4.00mda，htl，欧洲药典药用/医用级)的15mg/g溶液加入到交联的级分中以达到相对于组合物中透明质酸的总质量为按质量计30％的比例。将凝胶均质化，通过网格挤出并填充进1ml coc注射器中。最后，将凝胶高压灭菌。
[0406]
样品2-2的制备类似于样品2-1，但是使用的未交联的透明质酸凝胶的组成已经被改变，使得最终凝胶进一步包括10mg/g的未交联的lmw透明质酸(0.10mda，htl，欧洲药典药用/医用级)。
[0407]
样品2-3的制备如样品2-1，但是没有非交联的4.00mda透明质酸。
[0408]
样品2-4的制备如样品2-1，但是用0.10mda透明质酸替代使用的非交联的4.00mda透明质酸。
[0409]
对于这些样品中的每一个，计算g
′
的变化(按百分比)。得到的结果总结在下表中。
[0410]
表2显示了交联的和非交联的透明质酸的混合物的稳定化。
[0411]
表2
[0412][0413]
表3显示了单独的交联的透明质酸的稳定化。
[0414]
表3
[0415][0416]
结果表明，对于包含单独的交联的hmw透明质酸的组合物(样品2-4相对于样品2-3)和对于包含交联的和非交联的hmw透明质酸的混合物的组合物(样品2-2相对于样品2-1)，观察到在高压釜灭菌过程中非交联的lmw透明质酸的保护作用。
[0417]
因而，非交联的lmw透明质酸向包含单独的交联的hmw透明质酸的组合物(样品2-4)或包含交联的hmw透明质酸与非交联的hmw透明质酸混合的组合物(样品2-2)的添加有利地增加了它们对降解的抗性。
[0418]
实施例3
[0419]
包含不同摩尔质量的非交联的透明质酸的透明质酸凝胶的流变学和稳定性的研究
[0420]
不同摩尔质量的透明质酸溶液的流变学
[0421]
在磷酸盐缓冲盐水中制备不同摩尔质量(0.04mda、0.10mda、0.20mda和1.50mda，htl，欧洲药典药用/医用级)的非交联的透明质酸的10mg/g(1％)的溶液。确定这些级分中的每种的弹性模量(g
′
)和复态粘度(η*)并详述在下面表4中。
[0422]
表4
[0423][0424]
**n.d.在5pa应力下不可测定(样品3-1:η*＝2.55mpa.s和g
′
＝0.65pa至0.6pa；样品3-2:η*＝5.2mpa.s和g
′
＝0.0057pa至1pa)。
[0425]
以上结果表明，基于单独的具有小于或等于0.20mda的摩尔质量的未交联的透明质酸并在1％浓缩的凝胶没有显著的弹性性能和具有非常低的粘度。
[0426]
机械贡献
[0427]
如下制备交联的和非交联的hmw透明质酸的混合物，即样品3-5(参照)。在基础介质中从未交联的hmw透明质酸(4.00mda，htl，欧洲药典药用/医用级)制备bdde-交联的透明质酸凝胶。将得到的交联的级分中和并在磷酸盐缓冲盐水中溶胀以得到具有15mg/g naha的最终凝胶。然后将它透析。在该阶段，所述凝胶具有约80-120pa的弹性模量g
′
和7-10
°
的相角δ。将未交联的hmw透明质酸钠(4.00mda，欧洲药典药用/医用级)的15mg/g溶液加入到交联的级分中以达到相对于组合物中透明质酸的总质量为按质量计30％的比例。将凝胶均质化，通过网格挤出并填充进1ml coc注射器。最后，将凝胶高压灭菌。
[0428]
样品3-6至3-9的制备类似于样品3-5，但是具有非交联的透明质酸凝胶，所述凝胶进一步包含相对于组合物的总质量为10mg/g的额外的固定浓度的非交联的透明质酸(1％)。
[0429]
对于此添加，使用不同摩尔质量的非交联的透明质酸，即对于样品3-6至3-9，按顺序为：0.04mda、0.10mda、0.20mda和1.50mda，htl，欧洲药典药用/医用级)。
[0430]
在每个样品的6个注射器中在灭菌之前和之后测定这些样品的流变学特征。灭菌后的结果总结在下面表5和图2中。
[0431]
表5
[0432][0433]
*平均值显著不同于参照样品的平均值，p《0.001,双样品t检验。
[0434]
由于未交联的lmw透明质酸的有限机械贡献，样品3-6至3-8保持软凝胶，即，具有在15
°
至45
°
之间的δ、小于或等于150pa的g
′
和小于或等于18n的挤出力的凝胶。
[0435]
应当指出，额外的lmw透明质酸的存在以及因此在根据本发明的凝胶中增加的透明质酸浓度不影响它们的柔性。
[0436]
另一方面，包含额外的hmw透明质酸的对比样品3-9显示出非常显著地增加的流变学特征，且不再被视为软凝胶(g
′
》150pa)。
[0437]
对降解的抗性
[0438]
通过计算在经历相同的高压釜循环l以后的g'损失的百分比，研究每个样品对热降解的抗性。
[0439]
得到的结果总结在下面表6、图2和图3中。
[0440]
表6
[0441][0442]
如在图2中所示，在实施的灭菌条件(对于所有试验样品是相同的)下，参照样品3-5遭受约20％的损失。
[0443]
非交联的hmw透明质酸(1.50mda,样品3-9)的添加没有改善灭菌后g'的损失，其仍然高于参照样品3-5的g'的损失(20％)。
[0444]
相反，根据本发明的补充，即，具有在0.04mda至0.20mda、更优选0.08mda至0.10mda范围内的摩尔质量的透明质酸的添加是灭菌后g
′
损失减少的来源(样品3-6至3-8
与样品3-5的对比)，即，所述组合物的降解抗性增加的来源。
[0445]
因此，与具有相同总透明质酸浓度、相同交联的hmw透明质酸级分的交联率、但没有补充的组合物相比，根据本发明补充了lmw透明质酸的组合物具有更好的降解抗性。
[0446]
该改善是微小的，但在使用的透明质酸的最低摩尔质量(0.04mda)时已经是值得注意的(样品3-6)。该改善对于0.10mda和0.20mda透明质酸(样品3-7和3-8)是显著的。
[0447]
因此，灭菌后在每种产品的6个注射器中的6次测量值的平均值的对比表明，样品3-7和3-8的g'值显著高于样品3-5(图2和3)。
[0448]g′
的这种增加与制剂中使用的lmw ha和hmw透明质酸之间的相互作用有关，且尤其是与提高的对降解的抗性(其与所述组合物中lmw ha的存在相关，通过灭菌后g'损失值的改善可见)的效果有关。
[0449]
因此，虽然非交联的hmw透明质酸(例如1.50mda)的添加增加了组合物的机械性能而没有显著改善其对降解的抗性，但非交联的lmw ha的补充在维持软凝胶的机械性能的同时增加了凝胶的对降解的抗性。
[0450]
实施例4
[0451]
补充中的变化的影响
[0452]
对于本实施例，对比样品4-1与在实施例3中制备的样品3-5(对比)相同。为了研究不同浓度的非交联的lmw ha的影响，制备了不同的样品。
[0453]
将样品4-1与以类似方式制备的样品4-2至4-4进行对比，但对于样品4-2至4-4使用的非交联的透明质酸凝胶的组成进一步包含递增浓度的非交联的lmw ha (0.10mda htl，欧洲药典药用/医用级)。
[0454]
非交联的lmw ha (0.10mda，htl，欧洲药典药用/医用级)的比例对应于组合物中非交联的lmw透明质酸的质量与交联的hmw透明质酸的质量之比(％)。
[0455]
样品的流变学特征和它们在灭菌后的g
′
损失δg
′
(％)总结在下面表7和图4中。
[0456]
表7
[0457][0458][0459]
在根据本发明的所有样品4-2至4-4中都可以看到补充的稳定效果。
[0460]
因此，可能获得给包含至少一种交联的hmw透明质酸的凝胶补充更大或更小量的
非交联的lmw ha的有利效果。
[0461]
此外，上述结果表明，当实现低比例的非交联的lmw ha (约50％)或更高比例的非交联的lmw ha (约150％)时，得到高度浓缩的透明质酸组合物(高达30mg/g总透明质酸)，其保持软和易于注射。
[0462]
实施例5
[0463]
hmw透明质酸浓度的变化的影响
[0464]
对于本实施例，以与在实施例3中制备的样品3-5(对比)相同的方式制备对比样品5-1。为了研究固定浓度的非交联的lmw透明质酸对不同浓度的交联的和非交联的hmw透明质酸的组合物的影响的目的，制备了根据本发明的样品5-2和5-3，且其包含比以前实施例中更低浓度的hmw透明质酸。
[0465]
样品5-2的制备类似于样品5-1，但是交联的透明质酸级分的目标浓度为12mg/g且非交联的hmw透明质酸溶液的目标浓度为12mg/g，向其中加入足够量的0.10mda非交联的透明质酸(htl，欧洲药典药用/医用级)以导致最终组合物中16mg/g的0.10mda非交联的透明质酸的浓度。
[0466]
也与参照样品类似地制备样品5-3，但是交联的hmw透明质酸级分的目标浓度为9mg/g且非交联的hmw透明质酸溶液的目标浓度为9mg/g，向其中加入足够量的0.10mda非交联的lmw透明质酸(htl，欧洲药典药用/医用级)以导致最终组合物中16mg/g的0.10mda非交联的透明质酸的浓度。
[0467]
样品5-1至5-3的流变学特征、它们的非交联的lmw透明质酸的比例(％)和它们在灭菌后的g
′
损失(δg
′
(％))总结在下面表8中。
[0468]
表8
[0469][0470]
由于非交联的lmw透明质酸的添加，可能将交联的和非交联的hmw透明质酸的比例从15mg/g降低到12mg/g，并且仅观察到g'的稍微下降(样品5-1(对比)相对于样品5-2(本发明))。
[0471]
此外，由于非交联的lmw透明质酸的添加，可能从含有15mg/g的透明质酸的凝胶变成含有28mg/g的透明质酸的凝胶，同时维持软凝胶的机械性能(样品5-1(对比)相对于样品5-2(本发明))。
[0472]
用非常少量的交联的和非交联的hmw透明质酸制备的样品5-3在灭菌后显示出g
′
的最小损失(仅-4％)。
[0473]
非交联的lmw透明质酸的存在有利地减少了制备软凝胶所需的交联的透明质酸的量。还可能增加总透明质酸浓度。换而言之，所述补充因此使得可能获得软凝胶，其具有潜在增加的生物相容性(使用的交联的透明质酸的比例的减小)，但从生物力学和/或生物学的角度来看也是有效的。
[0474]
实施例6
[0475]
对酶促降解的抗性
[0476]
使用与在实施例3中制备的样品3-5(对比)相同的方案制备样品6-1。
[0477]
以类似的方式制备样品6-2，但是使用的未交联的透明质酸凝胶的组成被改变，使得最终凝胶进一步包含10mg/g的未交联的lmw透明质酸(0.10mda，htl，欧洲药典药用/医用级)。
[0478]
也与样品6-1类似地制备样品6-3，但是使用的未交联的透明质酸凝胶的组成被改变，使得最终凝胶进一步包含10mg/g的未交联的hmw透明质酸(1.50mda，htl，欧洲药典药用/医用级)。
[0479]
对所有这些样品都进行使用透明质酸酶(ha酶)的酶促降解试验。
[0480]
样品的流变学特征和它们对酶促降解的g'损失总结在下面表9和图5中。
[0481]
表9
[0482][0483]
应当指出，样品6-2和6-3(分别包含具有0.10mda和1.50mda的摩尔质量的透明质酸)具有非常不同的起始性能。样品6-3的性能不适用于皮肤再生和/或皮肤改善应用(参见δ、g
′
和f)。
[0484]
在有非交联的lmw透明质酸存在下对酶促降解的g
′
损失低于在没有非交联的lmw透明质酸存在下的情况(样品6-2相对于样品6-1)，且甚至低于在有非交联的hmw透明质酸存在下的情况(样品6-2相对于样品6-3)。因此，呈现为符合本发明的组合物(样品6-2)的增
加的抗性与简单添加非交联的透明质酸无关，而是与添加非交联的lmw透明质酸特别相关。
[0485]
因此，与具有相同总透明质酸浓度、相同交联的透明质酸级分的交联率、但仅包含hmw透明质酸的组合物相比，根据本发明补充的组合物具有更好的对酶促降解的抗性。
[0486]
这种增加的对透明质酸酶降解的抗性表明根据本发明的组合物的增加的体内耐久性。
[0487]
最后，上述结果突出了非交联的lmw透明质酸的保护作用，因此突出了给基于至少一种交联的糖胺聚糖的组合物补充的有益效果。
[0488]
实施例7
[0489]
在样品中存在的水溶性和非水溶性透明质酸的表征
[0490]
如上所述表征了几种灭菌样品的水溶性和非水溶性透明质酸(sha和nsha)。从htl获得ha原料欧洲药典药用/医用级
[0491]
下述组合物是考虑的参照：
[0492]-样品7-1:交联的ha hmw：在磷酸盐缓冲液中用单独的ha4,00mda制备的交联的ha凝胶；该交联的ha如样品2-1的交联的ha部分来制备，但被溶胀以获得相对于凝胶总质量具有10.5mg/g的naha的浓度的凝胶；
[0493]-样品7-2:非交联的ha hmw：在磷酸盐缓冲液中用单独的ha4,00mda制备的非交联的ha，具有相对于凝胶的总质量为4.5mg/g的naha的浓度；
[0494]-样品7-3:非交联的ha lmw：在磷酸盐缓冲液中用单独的ha0.10mda制备的非交联的ha，具有相对于凝胶的总质量为10mg/g的naha的浓度。
[0495]
以下三个样品在工艺中添加了不同比例的hmw ha和lmw ha。
[0496]-样品7-4:一种凝胶，如先前呈现的样品2-4，在灭菌前包含用单独的ha4.00mda制备的交联的ha hmw和用ha 0.10mda制备的非交联的ha lmw；
[0497]-样品7-5:一种凝胶，在灭菌前包含用单独的ha hmw 4.00mda制备的交联的ha和用ha 0.10mda制备的非交联的ha lmw和用ha 4.00mda制备的非交联的ha hmw；所述凝胶对应于样品2-1，进一步包含相对于凝胶的总质量而言10mg/g的非交联的ha lmw 0.10mda的额外固定浓度(1％)；
[0498]-样品7-6:一种凝胶，如先前呈现的样品2-1，包含用ha 4.00mda制备的交联的ha hmw和未交联的ha hmw 4.00mda。
[0499]
对所有样品7-1至7-6通过高压灭菌(湿热)进行灭菌，f0》15min。
[0500]
此外，由allergan,juvederm volift商业化的产品作为样品7-7进行试验。该产品采用vycross交联技术制造，已知该其是指用具有不同质量平均摩尔质量的透明质酸制备的交联的透明质酸(包括大比例的lmw ha)。所述产品包含盐酸利多卡因，总ha浓度为17.5mg/g，并经湿热灭菌。
[0501]
表10
[0502][0503][0504]
样品7-1(100％的ha参与交联反应)显示出具有17％的mod的sha，而样品7-2和7-3(灭菌的单独的未交联的ha)在逻辑上不存在任何mod。交联的样品7-1释放出sha片段(主要是lmw)，所述片段被交联剂高度改性。使用4.00mda非交联的ha原料制造的样品7-2呈现出其最大的高于0.30mda的sha比例，而使用0.10mda非交联的ha原料制造的样品7-3呈现出低于0.30mda的其总sha比例。
[0505]
由于未交联的lmw(0.10mda)ha增加sha中的ha二糖单元的摩尔量从而降低mod值的事实，所以与没有补充的情况下制备的组合物相比，根据本发明的经补充的组合物含有具有更低mod的sha(样品7-4相对于7-1，7-5相对于7-6)。值得注意的是，根据本发明的凝胶(样品7-3和7-4)呈现出与样品7-5、7-6和7-7相比更高比例的低于0.3mda的lmw sha。尤其是，用高比例的非交联的lmw ha进行交联制造的商业样品7-7没有呈现如此高量的lmw sha。
[0506]
我们可以在理论上预期，用非交联的ha lmw补充的包含交联的ha hmw的组合物具有等于以下各项之和总sha百分比：
[0507]-非交联的ha lmw相对于组合物中ha的总质量的百分比，和
[0508]-对于交联部分单独所测量的总sha相对于ha的总质量的百分比。
[0509]
样品7-1(100％的ha参与交联反应)显示出总sha相对于组合物中ha的总质量为20.6％，因此，我们可以在理论上预期样品7-3(与样品7-1相同的交联的ha的基础，进一步包含非交联的ha lmw)相对于组合物中ha的总质量具有约30+20.6＝50.6％的sha。
[0510]
但是，样品7-3的测量的总sha百分比低了约10个点(40.5％)。这表明，根据本发明的补充在制造工艺过程中保护了ha链，从而降低了lmw sha的释放，换句话说，它增加了组合物对降解的抗性。
[0511]
综上所述，
[0512]
sec和1h nmr技术可以成功地用于表征凝胶sha并帮助区分标准凝胶与根据本发明的凝胶。
[0513]
实施例8
[0514]“halmw非交联的”相对于“ha hmw”的质量比的影响
[0515]
研究的样品在下文中呈现。
[0516]
根据本发明的样品8-1是在注射器内通过高压灭菌(f0》15分钟)灭菌的交联的透明质酸的凝胶，具有20mg/g的透明质酸总浓度，并且在灭菌前以1:1的比例混合以下物质得到：
[0517]-用非交联的ha hmw(4.00mda，htl，药用/医用欧洲药典级)和bdde(sigma aldrich,≥95％)制备的交联的透明质酸凝胶，具有在磷酸盐缓冲液内20mg/g的透明质酸总浓度和2％的交联率；和，
[0518]-20mg/g的非交联的ha lmw(0.10mda,altergon,药用/医用欧洲药典级)的非交联的透明质酸溶液。
[0519]
样品8-2是如样品8-1制备的对比凝胶，但是用2mg/g的非交联的ha lmw(010mda,altergon,药用/医用欧洲药典级)在磷酸盐缓冲液中的非交联的透明质酸溶液替代20mg/g的非交联的ha lmw(0.10mda,altergon,药用/医用欧洲药典级)的非交联的透明质酸溶液。
[0520]
样品8-3是相对于凝胶的总质量具有10mg/g的交联的hmw ha浓度的参照凝胶。它的制备如样品8-1，但是使用单独的磷酸盐缓冲液替代20mg/g的非交联的ha lmw(0.10mda,altergon,药用/医用欧洲药典级)的非交联的透明质酸溶液。
[0521]
表11
[0522][0523]
样品8-1具有良好的g'改善百分比，而样品8-2具有更低的g'改善百分比。因此，可以推断需要足够比例的lmw ha才能获得显著的g'改善百分比。

技术特征：

1.一种基于透明质酸的水性凝胶，其包含交联的透明质酸，特征在于，所述凝胶至少包含：-具有在0.02mda至0.30mda范围内的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha lmw”，其量相对于透明质酸的总质量按质量计为30％至70％；和-任选的，具有大于0.30mda的质量平均摩尔质量的水溶性透明质酸，其被称作“sha hmw”，并且特征在于，所述水溶性透明质酸具有小于或等于5％、优选地小于或等于3％、更优选地小于或等于1％的改性程度，可溶性透明质酸的各个百分比如下确定：将所述水性凝胶在含有0.02％nan3的150nm硝酸钠的ph 7.2溶液内在25℃稀释5天，并将它在4400rpm离心10分钟，并将这样的稀释过的凝胶在0.45mm过滤以得到滤液，然后用配备多角度光散射(mals)检测器和折射率(ri)检测器的具有设定在0.165ml/g的折射率增量(dn/dc)的尺寸排阻谱仪器以及配备两组尺寸排阻柱的适用于具有在0.001da至20mda范围内的质量平均摩尔质量的分子的液体谱泵送站分析所述滤液，其中ph 7.2硝酸钠流动相的流速为0.3ml/min。2.在权利要求1中要求保护的水性凝胶,所述凝胶是具有以下特征的软凝胶：在15
°
至50
°
之间的相角(δ)以及小于或等于150pa、优选地在20至150pa之间的弹性模量g
′
，这使用具有锥/板几何形状的流变仪在室温在5pa的应力下应用1hz频率的振动应力摆动测量；以及小于或等于18n、优选地小于15n的挤出力，这在具有大于或等于6.3mm的内径的注射器中，用具有小于或等于0.3mm(30g)的外径和1/2
″
长度的针头，在室温以约12.5mm/min的固定速度测量。3.在权利要求1或权利要求2中要求保护的水性凝胶，所述凝胶包含相对于所述水性凝胶的总质量按质量计为35％至65％的“sha lmw”。4.在权利要求1-3中的任一项中要求保护的水性凝胶，其中所述被称作“sha lmw”的水溶性透明质酸具有在0.04mda至0.20mda、优选0.04mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量。5.在权利要求1-4中的任一项中要求保护的水性凝胶，其中所述被称作“sha hmw”的水溶性透明质酸具有大于0.30mda且低于或等于4.00mda的质量平均摩尔质量。6.在权利要求1-5中的任一项中要求保护的水性凝胶，所述凝胶包含相对于所述水性凝胶的总质量按质量计为10％至30％、优选按质量计为15％至20％的“sha hmw”。7.在权利要求1-6中的任一项中要求保护的水性凝胶，其中所述交联的透明质酸以相对于所述水性凝胶的总质量为至少5mg/g的量存在。8.在权利要求1-7中的任一项中要求保护的水性凝胶，其中所述被称作“sha lmw”的水溶性透明质酸以相对于所述水性凝胶的总质量为至少3mg/g、优选10mg/g的量存在。9.在权利要求1-8中的任一项中要求保护的水性凝胶，其中相对于所述水性凝胶的总质量，所述总透明质酸浓度为10-40mg/g，优选15-35mg/g，更优选20-30mg/g。10.在权利要求1-9中的任一项中要求保护的水性凝胶，其中所述总透明质酸的改性程度小于或等于5％，优选地小于或等于3％，更优选地小于或等于1％。11.在权利要求1-10中的任一项中要求保护的水性凝胶，其中：-相对于所述水性凝胶的总质量，所述交联的透明质酸以在6mg/g至12mg/g范围内的量
存在，-相对于所述水性凝胶的总质量，所述被称作“sha lmw”的水溶性透明质酸以在12mg/g至20mg/g范围内的量存在，-相对于所述水性凝胶的总质量，所述被称作“sha hmw”的水溶性透明质酸以在3mg/g至6mg/g范围内的量存在，相对于所述水性凝胶的总质量，所述水性凝胶包含20-30mg/g的总透明质酸浓度。12.在权利要求1-11中的任一项中要求保护的水性凝胶，特征在于，对所述凝胶进行热灭菌步骤，例如在高压釜中。13.一种用于制备水性凝胶的方法，所述水性凝胶包含至少一种交联的透明质酸和至少一种非交联的透明质酸，所述方法至少包含以下步骤：a)获得水性溶液，该溶液包含至少一种交联的透明质酸，其被称作“交联的ha hmw”，其从具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的非交联的透明质酸以及交联剂形成；b)获得水性溶液，该溶液包含至少一种非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha lmw”，其具有在0.04mda至0.30mda、优选0.08mda至0.20mda、更优选0.08mda至0.15mda范围内的质量平均摩尔质量；和，c)形成步骤a)和b)的所述溶液的全部或部分的均质混合物，特征在于，它包含以1:3至2:1的“非交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用透明质酸。14.在权利要求13中要求保护的方法，特征在于，以按质量计小于或等于8％、优选地小于或等于5％和更优选地小于2％的交联率制备所述“交联的ha hmw”。15.在权利要求13或14中要求保护的方法，特征在于，用于形成“交联的ha hmw”的所述交联剂是双官能或多官能环氧交联剂，优选1,4-丁二醇二缩水甘油醚。16.在权利要求13-15中的任一项中要求保护的方法，所述方法进一步包含使用至少一种具有大于或等于0.50mda、优选地大于1.00mda、更优选地在1.00mda至4.00mda范围内的质量平均摩尔质量的非交联的透明质酸，其被称作“非交联的ha hmw”。17.在权利要求16中要求保护的方法，特征在于，在步骤b)的水性溶液中使用所述“未交联的ha hmw”的全部或部分。18.在权利要求17中要求保护的方法，特征在于，在步骤c)中，将所述“未交联的ha hmw”的水性溶液和步骤b)的水性溶液同时与步骤a)的水性溶液混合。19.在权利要求13-18中的任一项中要求保护的方法，特征在于，步骤c)包含至少一个通过至少一个网格挤出所形成的混合物的步骤。20.在权利要求13-19中的任一项中要求保护的方法，特征在于，它包含使用相对于所述水性凝胶的总质量为至少5mg/g的“交联的ha hmw”。21.在权利要求13-20中的任一项中要求保护的方法，特征在于，它包含使用相对于所述水性凝胶的总质量为至少3mg/g、优选10mg/g的所述“未交联的ha lmw”。22.在权利要求13-21中的任一项中要求保护的方法，特征在于，所述水性凝胶具有相对于所述水性凝胶的总质量在10-40mg/g、优选15-35mg/g、更优选20-30mg/g范围内的总透明质酸浓度。23.在权利要求13-22中的任一项中要求保护的方法，特征在于，它包含以1:3至5:3、优
选1:2至5:3的“未交联的ha lmw”:“ha hmw”的质量比使用透明质酸。24.在权利要求13-23中的任一项中要求保护的方法，特征在于，所述水性凝胶具有小于或等于5％、优选地小于或等于3％、更优选地小于或等于1％的所述透明质酸的改性程度。25.在权利要求13-24中的任一项中要求保护的方法，特征在于，它使用：-在步骤a)中，包含5-15mg/g的“交联的ha hmw”的水性溶液；-在步骤b)中，包含50-60mg/g的“未交联的ha lmw”和5-20mg/g的“未交联的ha hmw”的水性溶液，且特征在于，形成的所述凝胶具有相对于其总质量为20-30mg/g的总透明质酸浓度。26.在权利要求13-25中的任一项中要求保护的方法，所述方法用于制备无菌的和可注射的凝胶，特征在于，它包含至少一个使用根据权利要求13-25中的任一项得到的或根据权利要求1-12中的任一项定义的水性凝胶的步骤，和热灭菌步骤，例如在高压釜中。27.在权利要求26中要求保护的方法，特征在于，所述凝胶在其灭菌之前包装在注射器中。28.可通过在权利要求13-27中的任一项中要求保护的方法得到的透明质酸的水性凝胶。29.根据前述权利要求的水性凝胶，所述凝胶是软凝胶，就是说具有以下特征：在15
°
至50
°
之间的相角(δ)以及小于或等于150pa、优选地在20至150pa之间的弹性模量g
′
，这使用具有锥/板几何形状的流变仪在室温在5pa的应力下应用1hz频率的振动应力摆动测量；以及小于或等于18n、优选地小于15n的挤出力，这在具有大于或等于6.3mm的内径的注射器中，用具有小于或等于0.3mm(30g)的外径和1/2
″
针头长度的针头，在室温以约12.5mm/min的固定速度测量。30.美容和/或皮肤病学组合物，其包含在权利要求1-12中的任一项中要求保护的水性凝胶或在权利要求28或权利要求29中要求保护的水性凝胶。31.用于预防和/或皮肤表面外观的改变的在权利要求1-12中的任一项中要求保护的水性凝胶或在权利要求28或权利要求29中要求保护的水性凝胶或在权利要求30中要求保护的皮肤病学组合物。32.用于软组织增大和/或填充的在权利要求1-12中的任一项中要求保护的水性凝胶或在权利要求28或权利要求29中要求保护的水性凝胶或在权利要求30中要求保护的皮肤病学组合物。33.在权利要求1-12中的任一项中要求保护的水性凝胶或在权利要求28或权利要求29中要求保护的水性凝胶或在权利要求30中要求保护的美容组合物用于预防和/或皮肤的表面外观的改变的非性美容用途。34.在权利要求1-12中的任一项中要求保护的水性凝胶或在权利要求28或权利要求29中要求保护的水性凝胶或在权利要求30中要求保护的美容组合物用于增大和/或填充软组织、特别是填充皱纹的非性美容用途。35.一种试剂盒，其包含预装注射器和使用说明书，所述预装注射器包含在权利要求1-12中的任一项中要求保护的水性凝胶或在权利要求28或权利要求29中要求保护的水性凝胶或在权利要求30中要求保护的美容和/或皮肤病学组合物。

技术总结

本发明涉及一种基于透明质酸的水性凝胶，其包含交联的透明质酸和相对于透明质酸的总质量按质量计为30-70％的水溶性透明质酸。本发明涉及一种用于制备水性凝胶的方法，所述水性凝胶包含至少一种交联的透明质酸和至少一种未交联的透明质酸。本发明还涉及可通过所述方法组合物得到的水性凝胶，包含所述水性凝胶的美容和/或皮肤病学组合物，和包含预装注射器的试剂盒，所述预装注射器包含所述水性凝胶或所述组合物。这些凝胶和组合物对于皮肤的表面外观的改变和/或对于增大和/或填充软组织是特别有用的。组织是特别有用的。