多花黄精致病真菌筛选方法与流程

1.本发明涉及黄精致病真菌技术领域，具体为多花黄精致病真菌筛选方法。

背景技术：

2.黄精是百合科黄精属多年生的草本植物，其中多花黄精、黄精、滇黄精列入《中国药典》，为我国重要的药食同源植物，随着其经济价值的开发利用，黄精种植面积不断增加，但根/茎腐病、病、叶斑病、黑斑病等诸多病害也随之发生，给药农造成严重损失，目前针对黄精病害及其致病菌已有较多研究，研究方向主要为两种，其一针对病害部位进行组织分离筛选病原菌，其二以黄精根际土壤或药用部位为对象研究其寄生的真菌落，前者详细阐述了黄精各病害的发病症状及其致病真菌，后者全面描述了黄精体内外的微生物落环境，我们对比了多项研究结果，发现多种致病菌在黄精根际土壤及内生真菌都有分布，且并不是优势菌属，但最终有可能导致黄精病害发生，为此，我们提出多花黄精致病真菌筛选方法。

技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供多花黄精致病真菌筛选方法，能够以多花黄精为材料主动筛选其根际及内生真菌，研究其致病性，可在病害发生与扩大前研究黄精病害原因和机理，以便于为进一步开展病害防控研究提供参考，可以有效解决背景技术中的问题。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种多花黄精致病真菌筛选方法，包括如下步骤：
5.s1选择试验材料：选择供试植株1、供试植株2、供试植株3、供试植株4和培养基；
6.s2菌株分离纯化：根际真菌分离采集新鲜黄精植株，抖落根部松散土壤后附着于根上的为根际土，按照土水比1:10(g/ml)添加无菌水于根际土，室温160rpm振荡2h，静置10min后将土壤上清液用无菌水按照10
2-104稀释，分别取20μl稀释液涂布于pda平板；另用无菌剪刀将黄精根系沿块茎处剪掉，伤口处在酒精灯下灼烧2s，于无菌操作台用无菌水冲洗3次，晾干后平铺于pda培养基表面，块茎内生真菌分离取多花黄精新鲜块茎在自来水下冲洗10min，之后在无菌操作台内进行表面消毒，块茎切取3段，每段厚2cm，依次用 75％乙醇浸泡5min，无菌水漂洗3次，5％(v/v)次氯酸钠浸泡5min，无菌水漂洗5次，置于灭菌滤纸片晾干，用刀片将块茎削去表皮，剩余块茎切成薄片置于pda培养基表面；削去的表皮将切面在酒精灯下灼烧2s，同最后一次的洗涤水一起作为对照，分别平铺或涂布于pda 培养基，以验证消毒是否彻底，菌株纯化培养3-5d后，待平板上长出较多真菌菌落，挑选形态不同的菌丝或菌落转移至新鲜pda培养基，反复纯化至菌落单一，观察并记录各菌株菌落形态，并将其保存于试管斜面备用；
7.s3致病真菌筛选：纯化后的真菌根据其形态特征挑选差异较大的菌株转接到新鲜pda培养基培养3d，在菌落边缘切取新生菌丝小块，分别接种于无菌组培苗茎基部，置于25
℃光下继续培养，观察真菌及黄精生长情况，30d后统计黄精发病情况，记录可导致黄精发病的真菌及发病症状，筛选致病菌。
8.进一步的，选材料时供试植株1选择多花黄精多年龄苗，采自贵州省植物园黄精苗圃，圃内黄精引自贵州省内外多地，包括湖北(e)、贵州毕节(qb)、贵州水城(qs)、贵州铜仁(qt)、贵州遵义(qz)，取黄精块茎及根进行真菌筛选，供试植株2选用多花黄精组培苗，由团队研究人员扩繁，组培苗未生根，用于快速鉴定致病真菌，供试植株3选用2年龄多花黄精块茎繁殖植株，植株高大，茎叶繁盛，长势健康，用于对所筛致病真菌进行叶片致病力测定，供试植株4选用2 年龄多花黄精种子繁殖植株，植株健康，长势整齐，用于对所筛致病真菌进行块茎致病力测定，培养基选用pda培养基用于真菌培养；ms 培养基含蔗糖25g，琼脂粉6g，不添加激素，用于黄精无根组培苗培养。
9.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本多花黄精致病真菌筛选方法，具有以下好处：
10.本发明通过对黄精种质资源圃内不同引种地的多花黄精根际及内生真菌进行筛选和纯化，利用无菌组培苗、温室盆栽苗分别进行致病性鉴定和致病力检测，最终确定了7株对多花黄精有害的真菌，其中芬芳镰刀菌为镰刀菌在黄精病害中首次发现，而卵形孢球托霉、裂褶菌为首次发现对作物致病，镰刀菌属的真菌作为致病菌导致作物病害发生多有报道，而卵形孢球托霉和裂褶菌为首次发现其对黄精有致病危害，通过试验结果和文献对比，发现土壤和植物体内长期大量存在多种微生物，推测环境条件的改变可能引发微生物丰度和活性变化进而导致作物病害发生，而目前报道的黄精病害中较多由镰刀菌属引起，推测其较强的环境适应性促进了其致病能力，那么，根际土壤作为黄精伴生或寄生菌的微生物种子库，包含了众多功能丰富的微生物，通过人为调控土壤微生物落进而影响根际和内生真菌来防控作物病害、促进作物生长是可行的，本研究为致病菌提供单纯的营养和竞争环境，能够明显观察到其致病能力，如果同时添加其拮抗菌或增加更多有竞争性的微生物，很有可能抑制致病菌的生长从而控制病害发生。
具体实施方式
11.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
12.本实施例提供一种技术方案：一种多花黄精致病真菌筛选方法，包括如下步骤：
13.s1选择试验材料：选择供试植株1、供试植株2、供试植株3、供试植株4和培养基，选材料时供试植株1选择多花黄精多年龄苗，采自贵州省植物园黄精苗圃，圃内黄精引自贵州省内外多地，包括湖北(e)、贵州毕节(qb)、贵州水城(qs)、贵州铜仁(qt)、贵州遵义(qz)，取黄精块茎及根进行真菌筛选，供试植株2选用多花黄精组培苗，由团队研究人员扩繁，组培苗未生根，用于快速鉴定致病真菌，供试植株3选用2年龄多花黄精块茎繁殖植株，植株高大，茎叶繁盛，长势健康，用于对所筛致病真菌进行叶片致病力测定，供试植株4选用2年龄多花黄精种子繁殖植株，植株健康，长势整齐，用于对所筛致病真菌进行块茎致病力测定，培养基选用pda培养基用于真菌培养；ms培养基含蔗糖25g，琼脂粉6g，不添加激素，用于黄
精无根组培苗培养；
14.s2菌株分离纯化：根际真菌分离采集新鲜黄精植株，抖落根部松散土壤后附着于根上的为根际土，按照土水比1:10(g/ml)添加无菌水于根际土，室温160rpm振荡2h，静置10min后将土壤上清液用无菌水按照10
2-104稀释，分别取20μl稀释液涂布于pda平板；另用无菌剪刀将黄精根系沿块茎处剪掉，伤口处在酒精灯下灼烧2s，于无菌操作台用无菌水冲洗3次，晾干后平铺于pda培养基表面，块茎内生真菌分离取多花黄精新鲜块茎在自来水下冲洗10min，之后在无菌操作台内进行表面消毒，块茎切取3段，每段厚2cm，依次用 75％乙醇浸泡5min，无菌水漂洗3次，5％(v/v)次氯酸钠浸泡5min，无菌水漂洗5次，置于灭菌滤纸片晾干，用刀片将块茎削去表皮，剩余块茎切成薄片置于pda培养基表面；削去的表皮将切面在酒精灯下灼烧2s，同最后一次的洗涤水一起作为对照，分别平铺或涂布于pda 培养基，以验证消毒是否彻底，菌株纯化培养3-5d后，待平板上长出较多真菌菌落，挑选形态不同的菌丝或菌落转移至新鲜pda培养基，反复纯化至菌落单一，观察并记录各菌株菌落形态，并将其保存于试管斜面备用；
15.s3致病真菌筛选：纯化后的真菌根据其形态特征挑选差异较大的菌株转接到新鲜pda培养基培养3d，在菌落边缘切取新生菌丝小块，分别接种于无菌组培苗茎基部，置于25℃光下继续培养，观察真菌及黄精生长情况，30d后统计黄精发病情况，记录可导致黄精发病的真菌及发病症状，筛选致病菌。
16.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：

1.多花黄精致病真菌筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：s1选择试验材料：选择供试植株1、供试植株2、供试植株3、供试植株4和培养基；s2菌株分离纯化：根际真菌分离采集新鲜黄精植株，抖落根部松散土壤后附着于根上的为根际土，按照土水比1:10 (g/ml)添加无菌水于根际土，室温160 rpm振荡2h，静置10 min后将土壤上清液用无菌水按照10
2-104稀释，分别取20μl稀释液涂布于pda平板；另用无菌剪刀将黄精根系沿块茎处剪掉，伤口处在酒精灯下灼烧2s，于无菌操作台用无菌水冲洗3次，晾干后平铺于pda培养基表面，块茎内生真菌分离取多花黄精新鲜块茎在自来水下冲洗10 min，之后在无菌操作台内进行表面消毒，块茎切取3段，每段厚2cm，依次用75%乙醇浸泡5 min，无菌水漂洗3次，5% (v/v) 次氯酸钠浸泡5 min，无菌水漂洗5次，置于灭菌滤纸片晾干，用刀片将块茎削去表皮，剩余块茎切成薄片置于pda培养基表面；削去的表皮将切面在酒精灯下灼烧2s，同最后一次的洗涤水一起作为对照，分别平铺或涂布于pda培养基，以验证消毒是否彻底，菌株纯化培养3-5d后，待平板上长出较多真菌菌落，挑选形态不同的菌丝或菌落转移至新鲜pda培养基，反复纯化至菌落单一，观察并记录各菌株菌落形态，并将其保存于试管斜面备用；s3致病真菌筛选：纯化后的真菌根据其形态特征挑选差异较大的菌株转接到新鲜pda培养基培养3d，在菌落边缘切取新生菌丝小块，分别接种于无菌组培苗茎基部，置于25℃光下继续培养，观察真菌及黄精生长情况，30d后统计黄精发病情况，记录可导致黄精发病的真菌及发病症状，筛选致病菌。2.根据权利要求1所述的多花黄精致病真菌筛选方法，其特征在于：选材料时供试植株1选择多花黄精多年龄苗，取黄精块茎及根进行真菌筛选，供试植株2选用多花黄精组培苗，供试植株3选用2年龄多花黄精块茎繁殖植株，供试植株4选用2年龄多花黄精种子繁殖植株，培养基选用pda培养基用于真菌培养，pda培养基含蔗糖25g，琼脂粉6g，不添加激素。

技术总结

本发明公开了多花黄精致病真菌筛选方法，涉及黄精致病真菌技术领域，包括如下步骤：S1选择试验材料：选择供试植株1、供试植株2、供试植株3、供试植株4和培养基；S2菌株分离纯化：根际真菌分离采集新鲜黄精植株，抖落根部松散土壤后附着于根上的为根际土，按照土水比1:10(g/mL)添加无菌水于根际土，室温160 rpm振荡2h，静置10 min后将土壤上清液用无菌水按照10