夏佛塔苷对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制及其药物用途

1.本发明涉及夏佛塔苷的药物新用途，具体涉及夏佛塔苷在抗新型冠状病毒主蛋白酶 (3cl
pro
)中的应用。

背景技术：

2.2020年1月12日，2019年新型冠状病毒被世界卫生组织(who)命名为sars-cov-2，随后，于2020年2月11日新型冠状病毒肺炎被命名为covid-19。截止到2021年8日，全球已有400多万例死亡病例。然而，目前仍没有针对covid-19的特效药物。
3.新型冠状病毒sars-cov-2是sarbecovirus亚种(beta-cov谱系b)的成员，基因组与普通冠状病毒一样可编码四种结构蛋白：刺突蛋白(s蛋白)，包膜蛋白(e蛋白)，膜蛋白(m蛋白)和核衣壳蛋白(n蛋白)。这四个主要结构蛋白的生成依靠由主蛋白酶(3cl
pro
) 剪切的非结构蛋白nsp1。此外，3cl
pro
具有清晰的生物学功能和重要的酶活性位点，可作为开发小分子抑制剂的最重要标靶。
4.甘草(glycyrrhizae radix et rhizoma)是常用中药，具有保肝、抗溃疡、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗菌、抗疟等药理活性，含有黄酮、黄酮苷、三萜皂苷等化学成分。其中，甘草中存在的黄酮碳苷类成分广泛分布在植物中，这类特殊结构类型的天然产物具有良好的生物活性。如黄芩中的牡荆素(芹菜素6-c-葡萄糖苷)和异牡荆素(芹菜素8-c-葡萄糖苷)均具有较好的抗病毒功效；印度民族药鸭嘴花中的荭草素(luteolin 8-c-glucoside)和异荭草素 (luteolin 8-c-glucoside)同样具有较好的药理作用；葛根中的指标性成分葛根素(大豆素8-c
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葡萄糖苷)具有良好的心血管疾病的功效，目前已经应用于临床。有报道指出，大豆黄酮、芦荟大黄素等黄酮蒽醌化合物对sars主蛋白酶有抑制作用(chao pdl等，antiviralresearch 2005，68，36
–
42)。此外，牡荆素和荭草素等成分具有抗新型冠状病毒主蛋白酶的活性(shunmugiah kp等，journal of biomolecular structure&dynamics 2020)。因此，从传统天然药物中发现有效的新型抗病毒药物具有重要的现实意义和良好的应用前景。
5.夏佛塔苷是甘草中的黄酮碳苷类成分，黄酮碳苷成分的糖基多取代于黄酮母核的碳c(6) 或碳c(8)位，这类成分多具有抗炎、抗氧化等药理活性，但其抗新冠病毒活性未见报道。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于为预防和/或新型冠状病毒和其他冠状病毒感染提供药物。本发明研究发现，夏佛塔苷对冠状病毒的主蛋白酶(3cl
pro
)有抑制作用，从而起到抗冠状病毒活性。由此，本发明提供了甘草提取物夏佛塔苷的抑制冠状病毒主蛋白酶的新用途。
7.此化合物的结构式如下：
[0008][0009]
本发明所述夏佛塔苷是一种黄酮双碳苷化合物，该化合物本身或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、前药中的至少一种，以及其混合物，能够抑制冠状病毒的主蛋白酶(3cl
pro
)，可用于预防和/或新型冠状病毒或其它冠状病毒的感染。
[0010]
以上述活性化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、前药以及它们的混合物为有效成分制备的用于预防和/或冠状病毒感染的药物也属于本发明的保护范围。
[0011]
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体或辅料。所述载体或辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
[0012]
利用上述活性化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、立体异构体、互变异构体以及前药作为活性成分，单独或组合使用，或与其它药物、辅料等配合制备成各种剂型，包括但不限于片剂、散剂、丸剂、注射剂、胶囊剂、膜剂、栓剂、膏剂、冲剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
[0013]
本发明提供的夏佛塔苷是甘草中的黄酮化合物，这类成分多具有抗炎、抗免疫、抗肿瘤、抗氧化等药理活性，但其抗新冠病毒活性未见报道。本发明首次发现夏佛塔苷对冠状病毒的主蛋白酶有抑制作用，从而起到抗冠状病毒活性，可用于制备和/或预防冠状病毒感染的药物或保健品。
附图说明
[0014]
图1为实施例1检测夏佛塔苷对新冠病毒主蛋白酶(3cl
pro
)抑制率的实验结果。
[0015]
图2为实施例2检测夏佛塔苷对新型冠状病毒的抑制率与细胞毒性的实验结果。
[0016]
图3为实施例3的夏佛塔苷(10μm和30μm)对新型冠状病毒的免疫荧光检测图。
[0017]
图4为实施例4夏佛塔苷对新型冠状病毒主蛋白酶(3cl
pro
)的亲和力检测结果。
具体实施方式
[0018]
下面结合实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
[0019]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0020]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0021]
实施例1、夏佛塔苷与新冠病毒主蛋白酶(3cl
pro
)的抑制率检测
[0022]
一、实验材料和方法
[0023]
通过荧光底物dabcyl-ktsavlqsgfrkme-edans测量sars-cov-2 3cl
pro
的蛋白水解活性。通过监测535nm波长340nm发射荧光来检测活性。蛋白终浓度为12.5μg/ml，化合物样品夏佛塔苷浓度为1、2、4、8、16μm，缓冲液为20mm的tris-hcl(ph 7.0)，底物浓度为3mm。反应条件为25℃，10分钟。根据以下方程计算酶活：
[0024][0025]
a＝enzyme activity,df＝difution factor,δod＝absorptionchange/min,
[0026]vs
＝sample volume,c＝concentration.
[0027]
式中，a表示酶活，df表示稀释因子，δod表示吸光度变化，vs表示样品体积，c表示蛋白浓度。
[0028]
二、实验结果
[0029]
夏佛塔苷对新型冠状病毒主蛋白酶(3cl
pro
)有较好的抑制活性。ic
50
值为1.57
±
0.22μm，如图1所示。
[0030]
实施例2、夏佛塔苷对新型冠状病毒的抑制率与细胞毒性
[0031]
一、实验材料和方法
[0032]
活病毒模型活性筛选中，sars-cov-2以moi＝0.1的比例感染vero e6细胞(moi为每个细胞对应的病毒数)，同时给药。孵育2小时后，采用cck-8试剂盒测试化合物细胞毒性；通过qpcr测试病毒拷贝数，评价化合物抗病毒活性。
[0033]
二、实验结果
[0034]
在新冠病毒活毒体系中，夏佛塔苷可抑制病毒感染，ic
50
为11.83μm，如图2所示。
[0035]
实施例4、夏佛塔苷对新型冠状病毒的免疫荧光测试
[0036]
一、实验材料和方法
[0037]
将vero e6细胞孵育在载玻片上24小时。化合物夏佛塔苷以10μm和30μm的浓度与病毒液加入到细胞中。感染后24小时后，室温下将细胞用4％多聚甲醛处理15分钟。将细胞与1:1000稀释的荧光标记的新冠抗体溶液室温下孵育1小时。彻底清洗15分钟后，除去未结合的抗体。然后将细胞与1:500稀释的alexa fluor 594偶联山羊抗人igg抗体(invitrogen， thermo fisher scientific)一起孵育1小时。将载玻片洗涤，15分钟后用dapi(sigma)进行核染，后用共聚焦荧光显微镜(ultraview vox；perkinelmer，美国)成像。
[0038]
二、实验结果
[0039]
夏佛塔苷能够抑制新型冠状病毒感染，如图3所示。
[0040]
实施例4、夏佛塔苷与新冠病毒主蛋白酶(3cl
pro
)的亲和力检测
[0041]
一、实验材料和方法
[0042]
用表面等离子体共振(spr)体系检测候选药物与新冠病毒主蛋白酶(3cl
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)的亲和力。通过标准的伯胺偶联反应将蛋白质3cl
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固定在传感器芯片cm5上，仪器使用biacore 8k。将sars-cov 3cl
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稀释在10mm醋酸铵(ph 4.5)中，使其最终浓度为25μg/ml。5％dmso 和0.05％p20的pbs作为缓冲液。最终sars-cov 3cl
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的固定水平通常约为12000ru。为了研究不同浓度的夏佛塔苷的结合，缓冲液取30μl/min的流速60s结合和60s
解离运行。通过对biacore数据进行的稳态亲和力方法拟合分析，确定了评估蛋白质-配体结合亲和力的平衡解离常数(kd)。
[0043]
二、实验结果
[0044]
运用表面等离子共振检测，结果显示夏佛塔苷对新冠主蛋白酶(3cl
pro
)的亲和力较好， kd值为1.24
×
10-5
，如图4所示。

技术特征：

1.夏佛塔苷及其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、前药中的至少一种在制备预防和/或冠状病毒感染的药物或保健品中的应用，其中，所述夏佛塔苷的结构式如下所示：2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒是新型冠状病毒sars-cov-2。3.一种预防和/或冠状病毒感染的药物或保健品，含有夏佛塔苷及其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、前药中的至少一种作为有效成分，所述夏佛塔苷的结构式如下所示：4.如权利要求3所述的药物或保健品，其特征在于，所述冠状病毒是新型冠状病毒sars-cov-2。5.如权利要求3所述的药物或保健品，其特征在于，所述药物或保健品还含有一种或多种药学上可接受的载体或辅料。6.夏佛塔苷及其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、前药中的至少一种作为冠状病毒主蛋白酶3cl
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的抑制剂的用途，其中，所述夏佛塔苷的结构式如下所示：7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述冠状病毒的主蛋白酶3cl
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是新型冠状病毒的主蛋白酶3cl
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。