一种果形相关蛋白及其编码基因与应用

1.本发明涉及生物技术领域中一种果形相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术：

2.番茄是全球最重要的蔬菜水果之一。番茄果实形状最常见的有圆形和长形，圆形符合大多数消费者的审美，但是圆形果实相对长形更容易被压破，长形果实给消费者提供了新的形状选择，且长形果实更耐压。圆形是最主流的形状，因此同时培育这两种形状的果实就非常有必要。

技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何简单、高效地调控植物的果实形状。
4.本发明提供了一种蛋白质，名称为slkrp7，是如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：
5.a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
6.a2)将a1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有调控植物果形活性的蛋白质；
7.a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
8.其中，序列表序列3由212个氨基酸残基组成。
9.上述蛋白质可来源于番茄(solanum lycopersicum)。
10.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
11.上述蛋白质中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
12.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，perresidue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
13.上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
14.与蛋白质slkrp7相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
15.本发明所提供的与蛋白质slkrp7相关的生物材料，为下述b1)至b5)中的任一种：
16.b1)编码所述蛋白质的核酸分子；
17.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
18.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；
19.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
20.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
21.其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
22.上述生物材料中，b1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：
23.b1)编码链的编码序列是序列表中序列3的cdna分子或dna分子；
24.b2)编码链的核苷酸是序列表中序列3的cdna分子或dna分子。
25.其中，序列表中的序列3由639个核苷酸组成，编码序列表中的序列1所示的蛋白质。
26.上述生物材料中，b2)所述的含有所述核酸分子的表达盒(slkrp7基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达slkrp7的核酸分子，该核酸分子不但可包括启动slkrp7基因转录的启动子，还可包括终止slkrp7转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plant physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白质酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白质、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)embo j.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i
985
)nature 313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genes dev.,5:141；mogen等人(1990)plant cell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17:7891；joshi等人(1987)nucleic acid res.,15:9627)。
27.可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白质slkrp7编码基因或所述蛋白质slkrp7编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pgwb411、pgwb412、pgwb405、pbin438、pcambia1302、pcambia2300、pcambia2301、pcambia1301、pgwb18、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb。使用slkrp7构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛生素基因ubiqutin启动子(pubi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是
atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
28.为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
29.上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌；如所述细菌可以为农杆菌lba4404菌株。
30.上述的蛋白质、或上述生物材料的下述任一种中的应用：
31.c1)调控植物果形；
32.c2)制备调控植物果形的产品；
33.c3)使植物果形由长形果转变成圆形果；
34.c4)制备使植物果形由长形果转变成圆形果的产品。
35.为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物试剂，其作用为调控植物果形。
36.本发明所提供的植物试剂含有所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料。
37.上述植物试剂的活性成分可为所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料，上述植物试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述植物试剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物的氮吸收效果确定。
38.为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育圆形果植物的方法。
39.本发明所提供的培育圆形果植物的方法，包括将编码所述蛋白质的核酸分子导入目的植物中，得到圆形果植物。
40.所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为f1)-f4)中的任一种：
41.f1)管状花目植物；
42.f2)茄科植物；
43.f3)番茄属植物；
44.f4)番茄。
45.上述方法中，其中所述的核酸分子可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：
46.1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
47.2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
48.3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于camv的tml，来源于rbcs的e9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
49.4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于tmv,mcmv和amv)。
50.所述的核酸分子可通过使用ti质粒，植物病毒栽体，直接dna转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(weissbach,1998，method for plant molecular biology viii,academy press,new york,pp.411-463；geiserson and corey,1998,plantmolecularbiology(2nd edition)。
51.上述方法中，所述圆形果植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。
52.上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
53.将slkrp7编码序列导入长形果番茄品种的转基因实验证明，表达slkrp7蛋白的转基因番茄与受体番茄相比，果形由长形果转变成圆形果，说明slkrp7蛋白是与果实形状相关的基因，slkrp7蛋白可用于将长形果转变成圆形果。本发明的方法操作简单，成本低，大大加快了育种进程，具有广泛的应用前景。
附图说明
54.图1为长形果的野生型m82番茄与圆形果的转基因纯合番茄的果实表型照片。
具体实施方式
55.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
56.下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
57.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
58.下述实施例中的长果番茄品种m82为美国番茄遗传资源中心产品(tgrc，http://tgrc.ucdavis.edu/)，编号为la3475。
59.下述实施例中所用到的载体pgwb18、载体pqb均为addgene载体库产品
60.(http://www.addgene.org/)。
61.下述实施例中所用到的大肠杆菌top10菌株、农杆菌lba4404菌株均为北京华越洋生物有限公司产品。
62.下述实施例中所用到的含1.0mg/l吲哚乙酸、1.75mg/l玉米素、ph为5.9的ms固体培养基，为以ms基本培养基(北京华越洋生物产品)为基础培养基，向该基础培养基中添加吲哚乙酸和玉米素核苷得到的吲哚乙酸的浓度为1.0mg/l、玉米素核苷的浓度为1.75mg/l，
ph值为5.9的培养基。
63.下述实施例中所用到的含有1.0mg/l吲哚乙酸、1.75mg/l玉米素、200mg/l特美汀和75mg/l卡那霉素、ph为5.9的ms固体培养基为以ms基本培养基(北京华越洋生物产品)为基础培养基，向该基础培养基中添加吲哚乙酸、玉米素、特美汀和卡那霉素得到的吲哚乙酸的浓度为1.0mg/l、玉米素的浓度为1.75mg/l、特美汀的浓度为200mg/l、卡那霉素的浓度为75mg/l，ph值为5.9的培养基。
64.下述实施例中所用到的含有200mg/l特美汀和50mg/l卡那霉素、ph为5.9的ms固体培养基为以ms基本培养基(北京华越洋生物产品)为基础培养基，向该基础培养基中添加特美汀和卡那霉素得到的特美汀的浓度为200mg/l、卡那霉素的浓度为50mg/l，ph值为5.9的培养基。
65.下述实施例中所用到的含150mg/l潮霉素的ms培养基为以ms基本培养基(北京华越洋生物产品)为基础培养基，向该基础培养基中添加潮霉素得到的潮霉素的浓度150mg/l，ph值为5.9的培养基。
66.下述实施例中所用到的含有800mg/l潮霉素的1/2ms培养基为以1/2ms基本培养基为基础培养基，向该基础培养基中添加潮霉素得到的潮霉素的浓度800mg/l，ph值为5.9的培养基。
67.实施例1、利用转基因方法将长形果转变成圆形果
68.本发明发明人发现了与番茄的果形相关的基因slkrp7，该基因的序列如序列2所示，由990个核苷酸组成；slkrp7编码序列为序列表序列3，由639个核苷酸组成，编码序列1所示的蛋白，将所述蛋白命名为蛋白质slkrp7。
69.一、重组载体的构建
70.对野生型番茄m82植株的基因组dna进行pcr扩增，所用引物序列如下：
71.正向引物：5
′‑
atgagaagaaagtataagtgc-3
′
；
72.反向引物：5
′‑
tcattgtcgaacccattcgtagcg-3
′
。
73.扩增得到slkrp7编码序列(核苷酸序列是序列表中序列3所示，编码序列1所示的蛋白质)，回收，备用。
74.利用ecorv酶切入门载体pqb，得到线性化的pqb，然后用t4连接酶将上述slkrp7编码序列与线性化的pqb连接，得到了连接产物。
75.将上述连接产物转化大肠杆菌top10菌株感受态，提取质粒，测序，鉴定出序列正确的克隆，得到中间质粒pqb-slkrp7。
76.通过lr反应将中间质粒pqb-slkrp7中的slkrp7编码序列重组入终载体pgwb18中，得到重组载体pgwb18-slkrp7。该重组载体pgwb18-slkrp7含有序列表中序列3所示的slkrp7编码序列，可转录序列表中序列4所示的mrna，进一步表达序列表中序列1所示的蛋白质。
77.二、转基因番茄的获得与鉴定
78.一)、转基因番茄的获得：
79.将步骤一得到的重组质粒pgwb18-slkrp7导入农杆菌lba4404菌株中，获得重组菌pgwb18-slkrp7/lba4404。
80.将重组菌pgwb18-slkrp7/lba4404的菌液侵染长形少汁品种番茄m82外植体(剪下
来的子叶作为外植体)，然后在含1.0mg/l吲哚乙酸、1.75mg/l玉米素核苷、ph为5.9的ms固体培养基中，于25
±
1.5℃、光照强度100-200lx下共培养48小时；再转入含有1.0mg/l吲哚乙酸、1.75mg/l玉米素、200mg/l特美汀和75mg/l卡那霉素、ph为5.9的ms固体培养基中，于25
±
1.5℃、光照16h/d、黑暗8h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至长出再生芽；待再生芽长至2-3cm时切下再生芽，转入含有200mg/l特美汀和50mg/l卡那霉素、ph为5.9的ms固体培养基中，在25
±
1.5℃、光照16h/d、黑暗8h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至生根，即得到t0代番茄植株。
81.二)转基因番茄的鉴定：
82.在含150mg/l潮霉素的ms培养基上，能够生长出根的幼苗为转基因阳性苗。将t0代阳性番茄和野生型m82番茄扦插在含150mg/l潮霉素的ms培养基，与野生型m82番茄相比，t0代番茄生长出了根而野生型m82番茄未生根，t0代阳性番茄即为转入了slkrp7基因的t0代转基因番茄。
83.将t0代转基因番茄种植于温室中，通过自交获得t1代转基因番茄种子。将t1代转基因番茄种子播种在含有800mg/l潮霉素的1/2ms培养基上，选择10棵生长正常的幼苗移栽到土里，单株收t2代转基因番茄种子。各播30粒t2代转基因番茄种子在800mg/l潮霉素的1/2ms培养基上，全部种子都具有抗性的单株为转基因纯合番茄。
84.基因表达检测显示转基因番茄中slkrp7过表达了约20倍。
85.三)、果实观察
86.待测植株为步骤二)得到的转基因纯合番茄及野生型m82番茄(作为对照植株)。
87.将待测植株在温室中育苗，25℃、16h光照/8h黑暗条件下光照培养20d。转基因纯合番茄以及野生型m82番茄各挑选10棵长势一致的幼苗移栽到温室大棚中，株距、行距在60cm以上，两种材料随机分布。正常的水肥管理，保证所有植株水肥条件基本一致。果实完全变红以后观察比较转基因纯合番茄与对照植株野生型m82番茄的果实，并拍照记录。每个株系随机摘取15个番茄果实，测量果实的长度和宽度。
88.关于番茄形状的定义及公式如下：
89.将长宽比大于1的果实定义为长果。
90.将长宽比约等于1的果实定义为圆果。
91.长宽比指的是长度与宽度的比值。
92.长度指的是与果蒂部分垂直的果实最长直径。
93.宽度指的是与果蒂部分平行的果实的最长直径。
94.结果如图1所示，与对照植株野生型m82番茄相比，转基因纯合番茄的果实由长形转变为圆形m82番茄果实的长宽比约为1.2；转基因纯合番茄果实的长宽比约为1.0。
95.以上表明slkrp7基因及其编码的蛋白质可以调控番茄的果形，可以使长形果的番茄材料转变成圆形果的番茄材料。
96.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，
可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：

1.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质是如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；a2)将a1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有调控植物果形活性的蛋白质；a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质来源于番茄。3.与权利要求1或2所述的蛋白质相关的生物材料，其特征在于，为下述b1)至b5)中的任一种：b1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系。4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，b1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：b1)编码链的编码序列是序列表中序列3的cdna分子或dna分子；b2)编码链的核苷酸是序列表中序列3的cdna分子或dna分子。5.权利要求1或2所述的蛋白质、或权利要求3或4所述生物材料的下述任一种中的应用：c1)调控植物果形；c2)制备调控植物果形的产品；c3)使植物果形由长形果转变成圆形果；c4)制备使植物果形由长形果转变成圆形果的产品。6.植物试剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的蛋白质、或权利要求3或4所述生物材料，所述植物试剂是调控植物果形的植物试剂。7.一种培育圆形果植物的方法，其特征在于，包括将编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子导入目的植物中，得到圆形果植物。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述双子叶植物为f1)-f4)中的任一种：f1)管状花目植物；f2)茄科植物；f3)番茄属植物；f4)番茄。

技术总结

本发明公开了一种与植物果形调控相关的SlKRP7蛋白质及其相关生物材料与应用。所述SlKRP7蛋白质具体可为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有调控植物果形活性的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。SlKRP7蛋白质及其相关生物材料可用于将长果形变成圆形果。形变成圆形果。形变成圆形果。