一种纳米复合体及其应用

1.本技术涉及抗菌剂的制备及应用领域，特别地涉及一种纳米复合体及其应用。

背景技术：

2.细菌感染严重威胁着人类的健康，临床及实际生产应用常使用抗生素进行。然而，由于机体代谢及生物膜屏障等作用使得抗生素难以在感染部位富集和杀伤胞内存活的细菌。以往人们常通过提高抗生素用量达到效果，但抗生素的滥用会产生严重的细菌耐药现象，甚至造成超级细菌肆虐，造成恶性循环(r.a.fisher,b.gollan,s.helaine,persistent bacterial infections and persister cells,nat rev microbiol 15(8)(2017)453-464.；e.christaki,m.marcou,a.tofarides,antimicrobial resistance in bacteria:mechanisms,evolution,and persistence,j mol evol 88(1)(2020)26-40.)。
3.同时，腹部感染是现代手术中最常见的由耐药细菌引起的并发症(nicoletti et al.，2009)，可导致急性感染、炎症，甚至死亡。预防感染使用最多的药物是抗生素，但抗生素会引起耐药性(sartelli et al.，2017)。寻求腹部感染的新方法迫在眉睫。
4.申请内容
5.针对现有技术中存在的技术问题，本技术提出了一种纳米分子复合体，包括：沸石咪唑酯骨架zif-8；以及吡啶硫酮(pt)；其中，所述吡啶硫酮(pt)负载于沸石咪唑酯骨架zif-8。
6.如上所述的纳米分子复合体，其中，zif-8与pt的摩尔质量比为(8-15):10。
7.如上所述的纳米分子复合体，其中，zif-8与pt的质量比为(0.5-3.5):1。
8.如上所述的纳米分子复合体，其中，所述沸石咪唑酯骨架zif-8包括硫酸锌(znso4)和2-甲基咪唑，其在水溶液中形成；其中，zn
2+
、2-甲基咪唑和水的摩尔比为1：(65-75)：(1000-1500)。
9.如上所述的纳米分子复合体，其尺寸为(180-210)nm，优选位193.80
±
2.68nm,；zeta电位为(15-40)mv，优选为-27.80
±
4.98mv。
10.一种纳米抗菌剂，包括如上任一所述的纳米分子复合体。
11.如上任一所述的纳米分子复合体在制备预防和/或由病原体引起的相关疾病的纳米抗菌剂方面的应用。
12.如上所述的应用，所述纳米抗菌剂为ph响应型抗菌剂。
13.如上所述的应用，包括对病原体施用有效剂量的纳米抗菌剂，所述有效施用计量为纳米复合体的浓度不小于3μg/ml；优选地，抑制病原菌生长的有效剂量为纳米复合体的浓度不小于3.5μg/ml，优选不小于4μg/ml；优选地，杀灭病原菌的有效剂量为纳米复合体的浓度不小于7μg/ml，优选不小于8μg/ml。
14.如上任一所述的纳米分子复合体或者如上所述的纳米抗菌剂在影响病原体生物膜的形态方面的应用。
15.如上所述的应用，所述纳米分子复合体或者纳米抗菌剂通过抑制病原体形成生物
膜或清除病原体已形成的生物膜影响病原体生物膜的形态。
16.如上所述的应用，所述纳米分子复合体或者纳米抗菌剂通过使病原体表面塌陷、收缩和/或破裂影响病原体生物膜的形态。
17.如上任一所述的应用，所述病原体为维氏气单胞菌。
18.一种在体外杀灭或抑制病原菌生长的方法，包括对病原体施用有效剂量的如上任一所述的纳米复合体或者如上所述的纳米抗菌剂。
19.如上任一所述的纳米复合体或者如上所述的纳米抗菌剂在制备预防和/或鱼类或哺乳动物病原体感染的药物方面的应用。
20.如上所述的应用，所述感染为腹部感染。
21.如上所述的应用，所述哺乳动物包括但不限于人类、灵长类动物、啮齿类动物、兔类、犬科、畜类。
22.如上7所述的应用，所述哺乳动物包括但不限于人、黑猩猩、猴、小鼠、大鼠、兔、狗、猪、牛、羊。
23.本技术的纳米抗菌剂以纳米材料为载体，结合双重抗菌机理，可靶向细菌感染等部位，具有高效抗菌效果的同时，不会使细菌产生耐药性，也可显著减少甚至杜绝超级细菌的产生。
附图说明
24.下面，将结合附图对本技术的优选实施方式进行进一步详细的说明，其中：
25.图1是根据本技术的一个实施例的zif-8和zif-8@pt表征图示，其中(a)为扫描电子显微镜下的表征图示；(b)为透射电子显微镜下的表征图示；
26.图2是根据本技术的另一个实施例的zif-8和zif-8@pt表征图示，其中a为zif-8和zif-8@pt的粒径柱状图；b为zif-8和zif-8@pt的电位柱状图；
27.图3是根据本技术的一个实施例的zif-8@pt的ph响应释放曲线；
28.图4是根据本技术的一个实施例的zif-8@pt在不同ph条件和不同处理时间下的抗维氏气单胞菌的效果；其中图4(a)为根据本技术一个实施例的以pbs处理的维氏气单胞菌在不同ph条件下的存活及生长图示；图4(b)为根据本技术一个实施例的以zif-8@pt处理的维氏气单胞菌在不同ph条件下的存活及生长图示；图4(c)为根据本技术一个实施例的以pbs处理的维氏气单胞菌在不同ph条件下的存活柱状统计图；以及图4(d)为根据本技术一个实施例的以zif-8@pt处理的维氏气单胞菌在不同ph条件下的存活柱状统计图；
29.图5是根据本技术的一个实施例的zif@pt对维氏气单胞菌生物膜、形态和细胞内结构的影响；其中，图5(a)为根据本技术一个实施例的zif-8@pt对维氏气单胞菌生物膜形成的抑制作用；图5(b)为根据本技术一个实施例的zif-8@pt对已建立的维氏气单胞菌生物膜的去除效果；图5(c)为根据本技术一个实施例的维氏气单胞菌经zif-8和pbs处理24h的扫描电子显微镜(sem)图示；图5(d)为根据本技术一个实施例的维氏气单胞菌经zif-8、pt和zif-8@pt处理24h的透射电子显微镜(tem)图示；
30.图6是根据本技术一个实施例的zif-8@pt抑制腹部感染实验设计及结果；其中，图6(a)为根据本技术一个实施例的维氏气单胞菌感染的实验设计；图6(b)是根据本技术一个实施例的pbs、pt、zif-8@pt和卡那霉素(kan)后的小鼠主要器官组织中的细菌培
8混合，室温震荡24小时，离心干燥得到zif-8@pt晶体。在一些实施例中，室温震荡24h后zif-8载pt的量最高，高达36.5％。
39.本文所说“吡啶硫酮”或者“pt”是指n-氧化-2-巯基吡啶(pyrithione,pt)，是一种金属结合剂，被证明具有广谱的抗真菌和抗细菌活性(g.l.diamond,n.p.skoulis,a.r.jeffcoat,j.f.nash,a physiological-based pharmacokinetic model for the broad spectrum antimicrobial zinc pyrithione:ii.dermal absorption and dosimetry in the rat,j toxicol environ health a 84(15)(2021)609-631.)。其中与金属锌形成的吡啶硫酮锌(zinc pyrithione，zpt)是应用最广泛的去头屑成分，具有广谱和高效的抗细菌及抗真菌性能。
40.本文所说“zif-8”是沸石咪唑酯骨架，是zifs的典型代表，其通过金属锌与二甲基咪唑配位而形成，可作为药物递送载体。现有文献记载，以纳米材料为基础的药物载体可以攻克生物膜屏障，将抗生素递送到细胞质中杀死细胞内的细菌，从而减少抗生素的用量，且具有耐药性低、广谱、靶向等优点，可作为递送抗生素的理想载体(w.gao,l.zhang,nanomaterials arising amid antibiotic resistance,nat rev microbiol 19(1)(2021)5-6.)。其中沸石咪唑酯骨架结构材料(zeolitic imidazolate frameworks，zifs)是近年来较为热门的纳米材料，具有良好的孔径、结构和成分可调、尺寸可调、功能广泛、载药量高、生物相容性好等优良特性，是很有前途的药物传递载体(j.yang,y.w.yang,metal-organic frameworks for biomedical applications,small 16(10)(2020)e1906846.；j.troyano,a.carne-sanchez,c.avci,i.imaz,d.maspoch,colloidal metal-organic framework particles:the pioneering case of zif-8,chem soc rev 48(23)(2019)
41.5534-5546.)。
42.由于锌离子本身就具有抗菌作用，以zif-8为框架的载药系统能提高药物的抗菌效率(y.su,i.cockerill,y.wang,y.qin,l.chang,y.zheng,d.j.t.i.b.zhu,zinc-based biomaterials for regeneration and therapy,37(4)(2019)
43.428-441.)。且其ph响应性的优点也得到了广泛的关注与应用，由于载药系统主要是针对肿瘤部位、细菌或被膜这些呈酸性的环境中，这使zif-8作为包载材料具有靶向性作用。在生物环境下(ph为中性)可以维持结构稳定尽可能的防止药物释放，当到达病灶部位时由于ph响应而释放药物，可以提高药物的生物利用率，减少药物的毒副作用(x.mi,m.hu,m.dong,z.yang,x.zhan,x.chang,j.lu,x.j.i.j.o.n.chen,folic acid decorated zeolitic imidazolate framework(zif-8)loaded with baicalin as a nano-drug delivery system for breast cancer therapy,16(2021)8337-8352.)。
44.本文所说的“抗菌剂”是指包含上述纳米复合体zif-8@pt复合体的抗菌剂，其对病原体，如致病菌，包括耐药菌等具有抑制、杀灭的功能。在一些实施例中，抗菌剂可以为抗菌剂可以为包含上述纳米复合体的液体制剂、冻干制剂、粉末、片剂、胶囊等。
45.本文所说的“双重抗菌机理”或者“双重抗菌”是指将前体药物pt负载于zif-8中，其可靶向于细菌感染的酸性部位，且在该部位释放pt及锌离子。进一步地，pt与zif-8释放的zn
2+
自组装形成zpt。pt及zpt均具有杀灭细菌的功能，因此能够有效的提高抗菌效果。在一些实施例中，包含zif-8@pt复合体的纳米抗菌剂对维氏气单胞菌的最小抑菌浓度为4μg/ml，相比于单独的pt降低了32倍。最小杀菌浓度为8μg/ml，在此浓度下仅需4小时就能完全
杀死维氏气单胞菌。
46.本文所说“维氏气单胞菌”隶属于弧菌科气单胞菌属，为革兰阴性杆菌，兼性厌氧型。其广泛存在于各种水体生态系统中，是致人、鱼共患病细菌，经常可从腹泻的人类排泄物、出血性败血症的鱼类中分离得到。
47.术语“耐药”、“抗药”是指细菌细菌对于抗菌药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的抗菌作用将明显下降。耐药性根据其发生原因可分为获得耐药性和天然耐药性。自然界中的病原体，如细菌的某一株也可存在天然耐药性。当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。在本技术中，发明人经过长达月余的大量实验，并未发现病原体对本技术的纳米抗菌剂产生任何耐药特征。
48.本技术的纳米复合体，由pt负载于zif-8后获得，其中zif-8@pt中zif-8与pt的摩尔质量比为(8-15):10。进一步地，在一些实施例中，zif-8@pt中zif-8与pt的摩尔质量比为8:10，或者9:10，或者10:10，或者11:10，或者12:10，或者13:10，或者14:10，或者15:10。在一些实施例中，zif-8@pt中zif-8与pt的摩尔质量比并非整数比，如zif-8@pt中zif-8与pt的摩尔质量比为8.1:10，或者8.2:10
……
或者14.8:10，或者14.9:10，以此类推，此处不再一一列举。或者zif-8@pt中zif-8与pt的质量比为(0.5-3.5):1。进一步地，在一些实施例中，进一步地，zif-8@pt中zif-8与pt的质量比为0.5:1，或者0.6:1，或者0.7:1，或者0.8:1，或者0.9:1，或者1:1，或者1.1:1，或者1.2:1，或者1.3:1，或者1.4:1，或者1.5:1，或者1.6:1，或者1.7:1，或者1.8:1，或者1.9:1，或者2.0:1，或者2.1:1，或者2.2:1，或者2.3:1，或者2.4:1，或者2.5:1，或者2.6:1，或者2.7:1，或者2.8:1，或者2.9:1，或者3.0:1，或者3.1:1，或者3.2:1，或者3.3:1，或者3.4:1，或者3.5:1等。本领域技术人员应当理解，上述列举的摩尔质量比和质量比并不对本技术的摩尔质量比和质量比进行限定，仅为上述摩尔质量比和质量比的范围内举例。
49.zif-8由2-甲基咪唑溶液与硫酸锌溶液混合合成，溶液中zn
2+
、2-甲基咪唑和h2o的摩尔比为1：(65-75)：(1000-1500)；进一步地，摩尔比为1:70:1238。
50.在一个实施方案中，zif-8@pt的尺寸为(180-210)nm。进一步地，在一些实施例中，zif-8@pt的尺寸为193.80
±
2.68nm,。在一些实施例中，zif-8@pt的zeta电位为(15-40)mv；进一步地，zif-8@pt的zeta电位为-27.80
±
4.98mv。
51.本技术的纳米复合体对病原体，例如维氏气单胞菌具有显著的抗菌活性，且不会筛选出耐药株。在一些实施例中，本技术的纳米抗菌剂可用于预防、鱼类、灵长类动物、啮齿类动物、兔类、犬科、畜类甚至人类等的病原体感染，如鱼类、人、黑猩猩、猴、小鼠、大鼠、兔、狗、猪、牛、羊的病原体感染。进一步地，根据本技术的一个实施例，本技术的纳米抗菌剂可用于或预防动物手术等导致的腹部病原体感染。
52.在一些实施例中，本技术的纳米抗菌剂用于预防或动物的病原体感染时，给药方式可以为注射、口服等形式。在一些实施例中，本技术的纳米抗菌剂可以具有液体制剂、冻干制剂、粉剂、片剂、胶囊等形式。特别的，当将本技术的纳米抗菌剂用于鱼类病原体感染的预防及时，可以将纳米抗菌剂溶解在水环境中，或掺杂在养殖饲料中。
53.实施例1 zif-8和zif-8@pt的制备
54.在本实施例中，通过共沉淀法合成zif-8。具体步骤包括：首先，将1.242g六水合硫
酸锌溶于8ml去离子水中。其次，将22.70g 2-甲基咪唑溶解在另外80ml水中。然后在室温下将硫酸锌溶液与2-甲基咪唑溶液搅拌混合。两种溶液混合后，合成溶液几乎立即变成乳白。室温搅拌大约5min后，9000rpm离心5分钟。去离子水洗涤数次去除未反应的物质，产品在55℃真空烘箱中干燥12h生成zif-8。
55.称取pt与zif-8的比例为1:2加入到10ml蒸馏水中超声分散，室温下震荡吸附24h，5000r/min离心10min，用10ml蒸馏水洗涤3次，60℃烘箱干燥12h，得到zif-8@pt晶体。
56.其中，根据发明人的多次实验及对震荡不同时间的zif-8上的pt载量测定后可发现，试问震荡24h后zif-8载pt的量最高，高达36.5％。在一个实施方案中，zif-8@pt的尺寸为193.80
±
2.68nm,zeta电位为-27.80
±
4.98mv。在一些实施例中，zif-8@pt晶体中zif-8与pt的摩尔质量比为11:10；或者在一些实施例中，zif-8@pt中zif-8与pt的质量比为2:1。zif-8由2-甲基咪唑溶液与硫酸锌溶液混合合成，溶液中zn
2+
、2-甲基咪唑和h2o的摩尔比为1：(65-75)：(1000-1500)；进一步地，摩尔比为1:70:1238。
57.图1为根据本技术一个实施例的zif-8和装载pt后的zif-8的表征图示；其中图1(a)为扫描电子显微镜下的表征图示；以及图1(b)为透射电子显微镜下的表征图示。如图1(a)和图1(b)所示，pt的装载，对zif的结构物影响，进一步地，装载pt不会影响zif的功能。
58.图2是根据本技术的另一个实施例的zif-8和zif-8@pt表征图示，其中a为zif-8和zif-8@pt的粒径柱状图；b为zif-8和zif-8@pt的电位柱状图。如图2a和图2b所示，装载pt前后，zif-8的粒径变化不大，zif-8的电位由装载前的-25.4mv变化至-27.8mv。
59.实施例2 zif-8@pt的ph响应释放分析
60.在之前的工作中调查了zif-8@pt的ph响应性能。简单地说，pt在zif-8@pt中不同ph的释放如下：10mg zif-8@pt分散在20ml 0.5％(v/v)吐温20/pbs溶液中，放置在37℃，在150转/分的摇床上不断搅拌。取上清液1ml，在不同时间点(0.5、1、2、4、8、16、32、64h)以不同ph加缓冲液1ml，上清液用乙醇稀释20倍，在362nm处测定吸光度，根据标准曲线计算pt释放量。
61.图3是根据本技术的一个实施例的zif-8@pt的ph响应释放曲线。如图3所示，zif-8@pt的pt释放具有ph依赖性，在ph为5.5的酸性环境中，pt的释放量远高于ph为7.4的中性环境。
62.实施例3 zif-8@pt对维氏气单胞菌的抗菌能力
63.采用微量稀释法测定zif-8、pt和zif-8@pt对维氏气单胞菌的最低抑制浓度(mic)。96孔板上分别加入维氏气单胞菌(1
×
106菌落形成单位(cfu)/ml)95μl和zif-8@pt(512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml)5μl,pbs 5μl作为对照。每组3个重复序列平行，96孔板在30℃下培养24h。然后用酶标仪测量96孔板在600nm处的吸光度。
64.采用琼脂扩散法测定zif-8、pt和zif-8@pt对维氏气单胞菌的最小抑菌浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc)。96孔板上培养的菌悬液取待测菌液50μl，铺于琼脂上。计数各平板上的菌落数，然后测定mbc。
65.参考微量二倍稀释法检测zif-8、pt和zif-8@pt对维氏气单胞菌的最低抑菌浓度(mic)。预先于96孔培养板中加入95μl浓度为0.01od的菌液，试验组加入5μl zif-8@pt使其每孔的终浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml，每组均设3个重复孔，充分混匀，置于30℃温箱中培养24h，利用酶标仪测定od600值从而确定化合物的mic值。
66.采用琼脂扩散法测定化合物对维氏气单胞菌的最小杀菌浓度(mbc)。从上述96孔板培养的菌悬液中，将肉眼无细菌生长的每管中取50μl试验菌液分别移种至不含药物的lb琼脂平皿上；过夜培养后，每块平板上生长的菌落数少于5个，即是药物的最低杀菌浓度(mbc)。
67.图4(a)-图4(b)显示了zif-8@pt对维氏气单胞菌的抑菌及杀菌能力。表1为根据本技术一个实施例的zif-8@pt对维氏气单胞菌的抗菌能力的数据记录。如表1所示，根据发明人的实验记录可知，zif-8@pt对维氏气单胞菌的最小抑菌浓度为4μg/ml，相比于单独的pt降低了32倍。最小杀菌浓度为8μg/ml，在此浓度下仅需4小时就能完全杀死维氏气单胞菌。
68.表1 zif-8@pt对维氏气单胞菌的抗菌能力
[0069] mic(μg/ml)最小抑菌浓度mbc(μg/ml)杀菌zif-8＞512＞512pt1664zif-8@pt(pt含量为0.5μg/ml)48
[0070]
实施例4 抗菌活性zif-8@pt
[0071]
将a.veronii c4的1
×
106cfu分散到1ml 1
×
pbs/含8μg zif-8@pt的培养基中，在30℃下分别孵育0、0.5、1、2和4h。取样品100μl，按不同时间间隔涂布于琼脂平板上，30℃孵育24h。
[0072]
图4是根据本技术的一个实施例的zif-8@pt在不同ph条件和不同处理时间下的抗维氏气单胞菌的效果；其中图4(a)为根据本技术一个实施例的以pbs处理的培养基上维氏气单胞菌在不同ph条件下的存活及生长图示；图4(b)为根据本技术一个实施例的以zif-8@pt处理的培养基上维氏气单胞菌在不同ph条件下的存活及生长图示。如图4(a)-图4(b)所示，用zif-8@pt处理的培养基上维氏气单胞菌被显著抑制，装载pt后的zif-8具有明显的抗菌活性。进一步地，ph为5.5时的抗菌活性好于ph为7.4时。
[0073]
实施例5 zif-8@pt在不同ph条件下的抗菌活性
[0074]
为研究ph对zif-8@pt抗菌活性的影响，用pbs和zif-8@pt(8g/ml)分别在ph 5.5和7.4条件下孵育1
×
106cfu 0、0.5、1、2、4h。取100μl细菌按不同时间间隔涂抹在琼脂平板上，30℃孵育24h后，用凝胶成象仪对平板进行成像，用image j软件计数细菌数量。每个试验独立重复3次。
[0075]
图4是根据本技术的一个实施例的zif-8@pt在不同ph条件和不同处理时间下的抗维氏气单胞菌的效果；其中图4(c)为根据本技术一个实施例的以pbs处理的培养基上维氏气单胞菌在不同ph条件下的存活柱状统计图；以及图4(d)为根据本技术一个实施例的以zif-8@pt处理的培养基上维氏气单胞菌在不同ph条件下的存活柱状统计图。表2为不同ph下以zif-8@pt处理的培养基对维氏气单胞菌的抑菌率。如图4(c)-图4(d)及表1所示，用zif-8@pt处理的培养基上维氏气单胞菌被显著抑制，装载pt后的zif-8具有明显的抗菌活性。进一步地，ph为5.5时的抗菌活性好于ph为7.4时。
[0076]
表2 以zif-8@pt处理的培养基对维氏气单胞菌的抑菌率
[0077][0078]
实施例6 zif-8@pt对生物膜形成的影响
[0079]
生物膜是细菌阻止抗生素进入和抵抗环境压力的强大屏障，它的形成是多种微生物引起慢性感染的关键毒力因素。因此具有抑制生物膜的形成以及清除已形成的生物膜的能力，是优良抗菌物质所必要的。(h.koo,r.allan,r.howlin,p.stoodley,l.j.n.r.m.hall-stoodley,targeting microbial biofilms:current and prospective therapeutic strategies,15(12)(2017)740-755.z.chen,z.wang,j.ren,x.j.a.o.c.r.qu,enzyme mimicry for combating bacteria and biofilms,51(3)(2018)789-799.m.valdes-pena,n.massaro,y.lin,j.j.a.o.c.r.pierce,leveraging marine natural products as a platform to tackle bacterial resistance and persistence,54(8)(2021)1866-1877.)
[0080]
实验过程中，实验人员在96孔板中加入维氏气单胞菌(a.veronii c4)(1
×
106cfu/ml)100μl,30℃孵育36h。pbs洗涤3次后，加入pbs和zif-8@pt100μl，孵育24h。96孔板中加入100μl的维氏气单胞菌(a.veronii c4)(1
×
106cfu/ml)，pbs和zif-8@pt(8μg/ml)处理。30℃培养36h。取结晶紫(1％)200μl，室温下培养10min。用33％冰醋酸溶解后用酶标仪记录平板590nm处的吸光度。
[0081]
图5是根据本技术的一个实施例的zif@pt对维氏气单胞菌生物膜、形态和细胞内结构的影响；其中，图5(a)为根据本技术一个实施例的zif-8@pt对维氏气单胞菌生物膜形成的抑制作用；图5(b)为根据本技术一个实施例的zif-8@pt对已建立的维氏气单胞菌生物膜的去除效果。如图5(a)-图5(b)所示，为了评估zif-8@pt是否影响生物膜的形成，实验人员通过结晶紫染进行研究，结果表明在培养初始未形成生物膜时加入zif-8@pt可显著抑制生物膜的形成，zif-8@pt可能是通过影响细菌的生长从而影响生物膜的形成。但当细菌先培养24h，确保形成生物膜后再加入zif-8@pt进行处理，发现与pbs处理的对照组相比其也能清除51.5％的生物膜。这就可以说明zif-8@pt不仅可以通过抑制生长来抑制生物膜的形成，而且可以对已形成的生物膜起到一定的消除效果。
[0082]
实施例7 zif-8@pt处理后细菌形态
[0083]
用扫描电镜(sem，蔡司sigma 300，德国)和透射电镜(tem,fei talos f200x，美国)观察维氏气单胞菌(a.veronii c4)分别用pbs、zif-8@pt和pt处理后的形态。简单地说，1
×
106cfu分别用pbs、pt(32μg/ml)和zif-8@pt(8μg/ml)孵育维氏气单胞菌(a.veronii c4)。30℃处理12h后，收集细菌，2.5％戊二醛固定。梯度脱水包埋得到70μm的薄片，并在透射电镜下观察。另外，将梯度脱水处理过的细菌浸泡在硅片上，用sem记录样品。
[0084]
图5是根据本技术的一个实施例的zif@pt对维氏气单胞菌生物膜、形态和细胞内结构的影响；其中，图5(c)为根据本技术一个实施例的维氏气单胞菌经zif-8和pbs处理24h
的扫描电子显微镜(sem)图示；图5(d)为根据本技术一个实施例的维氏气单胞菌经zif-8、pt和zif-8@pt处理24h的透射电子显微镜(tem)图示。如图5(c)-图5(d)所示，经pt或者zif-8@pt处理的维氏气单胞菌的形态及细胞内形态均发生了变化。在一些实施例中，包含zif-8@pt复合体的抗菌剂可以抑制维氏气单胞菌生物膜的形成，并且消除已经形成的生物膜。进一步地，在一些实施例中，包含zif-8@pt复合体的杀菌剂处理维氏气单胞菌后，维氏气单胞菌细菌表面可以清楚地观察到塌陷、收缩和一些破裂。
[0085]
实施例8 zif-8@pt抑制腹部感染，不产生毒性
[0086]
申请人验证了zif-8@pt有能力腹部感染，并评估了zif-8@pt在多药耐药菌引起的腹部感染方面的前景。
[0087]
图6(a)为根据本技术一个实施例的维氏气单胞菌感染的实验设计。如图6(a)所示，在本实施例中，申请人用维氏气单胞菌(a.veronii c4)感染小鼠，并在感染4h后腹腔注射4
×
106cfu维氏气单胞菌给小鼠zif-8@pt。pbs、卡那霉素(kan)以及游离的吡啶硫酮(pt)的小鼠作为对照。
[0088]
图6(b)是根据本技术一个实施例的pbs、吡啶硫酮(pt)、zif-8@pt和卡那霉素(kan)后的小鼠主要器官组织中的细菌培养琼脂板。申请人进一步评估了pbs、吡啶硫酮(pt)、卡那霉素和zif-8@pt后感染小鼠器官内的细菌计数。图6(c)是根据本技术一个实施例的pbs、pt、zif-8@pt和卡那霉素(kan)后的小鼠心脏中的细菌计数；图6(d)是根据本技术一个实施例的pbs、pt、zif-8@pt和卡那霉素(kan)后的小鼠肝脏中的细菌计数；图6(e)是根据本技术一个实施例的pbs、pt、zif-8@pt和卡那霉素(kan)后的小鼠脾脏中的细菌计数；图6(f)是根据本技术一个实施例的pbs、pt、zif-8@pt和卡那霉素(kan)后的小鼠肺中的细菌计数；图6(g)是根据本技术一个实施例的pbs、pt、zif-8@pt和卡那霉素(kan)后的小鼠肾脏中的细菌计数。如图6(b)-图6(g)所示，维氏气单胞菌在心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的主要组织中增殖明显，平均细菌数量约为1
×
106cfu/g。与游离pt相比，在16h内，zif-8@pt和卡那霉素显著降低了感染小鼠的心脏、脾脏、肺、肾脏的细菌数量，说明zif-8@pt在多药耐药菌引起的感染方面优于临床抗生素。
[0089]
图6(h)是根据本技术一个实施例的pbs、pt、zif@pt和卡那霉素(kan)后感染小鼠的存活率。如图6(h)所示，pbs和pt组小鼠在感染维氏气单胞菌后12小时内死亡。与此同时，卡那霉素(kan)的感染小鼠在感染后14小时存活率为60％，而zif-8@pt的感染小鼠在感染后14小时存活率为100％，说明与游离pt和卡那霉素相比，zif-8@pt可以显著提高感染小鼠的存活率。
[0090]
此外，申请人通过测量炎症细胞因子来评估zif-8@pt感染的疗效。图6(i)是根据本技术一个实施例的对照组和感染小鼠后血清中il-4的水平；图6(j)是根据本技术一个实施例的对照组和感染小鼠后血清中il-6的水平；以及图6(k)是根据本技术一个实施例的对照组和感染小鼠后血清中il-1β的水平。如图6(i)-图6(k)所示，zif-8@pt和卡那霉素(kan)降低了il-1β，il-4和il-6的水平，使其恢复至与正常生理范围的水平相当。
[0091]
因此，由于其特异性的双选择机制，zif-8@pt适合于临床抗生素腹部感染引起的多药耐药菌，并表现出良好的能力。
[0092]
图7为根据本技术一个实施例的维氏气单胞菌对zif-8@pt的耐药性测试。值得注
意的是，实验过程中，在长达月余的大量实验过程中，经包含本技术的纳米复合体的病原体中，发明人并未发现任一株耐药细菌产生。
[0093]
上述实施例仅供说明本技术之用，而并非是对本技术的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本技术范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此，所有等同的技术方案也应属于本技术公开的范畴。

技术特征：

1.一种纳米分子复合体，包括：沸石咪唑酯骨架zif-8；以及吡啶硫酮(pt)；其中，所述吡啶硫酮(pt)负载于沸石咪唑酯骨架zif-8。2.根据权利要求1所述的纳米分子复合体，其中，zif-8与pt的摩尔质量比为(8-15):10。3.根据权利要求1所述的纳米分子复合体，其中，zif-8与pt的质量比为(0.5-3.5):1。4.根据权利要求1所述的纳米分子复合体，其中，所述沸石咪唑酯骨架zif-8包括硫酸锌(znso4)和2-甲基咪唑，其在水溶液中形成；其中，zn
2+
、2-甲基咪唑和水的摩尔比为1：(65-75)：(1000-1500)。5.根据权利要求1所述的纳米分子复合体，其尺寸为(180-210)nm，优选位193.80
±
2.68nm,；zeta电位为(15-40)mv，优选为-27.80
±
4.98mv。6.一种纳米抗菌剂，包括如权利要求1-5任一所述的纳米分子复合体。7.如权利要求1-5任一所述的纳米分子复合体在制备预防和/或由病原体引起的相关疾病的纳米抗菌剂方面的应用。8.根据权利要求7所述的应用，所述纳米抗菌剂为ph响应型抗菌剂。9.根据权利要求7所述的应用，包括对病原体施用有效剂量的纳米抗菌剂，所述有效施用计量为纳米复合体的浓度不小于3μg/ml；优选地，抑制病原菌生长的有效剂量为纳米复合体的浓度不小于3.5μg/ml，优选不小于4μg/ml；优选地，杀灭病原菌的有效剂量为纳米复合体的浓度不小于7μg/ml，优选不小于8μg/ml。10.如权利要求1-5任一所述的纳米分子复合体或者如权利要求6所述的纳米抗菌剂在影响病原体生物膜的形态方面的应用。11.根据权利要求10所述的应用，所述纳米分子复合体或者纳米抗菌剂通过抑制病原体形成生物膜或清除病原体已形成的生物膜影响病原体生物膜的形态。12.根据权利要求10所述的应用，所述纳米分子复合体或者纳米抗菌剂通过使病原体表面塌陷、收缩和/或破裂影响病原体生物膜的形态。13.如权利要求10-12任一所述的应用，所述病原体为维氏气单胞菌。14.一种在体外杀灭或抑制病原菌生长的方法，包括对病原体施用有效剂量的如权利要求1-5任一所述的纳米复合体或者如权利要求6所述的纳米抗菌剂。15.如权利要求1-5任一所述的纳米复合体或者如权利要求6所述的纳米抗菌剂在制备预防和/或鱼类或哺乳动物病原体感染的药物方面的应用。16.根据权利要求15所述的应用，所述感染为腹部感染。17.根据权利要求15所述的应用，所述哺乳动物包括但不限于人类、灵长类动物、啮齿类动物、兔类、犬科、畜类。18.根据权利要求17所述的应用，所述哺乳动物包括但不限于人、黑猩猩、猴、小鼠、大鼠、兔、狗、猪、牛、羊。

技术总结

本申请涉及一种纳米分子复合体，包括：沸石咪唑酯骨架ZIF-8；以及吡啶硫酮(PT)；其中，所述吡啶硫酮(PT)负载于沸石咪唑酯骨架ZIF-8。本申请的纳米抗菌剂以纳米材料为载体，结合双重抗菌机理，可靶向细菌感染等部位，具有高效抗菌效果的同时，不会使细菌产生耐药性，也可显著减少甚至杜绝超级细菌的产生。可显著减少甚至杜绝超级细菌的产生。可显著减少甚至杜绝超级细菌的产生。