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六氢苯并菲啶类生物碱在保护多巴胺神经元中的应用

六氢苯并菲啶类生物碱在保护多巴胺神经元中的应用
1.本技术为申请号2021105224812、申请日2021年5月13日、发明名称“六氢苯并菲啶类生物碱及其制备方法和应用”的分案申请。
技术领域
2.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及六氢苯并菲啶类生物碱在保护多巴胺神经元中的应用。

背景技术：

3.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
4.扭果紫金龙(dactylicapnos torulosa)系科紫金属植物，一年生草本植物，目前在我国仅云南西北部、西部、中部至东南部，贵州西部，四川西南部和西藏东南部有发现的记录。在自然状态下，生于海拔1 200～3 000m的林下、灌丛下或沟边、路旁。扭果紫金龙中主要存在的活性成分为生物碱类，具有调节心血管系统、镇痛、解痉、保肝、抗缺氧、抗疟等活性。扭果紫金龙的化学成分复杂，活性分分离困难，而很少有分离具体高纯六氢苯菲啶类生物碱的报道。
5.炎症在很多流行病症中也扮演了重要角，如阿尔兹海默病、帕金森、肝癌和肺癌等。在发达国家或是发展中国家，由炎症导致的神经退行性疾病帕金森(parkinson's disease，pd)，均是严重威胁着人类健康和人类的幸福生活。帕金森病是多发于中老年人的锥体外系疾病中的一种，又称震颤麻痹，是目前仅次于阿尔兹海默症的第二大神经系统疾病，病程为慢性进展性，尚无有效预防办法，且会随着年龄的增长，患病率成倍升高。
6.据报道，同属植物紫金龙中成分普罗托品抑制5-羟胺转运体和去甲肾上腺素转运体，在小鼠模型中具有抗抑郁作用，提示它们可能改善神经退行性疾病活性。普罗托品还具有对抗血小板聚集影响血小板活性物质的释放，提示可能具有抗血栓活性。发明人发现，前人只对紫金龙镇痛和对心血管的作用进行了系统研究。而对扭果紫金龙中的苯菲啶类生物碱化合物及其医药生物活性鲜有报道。

技术实现要素：

7.基于上述现有技术的不足，本发明提供六氢苯并菲啶类生物碱及其制备方法和应用，本发明首次以扭果紫金龙作为原料，通过提取分离纯化获得两种高纯度六氢苯并菲啶类生物碱，经试验验证，其对对花生四烯酸致的血栓有抑制作用、硫酸铜所致的斑马鱼炎症具有抑制作用和对多巴胺神经元具有强烈的保护作用，表明该类生物碱化合物可能会是新型有效的心帕金森疾病的药物，具有良好的实际应用之价值。
8.本发明的第一个方面，提供一种如式(i)所示的化合物：
[0009][0010]
其中，r可以选自och3或h；
[0011]
当r选自och3时，即为化合物1：4-methoxychelidonine；
[0012]
当r选自h时，即为化合物2：chelidonine。
[0013]
在本发明的一些实施方案中，具有式(i)所示六氢苯并菲啶类生物碱可以制备成晶形或非晶形，并且如果是晶体，则其可以任选成为溶剂化物，例如作为水合物。
[0014]
本发明的第二个方面，提供上述化合物的制备方法，所述化合物的制备方法如下：
[0015]
s1、扭果紫金龙加乙醇浸渍提取，合并浓缩提取液得粗提物；
[0016]
s2、将粗提物悬浮于稀盐酸抽滤得滤液，调节ph至碱性，依次使用石油醚、二氯甲烷和正丁醇进行萃取；
[0017]
s3、将二氯甲烷萃取物进行硅胶柱分离，使用200:1至1:1梯度的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经谱分析，合并收集含有化合物1的流份段；
[0018]
s4、将正丁醇萃取物经mci柱处理，使用1:4至9:1梯度的甲醇-水进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经谱分析，合并收集含有化合物2的流份段。
[0019]
本发明的第三个方面，提供上述化合物在如下任意一种或多种中的应用：
[0020]
a)抑制血栓形成和/或制备抑制血栓形成相关药物；
[0021]
b)抑制炎症反应和/或制备抑制炎症反应相关药物；
[0022]
c)保护多巴胺神经元和/或保护多巴胺神经元相关药物；
[0023]
d)心帕金森疾病和/或制备心帕金森疾病相关药物。
[0024]
本发明的第四个方面，提供一种心帕金森疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的上述化合物。
[0025]
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
[0026]
上述技术方案中从扭果紫金龙中同时分离并高效获得两种六氢苯并菲啶类生物碱，从而实现了天然药物资源的综合利用，为寻新的药物活性成分提供有效的途径。
[0027]
同时，通过对由扭果紫金龙中分离得到的生物碱类化合物进行了抗炎、抗血栓、抗mptp诱导的帕金森活性的测试实验和构效关系研究，结果发现六氢苯菲啶类生物碱对花生四烯酸致的血栓有抑制作用、硫酸铜所致的斑马鱼炎症具有抑制作用和对多巴胺神经元具有强烈的保护作用，表明该类生物碱化合物可能会是新型有效的心帕金森疾病的药物，因此具有较好的实际应用前景。
附图说明
[0028]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0029]
图1为本发明实施例分离的4-methoxychelidonine的hr-esi-ms图谱。
[0030]
图2为本发明实施例分离的4-methoxychelidonine的1hnmr图谱(600mhz，in cd3od)。
[0031]
图3为本发明实施例分离的4-methoxychelidonine的
13
cnmr图谱(400mhz，in cd3od)。
[0032]
图4为本发明实施例分离的4-methoxychelidonine的hsqc图谱(400mhz，in cd3od)
[0033]
图5为本发明实施例分离的4-methoxychelidonine的hmbc图谱(400mhz，incd3od)。
[0034]
图6为本发明实施例分离的(+)-chelidonine的1hnmr图谱(600mhz，in cdcl3)。
[0035]
图7为本发明实施例分离的(+)-chelidonine的
13
cnmr图谱(400mhz，in cdcl3)。
[0036]
图8为本发明实施例化合物1和2在3个不同浓度下抑制硫酸铜诱导斑马鱼炎症的实验结果；其中，a为炎症反应实测图，b为试验数据统计图。
[0037]
图9为本发明实施例化合物1和2在3个不同浓度下抗血栓活性测定结果；其中，a为抗血栓活性实测图，b为试验数据统计图。
[0038]
图10为本发明实施例化合物1和2保护多巴胺神经元测定结果；其中，a为各组da神经元长度统计图；b为各组荧光显微镜观察幼鱼da神经元情况图；c为各组斑马鱼运动轨迹图。
具体实施方式
[0039]
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0040]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0041]
如前所述，目前对扭果紫金龙中的苯菲啶类生物碱化合物及其医药生物活性鲜有报道。
[0042]
有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种如式(i)所示的苯菲啶类生物碱化合物：
[0043][0044][0045]
其中，r可以选自och3或h；
[0046]
当r选自och3时，即为化合物1：4-methoxychelidonine；
[0047]
当r选自h时，即为化合物2：chelidonine。
[0048]
在本发明的一些实施方案中，具有式(i)所示六氢苯并菲啶类生物碱可以制备成晶形或非晶形，并且如果是晶体，则其可以任选成为溶剂化物，例如作为水合物。
[0049]
本发明的又一具体实施方式中，提供上述化合物的制备方法，包括：
[0050]
s1、扭果紫金龙加乙醇浸渍提取，合并浓缩提取液得粗提物；
[0051]
s2、将粗提物悬浮于稀盐酸抽滤得滤液，调节ph至碱性，依次使用石油醚、二氯甲烷和正丁醇进行萃取；
[0052]
s3、将二氯甲烷萃取物进行硅胶柱分离，使用200:1至1:1梯度的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经谱分析，合并收集含有化合物1的馏分段；
[0053]
s4、将正丁醇萃取物经mci柱处理，使用1:4至9:1梯度的甲醇-水进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经谱分析，合并收集含有化合物2的馏分段。
[0054]
上述提取制备方法由粗至精的方式从扭果紫金龙中逐步分离出上述化合物的高纯度单体成分。
[0055]
本发明中所述的梯度洗脱是指洗脱过程中不断改变流动相的浓度配比，但起始浓度和终点浓度是固定的，比如“使用200:1至1:1梯度的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱”是指：二氯甲烷-甲醇按照起始体积比为200:1、洗脱终点体积比为1:1的方式进行梯度洗脱。
[0056]
本发明的制备方法的各个步骤可以进一步改进，例如：
[0057]
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤s1中，
[0058]
所述步骤s1中，扭果紫金龙原料包括扭果紫金龙地下部分和地上部分；
[0059]
浸提所用的溶剂、料液比对粗提物的杂质含量以及有效成分的提取率均有影响。溶剂优选使用90～95％的乙醇溶液，进一步优选为95％乙醇溶液。扭果紫金龙与乙醇的料液比1kg：2～7l(优选1.06kg：3l)。更具体的，采用多次浸提法进行浸提。采用上述浸提条件有效降低粗提物中的杂质含量，从而进一步提高六氢苯并菲啶类生物碱的提取率。
[0060]
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤s2中，
[0061]
所述稀盐酸为0.5％-5％的稀盐酸，盐酸浓度控制为0.5％、1％、2％、3％或5％；
[0062]
所述“调节ph至碱性”的步骤中，采用20-30％氨水将滤液ph调节至9-12。
[0063]
依次使用石油醚、二氯甲烷和正丁醇进行萃取具体方法包括：
[0064]
加入石油醚，静置提取10～30min，收集上层清液，即提取液，在40-50℃减压回收石油醚，回收的石油醚再次用于提取，直至最终所得提取液颜呈浅绿，减压回收石油醚，得石油醚浸膏；再依次采用二氯甲烷和正丁醇按照石油醚的提取过程进行提取，分别获得二氯甲烷浸膏和正丁醇浸膏；
[0065]
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤s3中，
[0066]
二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱具体程序为：二氯甲烷与甲醇的体积比＝200:1、180:1、150:1、100:1、60:1、250:1、10:1、5:1、2:1和1:1；采用以上优化梯度条件，可以提高分离度；
[0067]
进一步的，采用tlc薄层谱和质谱跟踪检测，收集主要含目标组分的馏分，进行浓缩，所得浸膏硅胶薄层检测并合并相似组分，得到8个组分即s1
–
s8；s3组分进行液相谱分离(1.5ml/min，meoh-h2o(0.1％tea)77:23)得到化合物1即4-methoxychelidonine(tr＝28.0min)；
[0068]
液相谱参数如下：
[0069]
谱仪：agilent 1260-dad；
[0070]
谱柱：agilent ymc-pack ods-as
–
5μm，12nm(250mm
×
10mm)-c18；
[0071]
洗脱液为：流动相b甲醇，流动相a为0.1％三乙胺水，流速：1.5ml/min，
[0072]
等度洗脱：0～15min，b：77vol％，a：23vol％。
[0073]
采用上述液相谱分离即可直接获得高纯度的化合物1。
[0074]
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤s4中，
[0075]
用甲醇和水进行梯度洗脱，梯度洗脱具体程序为：甲醇与水的体积比＝1:4、2:3、3:2、4:1和9:1。
[0076]
进一步的，采用tlc薄层谱和质谱跟踪检测，收集主要含目标组分的馏分，得到4个组分(3i1
–
3i4)。3i4以甲醇和水为洗脱剂，进行梯度洗脱(v/v＝3:1)；经ods柱分离得到9个组分(3i4o1
→
3i4o9)。由3i4o5重结晶得到化合物2即chelidonine。
[0077]
本发明的又一具体实施方式中，提供上述化合物在如下任意一种或多种中的应用：
[0078]
a)抑制血栓形成和/或制备抑制血栓形成相关药物；
[0079]
b)抑制炎症反应和/或制备抑制炎症反应相关药物；
[0080]
c)保护多巴胺神经元和/或保护多巴胺神经元相关药物；
[0081]
d)心帕金森疾病和/或制备心帕金森疾病相关药物。
[0082]
本发明的又一具体实施方式中，提供一种心帕金森疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的上述化合物。
[0083]
本发明所述受试者是指已经是、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。
[0084]
本发明所述有效量是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药物制剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，所述响应包括减轻或部分减轻所述疾病、综合征、病症或障碍的症状。
[0085]
本领域的研究者、兽医、医生或其他医疗人员可根据临床试验或者本领域其他公知的手段获知可使用的有效量的范围。
[0086]
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0087]
实施例提取分离实验
[0088]
1)将扭果紫金龙原料(10.6kg：根1.1kg加地上部分9.5kg)采用95％乙醇(3
×
30l，第一次7天，第二次10天，第三次3天)冷液浸渍法提取，合并三次的提取液，使用巩义市予华仪器有限责任公司的大型旋蒸仪浓缩提取液(水域锅温度55摄氏度，真空度-0.06mpa)即得500g粗提物。将部分粗提物(483.2g)悬浮于1％稀盐酸(3l)中，抽滤获得滤液，用25％氨水将滤液ph调节至10，依次用石油醚(3
×
3l)萃取得到pe提取物(1.7g)，用ch2cl2(800ml，700ml，800ml和700ml)得到ch2cl2提取物(3.9g)，用n-buoh(400ml、300ml和300ml)得到nbuoh提取物(5.6g)，余下水层部分(140.3g)。
[0089]
具体的，使用石油醚、二氯甲烷和正丁醇萃取的步骤包括：加入石油醚，静置提取10～30min，收集上层清液，即提取液，在55℃减压回收石油醚，回收的石油醚再次用于提取，直至最终所得提取液颜呈浅绿，减压回收石油醚，得石油醚浸膏；再依次采用二氯
甲烷和正丁醇按照石油醚的提取过程进行提取，分别获得二氯甲烷浸膏和正丁醇浸膏。扭果紫金龙提取物中的成分复杂，通过采用极性依次增大的有机溶剂来对有效成分实现初步分离富集。
[0090]
2)二氯甲烷提取物浸膏(3.7g)与硅胶混合装柱，以二氯甲烷-甲醇体系进行梯度洗脱，二氯甲烷-甲醇体积比＝10:1、5:1和1:1，同时采用tlc薄层谱和质谱跟踪检测，收集主要含目标组分的馏分，进行浓缩，所得浸膏进行液相谱分离。梯度v/v＝200:1，180:1，150:1，150:1，130:1，100:1，80:1，60:1，40:1，25:1，15:1，10:1，8:1，4:1，2:1，1:1，选用100～200目硅胶作为填充材料(250
×
1000mm)，每200ml洗脱剂作为一个馏分，共收集160个馏分，根据薄层谱及紫外显(254nm或365nm)合并相似馏分，回收溶剂，得到组分s1至s8，通过检测发现目标组分主要存在于s3。s3采用高效液相谱分离。
[0091]
液相谱参数：谱仪：agilent 1260-dad；
[0092]
谱柱：agilent ymc-pack ods-a s
–
5μm，12nm(250mm
×
10mm)；洗脱液为：流动相b为甲醇，流动相a为0.1％(质量百分比)三乙胺水，流速：1.5ml/min，等度洗脱：0～15min，b：77vol％，a：23vol％。s3通过液相谱分离直接可以获得高纯度4-methoxychelidonine(tr＝28.0min)。
[0093]
3)将nbuoh提取物(5.6g)通过mci柱处理，用甲醇和水连续洗脱，采用tlc薄层谱和质谱跟踪检测，收集主要含目标组分的馏分，再接着以甲醇和水为洗脱剂，经ods柱分离，再通过重结晶得到化合物-chelidonine。
[0094]
具体的，采用甲醇-水体系进行梯度洗脱，甲醇-水的体积比＝1:4、2:3、3:2、4:1和9:1，同时采用tlc薄层谱和质谱跟踪检测，收集主要含目标组分的馏分，进行浓缩，每200ml为一个馏分，共收集234个馏分，根据薄层谱(tlc)及紫外显(254nm或365nm)合并相似馏分，减压回收溶剂，共得到4个组分(3i1～3i4)。将3i4采用反向硅胶作为填充材料(50
×
300mm)，以甲醇-水体系作为洗脱剂，进行梯度洗脱(v/v＝3:1)，每100ml洗脱剂为一个馏分，共收集165个馏分，根据tlc及紫外显(254nm或365nm)合并相似馏分，减压回收溶剂，共得到9个组分(3i4o1到3i4o9)。3i4o5重结晶得到(+)-chelidonine。
[0095]
效果验证
[0096]
实验例1:
[0097]
本实验建立了硫酸铜刺激荧光转基因斑马鱼(tg:zlyz-egfp)的炎症模型，统计巨噬细胞迁移数量，进行有通式(i)的六氢苯菲啶类生物碱化合物抗炎活性筛选，观察扭果紫金龙中分离的化合物是否具有抗炎症的潜力。
[0098]
抗炎活性实验：
[0099]
活性测试方法如下：
[0100]
以受精72hpf的健康炎症细胞荧光转基因斑马鱼作为实验动物，随机分成5、10和25μm待测样品处理组、模型组、空白对照组和阳性对照组(20μm布洛芬)，每组10个胚胎，同时设置2个复孔，每个浓度重复三次。上述各组均置于28.5℃的恒温培养箱中共培养2h。再用20μm的cuso4分别处理以上各样品组和阳性对照组斑马鱼1h。处理结束后，清洗斑马鱼，随后荧光显微镜下观察炎症反应，计算炎症细胞迁移到斑马鱼测线的数量，graphpad软件统计分析各组数据。
[0101]
活性测定结果见附图8。
[0102]
生物碱中化合物2的抗炎活性最好；普罗环氧亚甲基和甲氧基的个数以及甲氧基的位置影响其活性，4位甲氧基会减弱其活性；苯菲啶类25μm时，抗炎活性大小顺序为：2》1，初步可以得出六氢苯菲啶抗炎作用较强。
[0103]
实验例2：
[0104]
本实验建立了花生四烯酸刺激野生型斑马鱼(ab)的血栓模型，统计心脏红染面积，进行有通式(i)的六氢苯菲啶类生物碱化合物抗血栓活性筛选，观察扭果紫金龙中分离的化合物是否具有抗血栓的潜力。
[0105]
抗血栓活性实验：
[0106]
活性测试方法如下：
[0107]
取72hpf的野生型斑马鱼胚胎在培养皿中，在体视显微镜下挑选发育正常的胚胎，移入24孔培养板中，每孔10条，每个浓度2个复孔。设置实验组，即溶剂对照组、模型组：加入0.4％dmso溶液，6h后，换成终浓度为80μm aa溶液；阳性对照组：加入asp溶液，使终浓度为22.5μg/ml，放入28℃培养箱中6h后，换成终浓度为80μm aa溶液；药物干预组：加入药物母液，使终浓度为5、10和50μm，放入28℃培养箱中6h后，换成终浓度为80μm aa溶液。之后，放入28℃培养箱中1.5h后。取出，在暗处，用1mg/ml的邻联茴香胺染液染10min。养鱼水洗3次，观察拍照。
[0108]
活性测定结果见附图9。
[0109]
从表1看出，阳性对照组(阿司匹林)预防血栓率为67.4％；化合物1和2抗血栓活性呈现浓度依赖性，化合物2在10μm时预防血栓率为76.5％。
[0110]
表1化合物1和2预防血栓率
[0111][0112]
实验例3：具有通式(i)的苯菲啶类生物碱化合物对多巴胺神经元的保护作用的实验
[0113]
1)斑马鱼胚胎的准备：采集卵时，首先选择性成熟斑马鱼按雌雄比例1:1，于下午5点～6点分开放入带隔板的产卵缸中；次日上午8：30抽取隔板，2h后收取受精卵，用新鲜养鱼水反复冲洗3次，移入含2mg/l亚甲基蓝的新鲜养殖水中，再置于28℃培养箱中孵化。
[0114]
2)实验分组及处理：先将受精后1dpf的转基因斑马鱼vmat:gfp、和野生型斑马鱼ab胚胎用1mg/ml的pronase e进行脱膜处理
131
，然后用新鲜养鱼水清洗3遍后放于6孔板中，每孔30条幼鱼，设立以下实验组别：5ml新鲜养鱼水处理的对照组、5ml浓度为50μm的mptp处
理组、加入5ml不同浓度(5μm、10μm、50μm)表4.2中化合物与50μm的mptp共处理组(将化合物与mptp同时加入新鲜养鱼水中，分别达到工作浓度)。转基因斑马鱼vmat:gfp用含0.03mg/ml的ptu的新鲜养鱼水配药，可以抑制黑素生成，便于观察da神经元。加药后放入28℃培养箱培养，每间隔24h换一次药。
[0115]
3)da神经元观察：4dpf时，在转基因斑马鱼vmat:gfp、的不同实验组中各随机选取8条幼鱼，分别用蔡司体视荧光显微镜观察幼鱼的da神经元情况，并拍照记录。
[0116]
4)行为学实验：5dpf时，在野生型斑马鱼ab的不同实验组中各随机选取8条幼鱼，放入48孔板中，每孔各放一条，加入1ml新鲜养鱼水，然后将48孔板放入zebrabox斑马鱼行为分析仪暗箱中15min，使幼鱼适应环境后，开始进行行为学检测。用zeblab软件采集20min内斑马鱼的运动轨迹，软件导出数据，计算出总距离。
[0117]
阳在10μm时，da神经元区域长度与对照比值为1.29，化合物，1(5μm)1(10μm)2(10μm)比值分别为1.41,1.28和1.21。其中新化合物1(5μm)的da保护作用最强。
[0118]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

技术特征：

1.化合物4-methoxychelidonine在制备保护多巴胺神经元相关药物中的应用；所述化合物4-methoxychelidonine的结构式：

技术总结

本发明提供六氢苯并菲啶类生物碱在保护多巴胺神经元中的应用，属于生物医药技术领域。本发明首次以扭果紫金龙作为原料，通过提取分离纯化获得两种高纯度六氢苯并菲啶类生物碱，经试验验证，其对对花生四烯酸致的血栓有抑制作用、硫酸铜所致的斑马鱼炎症具有抑制作用和对多巴胺神经元具有强烈的保护作用，表明该类生物碱化合物可能会是新型有效的心帕金森疾病的药物，具有良好的实际应用之价值。值。值。