一种含有大环内酯类化合物的药物组合物、其制备方法和将其使用的方法

1.本发明涉及一种含有大环内酯类化合物的药物组合物、其制备方法和将其使用的方法。

背景技术：

2.源自微生物的生理活性物质通常是抗菌、抗真菌和抗癌药物的来源，并已被开发为包括这些在内的各种疾病的新药，或成为新药开发的模板(template)。然而，许多微生物来源化合物的生理活性尚未被揭示。例如，已从海洋放线菌中分离出菌素a至c(arenicolide a-c)，但其生理活性尚未阐明(journal of organic chemistry，2007，vol.72，no.14，pp.5025-5034)。
3.结核病(tuberculosis)是一种长期存在的传染疾病，甚至在公元前7000年左右的石器时代也能到其踪迹。尽管是一种古老的疾病，但其仍然是全世界年轻人死亡的主要原因。结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)是结核病的病因，由德国细菌学家罗伯特
·
科赫(robert koch)于1882年发现。并非所有感染结核分枝杆菌的人都会患上结核病，体内感染后免疫系统减弱时才发展。与一般感染性细菌相比，结核分枝杆菌的增值速度较慢，但其特点在于，通过在巨噬细胞中存活时发生突变而对各种药物产生耐药性。因此，作为结核病的方法，一般的单一药物处方难以显示效果，从而建议长期采用多种药物联合。
4.各种化合物如、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素和卡那霉素可用作抗结核剂。然而，可引起周围神经炎，利福平可引起血小板减少，链霉素可引起平衡障碍、听力下降或周围神经病变，乙胺丁醇可引起视力障碍，吡嗪酰胺可引起高尿酸血症。这样，由于抗结核分枝杆菌剂的种类并不多，每种药物的副作用也各不相同，因此存在处方次数或剂量受到限制的问题。此外，已开发出具有抗结核活性的化合物(韩国专利公开号10-2015-0144812(2015.12.28))。
5.因此，需要选择一种具有抗结核活性且副作用少的新型抗结核剂。

技术实现要素：

6.技术问题
7.本发明提供一种用于预防或细菌感染症或其相关症状的药物组合物，其包括大环内酯类化合物、其立体异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐。
8.本发明还提供了生产所述化合物、其立体异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐的菌株和将其包括的药物组合物的制备方法。
9.本发明又提供一种用于预防或改善分枝杆菌属细菌感染症或其相关症状的保健功能食品，其包括所述化合物、其立体异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐。
10.本发明再提供一种使用所述药物组合物来预防或分枝杆菌属细菌感染症或
至c
20
烷基、取代或未取代的c1至c
20
烷氧基、取代或未取代的c2至c
20
烯基、取代或未取代的c2至c
20
炔基或其组合。r7可以为羟基或取代或未取代的c1至c
20
烷氧基。r7例如为羟基。
22.在所述化学式1中，r8可以选自氢、羟基、氨基、卤素、酮基、氰基、取代或未取代的c1至c
20
烷基、取代或未取代的c1至c
20
烷氧基、取代或未取代的c2至c
20
烯基、取代或未取代的c2至c
20
炔基或其组合。r8可以为羟基或取代或未取代的c1至c
20
烷氧基。r8可以为c1至c
20
、c1至c
15
、c1至c
10
、c1至c5或c1至c2烷氧基。r8例如为甲氧基。
23.在所述化学式1中，r9可以选自氢、羟基、氨基、卤素、酮基、氰基、取代或未取代的c1至c
20
烷基、取代或未取代的c1至c
20
烷氧基、取代或未取代的c2至c
20
烯基、取代或未取代的c2至c
20
炔基或其组合。r9可以为羟基或取代或未取代的c1至c
20
烷氧基。r9例如为羟基。
24.在所述化学式1中，r1、r3和r8中的至少一个可以为取代或未取代的c1至c
10
烷氧基。r1、r3和r8中的一个、两个或全部例如为甲氧基。
25.在化学式1中，r2、r4、r7和r9中的至少一个可以为羟基。r2、r4、r7和r9中的一个、两个、三个或全部例如为羟基。
26.在化学式1中，r5和r6中的一个或两个都可以为甲基。
27.在化学式1中，括号中所示的结构表示烷基和烯基交替重复一次或多次。所述n表示烷基和烯基交替重复的次数。所述n可以为1至20的整数。例如，所述n为1。
28.在化学式1中，x可以为含有一个或多个氧原子的取代或未取代的3元(membered)至10元杂环基。所述杂环基可以被羟基、c1至c
10
烷基、c1至c
10
烷氧基或其组合取代。所述杂环基可以为环氧乙烷(ethylene oxide)基或四氢呋喃(tetrahydrofuran)基。
29.在化学式1中，y可以为取代或未取代的c1至c
30
烷基。所述烷基可以被一个或多个羟基或c1至c
10
烷氧基取代。
30.术语“羟基(hydroxy)”是指-oh官能团(羟基)。
31.术语“氨基(amino)”是指由一个氮原子和两个氢原子组成的胺(-nh2)基团。
32.术语“卤素(halogen)”原子包括氟、溴、氯、碘等。
33.术语“酮(ketone)”是指一个羰基与两个烃基键合的官能团。
34.术语“氰基(cyano)”是指由碳原子和氮原子之间的三键组成的官能团。
35.所述“取代或未取代的”中的“取代”是指在有机化合物中的一个或多个氢原子被另一原子团取代而形成衍生物时，代替氢原子而引入，取代基是指所引入的原子团。所述取代基可以为卤素原子、羟基、硝基、氰基、氨基、脒基、乙酰氨基、肼、腙、羧基、磺酰基、氨磺酰(sulfamoyl)基、磺酸基、磷酸、c1至c5烷基、c1至c5烷氧基、c2至c5烯基、c2至c5炔基、c3至c
10
环烷基、c6至c
10
芳基、c6至c
10
杂芳基、c6至c
20
芳烷基、c6至c
20
杂芳烷基或其组合。
36.术语“烷基(alkyl)”是指完全饱和的支链或非支链(或直链或线性)烃。所述烷基可以为c1至c
20
、c1至c
15
、c1至c
10
或c1至c5烷基。所述烷基例如为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基(sec-butyl)、正戊基、异戊基、新戊基、异戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基或正庚基。
37.术语“烷氧基(alkoxy)”是指与氧原子单键键合的烷基。所述烷氧基例如为甲氧基、乙氧基或丁氧基。
38.术语“烯基(alkenyl)”是指具有一个或多个碳-碳双键的支链或非支链烃。所述c2至c
20
烯基可以为c2至c
15
、c2至c
10
或c2至c5烯基。所述烯基例如为乙烯基、烯丙基、丁烯基、异
丙烯基或异丁烯基。
39.术语“炔基(alkynyl)”是指具有一个或多个碳-碳三键的支链或非支链烃。所述c2至c
20
炔基可以为c2至c
15
、c2至c
10
或c2至c5炔基。所述炔基例如为乙炔基、丁炔基、异丁炔基或异丙炔基。
40.术语“环氧烷(alkylene oxide)”是指由一个氧原子和两个或更多个碳原子组成的环状基团。
41.术语“环烷基(cycloalkyl)”是指饱和或部分不饱和的非芳族(non-aromatic)单环、双环或三环烃基。
42.单独或组合使用的术语“芳基(aryl)”是指包括一个或多个环的芳族系统，还包括芳环稠合到一个或多个碳环的基团。所述c6至c
30
芳基可以为c6至c
15
或c6至c
10
芳基。所述芳基例如为苯基、萘基或四氢萘基。
43.术语“芳氧基(aryloxy)”是指与氧原子单键键合的芳基。
44.术语“杂芳基(heteroaryl)”是指含有一个或多个选自n、o、p和s的杂原子且其余环原子为碳的单环(monocyclic)或双环(bicyclic)有机化合物。所述杂芳基可以包括1个至5个杂原子，并且可以包括5个至10个环成员(ring member)。所述s或n可以被氧化以具有几种氧化态。
45.术语“杂环基(heterocyclic)”或“杂环”基团是指含有至少一个杂原子的环状烃。杂环基可以包括3个至30个、3个至20个、3个至10个、3个至6个或3个至5个原子(member)。除了环中的碳原子之外，杂环基还可以包括一个或多个其他杂原子。所述杂原子可以为选自硫、氮、氧和硼一种或多种组成的组中的任意一种或多种。所述杂环基例如为环氧乙烷基或四氢呋喃基。
46.由化学式1表示的化合物可以由化学式2或化学式3表示：
47.【化学式2】
[0048][0049]
【化学式3】
[0050][0051]
由化学式1表示的化合物可以由化学式4或化学式5表示：
[0052]
【化学式4】
[0053][0054]
【化学式5】
[0055][0056]
术语“立体异构体”中的“异构体(isomer)”是指分子式相同但分子中组成原子的连接方式或空间排列不同的化合物。异构体例如包括结构异构体(structural isomers)和立体异构体(stereoisomer)。所述立体异构体可以为非对映异构体(diasteromer)或对映异构体(enantiomer)。对映异构体为不重叠其镜像的异构体，例如左手和右手之间的关系，也称为旋光异构体(optical isomer)。当四个或更多个取代基在手性中心碳上相互不同时，对映异构体分为r(rectus：顺时针方向)和s(sinister：逆时针方向)。非对映异构体是指非镜像的立体异构体，根据原子的空间排列，其可分为顺式(cis)异构体和反式(trans)异构体。
[0057]
术语“溶剂合物(solvate)”是指在有机或无机溶剂中溶剂化的化合物。所述溶剂合物例如为水合物。
[0058]
术语“盐(salt)”是指化合物的无机和有机酸加成盐。所述药学上可接受的盐可以为不会对施用化合物的有机体造成严重刺激且不损害化合物的生物活性和物性的盐。所述无机酸盐可以为盐酸盐、溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐或二硫酸盐。所述有机酸盐可以为甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乳酸盐、草酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、乙二磺酸盐、三、三氟乙酸盐、苯甲酸盐、葡糖酸盐、甲磺酸盐、乙醇酸盐、琥珀酸盐、4-甲苯磺酸盐、半乳糖醛酸盐、恩波酸盐、谷氨酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐或天冬氨酸盐。所述金属盐可以为钙盐、钠盐、镁盐、锶盐或钾盐。
[0059]
所述分枝杆菌属细菌感染症可以选自结核病、汉森病和非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，ntm)感染症组成的组。所述结核可以为多药耐药性(multi drug resistance，mdr)或广泛耐药性(extensive drug resistance，xdr)结核。所述多药耐药性结核可以为即使对人体施用(isoniazid)和利福平(rifampicin)，结核分枝杆菌也不会死亡的结核。广泛耐药性结核可以为不仅对和利福平有耐药性，还同时对喹诺酮类和注射剂具有耐药性的结核。
[0060]
所述与分枝杆菌属细菌感染症相关的症状可以为咳嗽、胸痛、发热、恶寒、食欲下降、体重减少、炎症或其组合。例如，与分枝杆菌属细菌感染症相关的症状可以为由分枝杆菌属细菌引起的炎症。
[0061]
所述分枝杆菌属细菌为属于放线菌类(actinobacteria)的棒杆菌亚目(corynebacterineae)的细菌。分枝杆菌属细菌可以具有抗酸性(acid-fast)。所述分枝杆菌属细菌可以为结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria)或bcg(bacillus calmette-guerin)菌株。所述分枝杆菌属细菌选自结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)、脓肿分枝杆菌(mycobacterium abscessus)、非洲分枝杆菌(mycobacterium africanum)、田鼠分枝杆菌(mycobacterium microti)、麻风分枝杆菌(mycobacterium leprae)、卡氏分枝杆菌(mycobacterium canetti)、鸟分枝杆菌(mycobacterium avium)、堪萨斯分枝杆菌(mycobacterium kansasii)和海分枝杆菌(mycobacterium marinum)。
[0062]
术语“预防”是指通过施用组合物来抑制或延迟疾病发作的任何行为。术语“”是指通过施用组合物来改善或有益地改变疾病症状的任何行为。
[0063]
所述组合物还可以包括抗生素。所述抗生素可以为抗结核剂(antituberculous drug)。所述抗结核剂为乙胺丁醇(ethambutol)、(isoniazid)、利福平(rifampicin)、sq-109、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、链霉素(streptomycin)、卡那霉素(kanamycin)、卷曲霉素(capreomycin)、乙硫异烟胺(ethionamide)、丙硫异烟胺(prothionamide)、恩维霉素(enviomycin)、对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid)、环丝氨酸(cycloserine)、阿米卡星(amikacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、特立齐酮(terizidone)、硫磺酰胺(thionamide)、乙硫异烟胺(ethionamide)、丙硫异烟胺(protionamide)、氯法齐明(clofazimine)、利奈唑胺(linezolid)、阿莫西林(amoxicillin)、克拉维酸(clavulanate)、氨硫脲(thioacetazone)、亚胺培南(imipenem)、西司他丁(cilastatin)、克拉霉素(clarithromycin)、贝达喹啉(bedaquiline)、德拉马尼(delamanid)、利美培南(lmipenem)、西拉司丁(cilastatin)、美罗培南(meropenem)或其组合。所述由化学式1表示的化合物、其立体异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐和所述抗生素可以为用于同时或依次施用的单一或分开的组合物。
[0064]
所述药物组合物还可以包括载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂和稀释剂可以例如包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油。
[0065]
所述药物组合物可以分别按照常规方法制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等口服剂型、外用剂、栓剂或无菌注射液等剂型。当进行制剂化时，可以使用常用的填充剂、增量剂、结合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来制备。
[0066]
在所述药物组合物中，用于口服施用的固体制剂可以为片剂、丸剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂。所述固体制剂还可以包括赋形剂。赋形剂可以为例如淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)或明胶。另外，所述固体制剂还可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁或滑石粉。在所述药物组合物中，用于口服的液体制剂可以为悬浮剂、内用液剂、乳剂或糖浆剂。所述液体制剂可以包括水或液体石蜡。所述液体制剂可以包括赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂或保存剂。在所述药物组合物中，用于非口服施用的制剂可
以是为无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干剂或栓剂。非水性溶剂或悬浮剂可以包括植物性油或酯。植物性油可以例如为丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇或橄榄油。酯可以例如为油酸乙酯。栓剂的基质可以为合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温(tween)61、可可脂、月桂脂肪、或甘油明胶。
[0067]
所述药物组合物的优选剂量取决于个体的状况和体重、疾病的严重程度、药物形式、施用途径和期间，但本领域的技术人员可以适当地选择。然而，所述化合物、其异构体、衍生物、溶剂合物或药学上可接受的盐可以例如以约0.0001mg/kg至约100mg/kg或约0.001mg/kg至约100mg/kg的量每天1次至24次、每两天至一周1次至7次或每1个月至12个月1次至24次施用。在所述药物组合物中，基于所有组合物的总重量，所述化合物、其异构体、衍生物、溶剂合物或药学上可接受的盐可以以约0.0001重量％至约10重量％或约0.001重量％至约1重量％的量包括。
[0068]
施用方法可以为口服或非口服施用。施用方法例如可以为口服、经皮、皮下、直肠、静脉内、动脉内、腹腔内、肌肉内、胸骨内、局部、鼻内(intranasal)、气管内(intratracheal)或皮内途径。所述组合物可以全身或局部施用，单独施用或与其他药物活性化合物组合施用。
[0069]
本发明另一方面提供一种小单孢菌属(micromonospora sp.)gr10菌株(保藏号：kctc14124bp)，其生产由本发明一方面的化合物、其立体异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐。
[0070]
所述化合物、立体异构体、溶剂合物和药学上可接受的盐如上所述。
[0071]
所述菌株包括其变体。例如，变体可以为由自然突变或人工突变引起的变体。人工突变可以由如紫外线等物理诱变剂或如碱性化合物等化学诱变剂引起。
[0072]
所述菌株包括菌株的孢子、菌体或其培养物。
[0073]
本发明另一方面提供一种由根据本发明一方面的化学式1表示的化合物、其立体异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐或将其包括的药物组合物的制备方法，其包括：培养小单孢菌属(micromonospora sp.)gr10菌株(保藏号：kctc14124bp)；以及从所述菌株的培养物中分离由根据本发明一方面的化学式1表示的化合物、其立体异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐。
[0074]
所述化合物、立体异构体、溶剂合物、药学上可接受的盐、药物组合物和小单孢菌属gr10菌株如上所述。
[0075]
所述方法包括：培养小单孢菌属gr10菌株(保藏号：kctc14124bp)。所述培养可以是指在液体培养基或固体培养基中培养菌株。培养基可以包括例如葡萄糖、淀粉糖浆、糊精、淀粉、糖蜜、动物油或植物油作为碳源。培养基可以包括例如麸皮、豆粕、小麦、麦芽、棉籽粕、鱼粉、玉米淀粉、肉汤、酵母提取物、硫酸铵、硝酸钠或尿素作为氮源。
[0076]
培养物可以是指在有氧条件下摇动或静置培养。培养温度可以例如为约20℃至约40℃、约25℃至约37℃、约28℃至约35℃或约30℃。培养时间可以例如为约1天至约4个月、约1天至约2个月、约1天至约6周、约1天至约1个月、约1天至约2周或约1天至约1周。
[0077]
所述方法包括：从培养物中分离由化学式1表示的化合物、其立体异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐。
[0078]
所述分离可以包括：对培养液进行浓缩、离心、过滤或谱。例如，根据固定相的形
式，谱可以为柱谱、平面谱(planar chromatography)、纸谱或薄层谱。例如，根据流动相的物理性质，谱可以为气相谱、液相谱或亲和谱。例如，液相谱可以为高效液相谱(hplc)。例如，根据分离方法，谱可以为离子交换谱、尺寸排阻谱。例如，谱可以为正相谱或反相谱。
[0079]
本发明另一方面提供一种用于预防或改善分枝杆菌属细菌感染症或其相关症状的保健功能食品，其包括由本发明一方面的化合物、其立体异构体、溶剂合物或盐。
[0080]
所述化合物、立体异构体、溶剂化物、盐、分枝杆菌属细菌感染症或其相关症状和预防如上所述。
[0081]
术语“改善”包括使疾病症状好转或受益的任何行为。
[0082]
所述保健功能食品可以将由化学式1表示的化合物、其立体异构体、溶剂合物或盐制成胶囊、粉末或悬浮液等的形式，以作为功能食品使用或添加到各种食品中。例如，所述食品包括肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、饼干、比萨饼、拉面、其他面条、口香糖、包括冰淇淋在内的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮剂、酒精饮料、维生素复合剂、功能性食品和保健食品。
[0083]
本发明另一方面提供一种用于预防或分枝杆菌属细菌感染症或其相关症状的方法，其包括：将根据本发明一方面的药物组合物施用于个体。
[0084]
所述药物组合物、分枝杆菌属细菌感染症或其相关症状、预防和同如上所述。
[0085]
所述个体可以为哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、牛、马、猪、狗、猴、绵羊、山羊或猫。所述个体可能患有或很可能患有分枝杆菌属细菌感染症或其相关症状。
[0086]
所述方法还可以包括向所述个体施用抗生素。所述抗生素可以与由化学式1表示的化合物、其立体异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐同时、分别或依次施用于所述个体。
[0087]
施用方法可以为口服或非口服施用。施用方法例如可以为口服、经皮、皮下、直肠、静脉内、动脉内、腹腔内、肌肉内、胸骨内、局部、鼻内(intranasal)、气管内(intratracheal)或皮内途径。所述药物组合物可以全身或局部施用，单独施用或与其他药物活性化合物组合施用。
[0088]
所述药物组合物的优选剂量取决于患者的状况和体重、疾病的严重程度、药物形式、施用途径和期间，但本领域的技术人员可以适当地选择。例如，基于成人，所述剂量的范围可以为约0.001mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.1mg/kg至约1mg/kg。所述施用可以在每天一次、每天多次、每周多次、每周一次、每两周一次、每三周一次、或每四周一次至每年一次。
[0089]
有益效果
[0090]
根据一种含有大环内酯类化合物即菌素的药物组合物或保健功能食品、制备方法和将其使用的方法，可用于预防或分枝杆菌属细菌感染症或与其相关症状，例如结核病、汉森病和非结核分枝杆菌感染症。
[0091]
附图简单说明
[0092]
图1为培养小单孢菌属(micromonospora sp.)gr10菌株的培养基照片。
[0093]
图2a为确认菌素a的结核分枝杆菌去除活性的方法的示意图，图2b为在施用菌素a时肺组织中结核分枝杆菌的活菌数量的曲线(cfu：colony forming unit)，图2c
为针对菌素a的结核菌株的剂量反应曲线(rfu：relative fluorescence unit)。
[0094]
图3为在施用菌素a或菌素c时肺组织中bcg菌株的活菌数量的曲线(cfu：colony forming unit)。
[0095]
图4为在施用菌素a时肺组织中脓肿分枝杆菌(m.abscessus)菌株的活菌数量的曲线(cfu：colony forming unit)。
[0096]
图5a为根据菌素a和乙胺丁醇的浓度抑制结核分枝杆菌生长的荧光图像，图5b为在含有菌素a和乙胺丁醇的固体培养基中培养的结核分枝杆菌的图像。
具体实施方式
[0097]
下面将参考实施例更详细地描述。然而，这些实施例仅是为了示例性地描述本发明，而本发明的范围不限于这些实施例。
[0098]
实施例1、菌素的分离和结构的确认
[0099]
1-1、菌素生产菌株的分离
[0100]
从k固体培养基(每1l蒸馏水25g淀粉、2g酵母提取物、15g大豆蛋白(soytone)、4g caco3和20g琼脂)中分离出菌素生产菌株即g r10菌株(图1)。
[0101]
分离gr10菌株的全基因组(whole genome)，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)克隆16s核糖体dna，并分析核酸序列(seq id no：1)。根据16s rdna测序结果，该菌株被鉴定为小单孢菌属。该菌株被命名为小单孢菌属(micromonospora sp.)gr10菌株，所述菌株于2020年1月31日保藏在韩国生命工学研究院(保藏号：kctc14124bp)。
[0102]
1-2、小单孢菌属gr10菌株的培养
[0103]
将小单孢菌属gr10菌株涂布在无菌yeme固体培养基(每1l蒸馏水4g酵母提取物、10g麦芽提取物、4g葡萄糖和20g琼脂)上并在约30℃培养约4周。
[0104]
将所培养的gr10菌株的孢子接种到150ml体积的改良k液体培养基中(每1l蒸馏水2g酵母提取物、5g麦芽提取物、5g大豆蛋白、5g淀粉、2g淀粉、5g甘露醇、6g甘油)，在30℃的温度下以200rpm摇动培养约7天。将5ml培养基接种到200ml体积的改良k液体培养基中，在170rpm、30℃的条件下培养约4天。随后，将10ml培养基接种到1l体积的改良k液体培养基中，在170rpm、30℃的条件下培养约7天。
[0105]
1-3、菌素的分离和纯化
[0106]
获得实施例1-2中培养的gr10菌株的培养物。
[0107]
将1l培养的gr10菌株培养液和约1l体积的乙酸乙酯(etoac，大井化金株式会社)放入安装在支架上的分液漏斗中，然后盖上塞子并上下左右摇动1分钟进行一次提取。然后，再次将其置于支架上，待水层和etoac层完全分离后，打开分液漏斗的阀门以除去水层。向水层中加入新鲜的etoac，以相同的方式进行重复提取。将etoac层分别保存在干净的烧瓶中，加入无水硫酸钠(anhydrous sodium sulfate)(大井化金株式会社)以除去培养物中残留的水。将已除去水分的etoac层再次转移到3l体积圆烧瓶中，然后使用减压干燥器在减压下干燥。总共培养了50l的菌株，作为提取的结果，可以获得约10g的粗(crude)提取物。
[0108]
为了从gr10菌株提取物中纯化菌素，采用了高效液相谱(high-performance liquid chromatography，hplc)。将提取物溶解在足量的甲醇(methanol，
meoh)中，使用注射器过滤器(advantec，25hp045an)除去固体杂质，然后通过制备型(preparative)hplc进行纯化过程。为了纯化材料，使用了反相柱(c
18
(2)luna 10μm 250
×
21.2mm)，并使用30％(v/v)至70％(v/v)乙腈(acetonitrile，acn)/水溶液的浓度梯度(流速：10ml/min，检测：uv 230nm)条件。
[0109]
在这些条件下，通过lc/ms分析证实，在hplc进料约32分钟后，纯的菌素a被溶出。经反复实验，从10g提取物中得到250mg菌素a和50mg菌素c。
[0110]
1-4、菌素的理化特性分析
[0111]
(1)菌素a的化学结构的确认
[0112]
根据1d和2d核磁共振谱(nuclear magnetic resonance，nmr)光谱确认了菌素a的结构。使用了bruker公司的500mhz nmr的核磁共振谱(1h nmr、
13
c nmr)，并使用了dmso-d6的溶剂。
[0113]
核磁共振谱对菌素a的结构定位见表1。
[0114]
【菌素a(arenicolide a)】
[0115]
(1)分子式：c
45h72o12
[0116]
(2)分子量：804
[0117]
(3)颜：透明
[0118]
(4)1h-nmr(dmso-d6，600mhz)：参见表1
[0119]
(5)
13
c-nmr(dmso-d6，150mhz)：参见表1
[0120]
【表1】
[0121]
[0122][0123][0124]
(2)菌素的a的立体结构的确认
[0125]
大多数菌素a的三维立体结构在首次报道菌素的论文中得到了揭示
(williams et al.，j.org.chem.2007，vol.72，no.14，pp.5025-5034)。为了阐明尚未揭示的39位碳的立体结构，使用了一种新的计算方法即dp4分析法。
[0126]
首先，由于dp4分析法的显著性随着分子量的降低而增加，因此排除了判断为对物质的化学位移没有显着影响的链部分，仅对大环结构部分使用avogadro 1.2.0.程序，通过能量最小化对具有39r和39s结构的分子模型进行建模。并且，从使用maestro程序通过两个模型中每一个的稳定化学形式搜索的许多化学形式中，仅选择在能量方面具有10kj/mol的稳定能量的形式。通过根据每种选定形式的相对能量计算波尔兹曼种数来计算每种化学形式的比重。结果，确定了39r模型的8个化学形式和39s的36个化学形式。使用每种化学形式模型，利用turbomole x 4.3.2.程序优化基态的几何结构，然后可以通过计算所优化的结构模型来导出每种化学形式的化学位移值。通过根据波尔兹曼种数对其进行加权，计算出平均化学位移值。当将实际实验揭示的化学位移值与39r模型和39s模型各自计算的化学位移值进行比较时，由于碳化学位移值为96.7％，氢化学位移值为100.0％，而碳值和氢值加起来为100.0％，因此可以确认39位碳的立体结构为s。
[0127]
从核磁共振谱数据和立体结构分析结果中分析出的菌素a的化学结构式如下所示。
[0128]
【菌素a】
[0129][0130]
另一方面，菌素c的化学结构式如下所示。
[0131]
【菌素c】
[0132][0133]
实施例2、菌素的抗分枝杆菌活性的确认
[0134]
2-1、菌素的抗结核分枝杆菌活性的确认
[0135]
为了研究菌素a的抗结核活性，准备了c57bl/6小鼠(n＝16)。小鼠用结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis：mtb)2
×
104/cfu进行鼻腔感染，将小鼠随机分为两组(每组，n＝8)。从第4天开始，以100mg/体重kg的剂量口服施用菌素a 6天。施用pbs作为阴性对照组。从感染日起第10天处死小鼠(图2a)。研究了肺组织中结核分枝杆菌的活菌数量，结果如图2b所示(***：p《0.001)。
[0136]
如图2b所示，与阴性对照组相比，口服菌素a组的肺组织中结核分枝杆菌的活菌数量显着减少。因此，证实了菌素a在小鼠结核感染模型中显示出作为候选物的
功效。
[0137]
为了了解菌素a的最小抑制浓度(minimal inhibitory concemtration，mic)，使用结核分枝杆菌(m.tuberculosis)mc2 6230菌株计算了剂量反应曲线(dose-response curve，drc)。使用刃天青微量滴定法(resazurin microtiter assay，rema)测量mic。简而言之，96孔微量滴定板的每孔加入100μl的7h9液体培养基，每孔直接加入两倍连续稀释的抗生素。将板盖上并在37℃下培养5天。每孔加入刃天青(resazurin，0.01％(w/v))，并再次将板培养过夜。使用spectramax m3多模式酶标仪(molecular devices，美国加利福尼亚)测量荧光强度(ex.560/em.590nm)。使用prism 6(graphpad software，inc.，加利福尼亚州拉霍亚)计算mic值，结果如图2c所示。如图2c所示，菌素a的mic
50
值约为24.6μm。
[0138]
另一方面，使用相同方法测定了结核分枝杆菌mtb h37rv菌株(标准菌株)的抗结核分枝杆菌活性，结果，菌素a的mic
50
值约为6.9μm。
[0139]
因此，确认了结核分枝杆菌a具有抗结核分枝杆菌活性。
[0140]
2-2、菌素的抗bcg活性的确认
[0141]
确认了菌素化合物是否对bcg(bacillus calmette-guerin)菌株，即牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)具有有效的抑制活性。
[0142]
如实施例2-1所述，57bl/6小鼠用1
×
106/cfu的bcg菌株进行鼻腔感染。从第4天开始，以100mg/体重kg的剂量口服施用菌素a或菌素c 6天。作为阴性对照组，施用了2.5％(v/v)dmso和2.5％(v/v)乙醇。从感染日起第10天处死小鼠。调查了肺组织中结核分枝杆菌的活菌数量，其结果如图3所示(每组，n＝6，**：p《0.01，***：p《0.001)。
[0143]
如图3所示，与阴性对照组相比，确认了菌素a和菌素c对bcg菌具有有效的抑制活性。
[0144]
2-3、菌素的抗非结核分枝杆菌活性的确认
[0145]
确认了菌素化合物是否也对非典型非结核分枝杆菌即脓肿分枝杆菌(mycobacterium abscessus)具有有效的抑制活性。
[0146]
如实施例2-2所述，57bl/6小鼠用1
×
107/cfu的脓肿分枝杆菌(m.abscessus)菌株进行鼻腔感染。从第3天开始，以100mg/体重kg的剂量口服施用菌素a 5天。作为阴性对照组，施用了2.5％(v/v)dmso和2.5％(v/v)乙醇。从感染日起第7天处死小鼠。调查了肺组织中结核分枝杆菌的活菌数量，其结果如图4所示(每组，n＝6，***：p《0.001)。
[0147]
如图4所示，与阴性对照组相比，口服菌素a组的肺组织中活菌数量显着减少。证实了菌素a在小鼠非结核抗酸菌感染模型中具有作为候选物的功效。
[0148]
2-4、评价联合施用菌素和抗结核剂的有效性
[0149]
当菌素与抗结核剂组合时，确认了联合施用的效果。
[0150]
具体而言，将结核分枝杆菌(m.tuberculosis)在添加了adc的middlebrook 7h9培养基中于37℃培养。将100μl培养基等分试样添加到96孔微量滴定板的每个孔中，并将2倍连续稀释的菌素a或乙胺丁醇(ethambutol)直接添加到每个孔中。然后将板在37℃培养5天。将刃天青(resazurin，0.025％(w/v))添加到每个孔中，并使用m3多模式酶标仪(molecular devices，美国加利福尼亚)测量荧光强度(ex/em 560/590nm)。使用prism 6(graphpad software，inc.，加利福尼亚州拉霍亚)计算mic值。根据菌素和乙
胺丁醇浓度的荧光强度如图5a所示。
[0151]
另一方面，结核分枝杆菌在固体培养基中培养，所述固体培养基含有以各自的mic结合的菌素和乙胺丁醇。为了读取细菌的存活率，将结核分枝杆菌接种到固体培养基中(加入7h10)，在37℃培养3周后测量细菌的生长情况。培养的细菌的图像如图5b所示。
[0152]
如图5a和5b所示，证实了菌素a和乙胺丁醇的组合对结核分枝杆菌具有协同作用。尤其，确认了在1.6μm乙胺丁醇和0.048μm菌素a的组合和0.8μm乙胺丁醇和0.19μm菌素a的组合中没有形成结核分枝杆菌菌落。由此证实，当施用微量的菌素a时，联合施用的乙胺丁醇的mic值可降低至约1/4。此外，与阳性对照药物乙胺丁醇(mic＝3.2μm)相比，证实了菌素a单独施用时具有更好的功效。
[0153]
《保藏号》
[0154]
保藏机构名称：韩国生命工学研究院
[0155]
保藏号：kctc14124bp
[0156]
保藏日：20200131
[0157]

技术特征：

1.一种用于预防或分枝杆菌属细菌感染症或其相关症状的药物组合物，其包括由化学式1表示的化合物、其立体异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐：【化学式1】在所述化学式1中，r1、r2、r3、r4、r7、r8和r9各自独立地选自氢、羟基、氨基、卤素、酮基、氰基、取代或未取代的c1至c
20
烷基、取代或未取代的c1至c
20
烷氧基、取代或未取代的c2至c
20
烯基、取代或未取代的c2至c
20
炔基或其组合，r5和r6各自独立地选自氢、羟基、氨基、卤素、氰基、-c(＝o)r
a
、-c(＝o)or
a
、-oco(or
a
)、-c＝n(r
a
)、-sr
a
、-s(＝o)r
a
、-s(＝o)2r
a
、-pr
a
、取代或未取代的c1至c
20
烷基、取代或未取代的c1至c
20
烷氧基、取代或未取代的c2至c
20
烯基、取代或未取代的c2至c
20
炔基、c2至c
20
烯化氧基、取代或未取代的c3至c
30
环烷基、取代或未取代的c6至c
30
芳基、取代或未取代的c6至c
30
芳氧基、取代或未取代的c6至c
30
杂芳基或其组合，其中r
a
为氢、c1至c
10
烷基或c6至c
20
芳基，n为1至20的整数，x为含有一个或多个o的取代或未取代的3元至10元杂环基，取代的杂环基为被羟基、c1至c
10
烷基、c1至c
10
烷氧基或其组合取代的，y为取代或未取代的c1至c
30
烷基，取代的烷基为被一个或多个羟基或c1至c
10
烷氧基取代的。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，r1、r3和r8中的至少一个为取代或未取代的c1至c
10
烷氧基。3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中，r1、r3和r8中的至少一个为甲氧基。4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，r2、r4、r7和r9中的至少一个为羟基。5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，r5和r6中的至少一个为甲基。6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，x中的杂环基为环氧乙烷基或四氢呋喃基。7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述由化学式1表示的化合物为由化学式2或化学式3表示的：【化学式2】和；
【化学式3】8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述由化学式1表示的化合物为由化学式4或化学式5表示的：【化学式4】和；【化学式5】9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述分枝杆菌属细菌感染症选自由结核病、汉森病和非结核分枝杆菌感染症组成的组。10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述分枝杆菌属细菌选自结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和bcg菌株组成的组。11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述分枝杆菌属细菌选自由结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、麻风分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和海分枝杆菌组成的组。12.根据权利要求1所述的药物组合物，其进一步包括抗生素。13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中，所述抗生素为抗结核剂。14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中，所述抗结核剂为乙胺丁醇、、利福平、sq-109、吡嗪酰胺、链霉素、卡那霉素、卷曲霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、恩维霉素、对氨基水杨酸、环丝氨酸、阿米卡星、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星、氧氟沙星、特立齐酮、硫磺酰胺、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、氯法齐明、利奈唑胺、阿莫西林、克拉维酸、氨硫脲、亚胺培南、西司他丁、克拉霉素、贝达喹啉、德拉马尼、利美培南、西拉司丁、美罗培南或其组合。
15.一种小单孢菌属gr10菌株(保藏号：kctc14124bp)，其生产由权利要求1所述的化学式1表示的化合物、其立体异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐。16.一种由权利要求1所述的化学式1表示的化合物、其立体异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐或将其包括的药物组合物的制备方法，其包括：培养小单孢菌属gr10菌株(保藏号：kctc14124bp)；以及从所述菌株的培养物中分离由权利要求1所述的化学式1表示的化合物、其立体异构体、溶剂合物或药学上可接受的盐。17.一种用于预防或改善分枝杆菌属细菌感染症或其相关症状的保健功能食品，其包括由权利要求1所述的化学式1表示的化合物、其立体异构体、溶剂合物或盐。18.一种用于预防或分枝杆菌属细菌感染症或其相关症状的方法，其包括：将权利要求1所述的药物组合物施用于个体。19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述方法还包括向所述个体施用抗生素。

技术总结

根据一种含有大环内酯类化合物的药物组合物或保健功能食品、制备方法和将其使用的方法，可用于预防或分枝杆菌属细菌感染症或与其相关症状，例如结核病、汉森病和非结核分枝杆菌感染症。枝杆菌感染症。枝杆菌感染症。

技术研发人员：

吴东灿 黄圣勋 申宗宪 曹垠京 张知赞

受保护的技术使用者：

庆尚国立大学校产学协力团 忠南大学校产学协力团

技术研发日：

2020.09.29

技术公布日：

2022/12/30