一种用于生产纳他霉素的发酵培养基的制作方法

1.本发明属于发酵培养的技术领域，涉及到发酵培养基的配制，具体涉及一种用于生产纳他霉素的发酵培养基。

背景技术：

2.纳他霉素(natamycin)是一种由褐黄孢链霉菌发酵产生的天然抗真菌化合物，属于多烯大环内酯类，既可以广泛有效的抑制各种霉菌、酵母菌的生长，又能抑制真菌毒素的产生。作用原理为依靠其内酯环结构与真菌细胞膜上的甾醇化合物作用，形成抗生素—甾醇化合物，从而破坏真菌的细胞质膜的结构。大环内脂的亲水部分(多醇部分)在膜上形成水孔，损伤细胞膜通透性，进而引起菌内氨基酸，电解质等物质渗出，菌体死亡。1982年6月，美国fda正式批准纳他霉素可以用作食品防腐剂。1996年，中国食品添加剂标准化学技术委员会正式批准纳他霉素可作为食品防腐剂，可广泛用于食品防腐保鲜以及抗真菌。但纳他霉素生产存在产量低，发酵配方复杂的问题。中国专利cn109943610a公开一种添加饱和脂肪酸的方法，但饱和脂肪酸大多不溶于水，微生物利用率低，而且过多饱和脂肪酸会影响发酵液流体特性，使物质传递更加困难，通过发酵罐培养120h得到的纳他霉素含量仅为7.5g/l。中国专利cn106755216 a公开了一种通过发酵过程中流加缬氨酸及苏氨酸，同时添加豆油，工艺复杂，而最终纳他霉素含量仅为4g/l左右。

技术实现要素：

3.本发明为解决上述提到的问题，提供一种能提高纳他霉素含量的高效、简单、低成本的纳他霉素发酵培养基。
4.为实现其目的发明人提出的技术方案是：一种用于生产纳他霉素的发酵培养基，所述发酵培养基中含有苏氨酸、生物素和谷氨酸。
5.进一步的技术方案在于，所述苏氨酸的含量为0.1-0.3g/l，生物素的含量为0.1g/l，谷氨酸的含量为0.2-0.4g/l。
6.进一步的技术方案在于，所述发酵培养基的成分还含有：玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、α-淀粉酶。
7.进一步的技术方案在于，所述发酵培养基的成分与含量为：玉米淀粉60g/l、蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、磷酸二氢钾0.2g/l、α-淀粉酶(淀粉加量g*0.001)、苏氨酸0.1-0.3/l、生物素0.1g/l、谷氨酸0.2-0.4g/l。
8.进一步的技术方案在于，所述发酵培养基的成分与含量为：玉米淀粉60g/l、蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、磷酸二氢钾0.2g/l、α-淀粉酶(淀粉加量g*0.001)、苏氨酸0.2/l、生物素0.1g/l、谷氨酸0.3g/l。
9.采用上述技术方案得到有益效果为：本发明根据纳他霉素的生物合成途径，结合褐黄孢链霉菌中与纳他霉素生物合成相关的代谢调节机理，创造性的提出了在发酵培养基中添加苏氨酸、生物素和谷氨酸，通过三者共同调节作用，实现纳他霉素合成前体物质的积
累，从而提高纳他霉素发酵水平。该方法大幅度提高了纳他霉素发酵水平，120h发酵摇瓶含量最高达到12.312g/l，相比对照提高129.73％。进一步降低了纳他霉素生产成本，有利于促进纳他霉素作为安全的生物防腐剂的推广和应用。
10.苏氨酸、生物素和谷氨酸联合作用提高纳他霉素含量的原理可通过三点进行说明：一是苏氨酸在经去氨基化形成α-酮基丁酸，α-酮基丁酸在丙酮酸脱氢酶复合体地催化下形成丙酰辅酶a。二是生物素是羧基转移酶和羧化酶的重要辅酶，而羧基转移酶可以将乙酰辅酶a转化为丙酰辅酶a，通过苏氨酸和生物素的联合作用能使丙酰辅酶a浓度大幅度提升。三是谷氨酸在生物体内通过脱氨作用转化为α-酮基丁酸，α-酮基戊二酸会抑制三羧酸循环对乙酰辅酶a的吸收利用，使其浓度升高，同时在辅酶——生物素的辅助作用下，羧基转移酶将乙酰辅酶a转化为丙酰辅酶a，为纳他霉素的合成提供前体，使其含量增加。苏氨酸、生物素和谷氨酸任何一种成分过量使用都会对菌体的正常代谢生长产生影响，因此为提高纳他霉素的前体——丙酰辅酶a的含量，需要三者叠加使用，通过不同方式提高丙酰辅酶a的含量，进而促进纳他霉素的合成。
具体实施方式
11.本发明为解决现有技术中纳他霉素发酵含量低的问题，提供了一种可大幅提高纳他霉素含量的发酵培养基，下面结合具体实例对本发明进行详细描述。
12.由于斜面、种液培养基与培养条件都采用业内公开的技术，下面所诉对比例和实例中斜面、种液培养均采用统一的培养条件，具体培养方法为：取本技术人保存的褐黄孢链霉甘油管一支，菌接种斜面培养基，斜面成熟后挖取部分菌落和斜面培养基共同接入种子培养基，种液成熟后取部分种液接种发酵培养基，发酵培养温度30℃，转速220rpm，培养120h。
13.对比例1
14.发酵培养基分别按玉米淀粉60g/l、蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、磷酸二氢钾0.2g/l、α-淀粉酶0.001g/g玉米淀粉的比例称取适量的原材料，加入适量水溶解后，定容至250ml，平均分装于5个500ml的三角瓶中(50ml/瓶)，121℃灭菌30min后，冷却至室温。将成熟的种液以6％(v/v)的接种量接入无菌发酵培养基，培养温度30℃，转速220rpm，培养120h后检测发酵瓶中纳他霉素含量。
15.实施例1
16.与对比例1的不同之处在于，发酵培养基中除按相同比例添加玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、α-淀粉酶外，额外添加0.1g/l的苏氨酸。
17.实施例2
18.与对比例1的不同之处在于，发酵培养基中除按相同比例添加玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、a-淀粉酶外，额外添加0.1g/l的生物素。
19.实施例3
20.与对比例1的不同之处在于，发酵培养基中除按相同比例添加玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、a-淀粉酶外，额外添加0.2g/l的谷氨酸。
21.实施例4
22.与对比例1的不同之处在于，发酵培养基中除按相同比例添加玉米淀粉、蛋白胨、
酵母粉、磷酸二氢钾、a-淀粉酶外，额外添加0.1g/l的苏氨酸和0.1g/l的生物素。
23.实施例5
24.与对比例1的不同之处在于，发酵培养基中除按相同比例添加玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、a-淀粉酶外，额外添加0.1g/l的苏氨酸和0.2g/l的谷氨酸。
25.实施例6
26.与对比例1的不同之处在于，发酵培养基中除按相同比例添加玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、a-淀粉酶外，额外添加0.1g/l的生物素和0.2g/l的谷氨酸。
27.实施例7
28.与对比例1的不同之处在于，发酵培养基中除按相同比例添加玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、a-淀粉酶外，额外添加0.1g/l的苏氨酸、0.1g/l的生物素、0.2g/l的谷氨酸。
29.实施例8
30.与对比例1的不同之处在于，发酵培养基中除按相同比例添加玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、a-淀粉酶外，额外添加0.2g/l的苏氨酸、0.1g/l的生物素、0.3g/l的谷氨酸。
31.实施例9
32.与对比例1的不同之处在于，发酵培养基中除按相同比例添加玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、a-淀粉酶外，额外添加0.3g/l的苏氨酸、0.1g/l的生物素、0.4g/l的谷氨酸。
33.实施例10
34.与对比例1的不同之处在于，发酵培养基中除按相同比例添加玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、a-淀粉酶外，额外添加0.4g/l的苏氨酸、0.1g/l的生物素、0.3g/l的谷氨酸。
35.实施例11
36.与对比例1的不同之处在于，发酵培养基中除按相同比例添加玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、a-淀粉酶外，额外添加0.2g/l的苏氨酸、0.2g/l的生物素、0.3g/l的谷氨酸。
37.实施例12
38.与对比例1的不同之处在于，发酵培养基中除按相同比例添加玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、a-淀粉酶外，额外添加0.2g/l的苏氨酸、0.1g/l的生物素、0.5g/l的谷氨酸。
39.对比例1和实施例1-12得到的纳他霉素含量结果见表1。
40.表1不同实施例得到的纳他霉素含量
[0041][0042]
对比例培养基是现有技术发酵培养基，实施例7、8、9为本发明的发酵培养基，上述实施例1-12及对比例1的结果(表1)可以明显看出，利用本发明的发酵培养基得到的纳他霉素发酵含量要比现有技术发酵培养基高出129.73％。若继续提高苏氨酸、生物素、谷氨酸中的任何一个成分含量，都会造成纳他霉素含量的降低，主要是由于三者对菌体内代谢具有一定的协同作用，含量过高会造成菌体内代谢紊乱，含量偏低达不到提高纳他霉素合成速率的效果。
[0043]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种用于生产纳他霉素的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基中含有苏氨酸、生物素和谷氨酸。2.根据权利要求1所述的一种用于生产纳他霉素的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基中苏氨酸的含量为0.1-0.3g/l、生物素的含量为0.1g/l、谷氨酸的含量为0.2-0.4g/l。3.根据权利要求1或2所述的一种用于生产纳他霉素的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基的成分还含有：玉米淀粉、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾和α-淀粉酶。4.根据权利要求3所述的一种用于生产纳他霉素的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基的成分与含量为：玉米淀粉60g/l、蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、α-淀粉酶(淀粉加量g*0.001)、磷酸二氢钾0.2g/l、苏氨酸0.1-0.3/l、生物素0.1g/l、谷氨酸0.2-0.4g/l。5.根据权利要求4所述一种用于生产纳他霉素的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基的成分与含量为：玉米淀粉60g/l、蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、磷酸二氢钾0.2g/l、α-淀粉酶(淀粉加量g*0.001)、苏氨酸0.2g/l、生物素0.1g/l、谷氨酸0.3g/l。

技术总结

本发明公开了一种用于生产纳他霉素的发酵培养基，涉及微生物发酵领域。所述发酵培养基中除含有碳源、氮源和磷源外，添加了苏氨酸和生物素，通过苏氨酸和生物素的联合作用提高纳他霉素前体丙酰辅酶A的含量，同时添加谷氨酸来阻遏三羧酸循环中对乙酰辅酶A的利用，增加纳他霉素前体乙酰辅酶A的含量促进纳他霉素的合成。本发明是在生产纳他霉素发酵培养基中首次利用苏氨酸和生物素的联合作用提高纳他霉素前体丙酰辅酶A的含量同时添加谷氨酸来阻遏三羧酸循环中对乙酰辅酶A的利用，增加纳他霉素前体乙酰辅酶A的含量，共同提高纳他霉素合成代谢流，从而提高发酵含量。从而提高发酵含量。