包含明串珠菌属菌株作为有效成分的癌症的预防或用药物组合物的制作方法

1.本发明涉及一种从泡菜中分离的明串珠菌属(leuconostoc)菌株，具体地，涉及包含肠膜明串珠菌lb-lm1(leuconostoc mesenteroides lb-lm1)菌株或其培养物作为有效成分的癌症的预防或用组合物。

背景技术：

2.癌症在世界范围内的死亡率很高，在西方社会是仅次于心血管疾病的最常见死因。尤其，由于饮食西方化，高脂肪食物的摄取变得普遍，加之环境污染物质急剧增加、饮酒量增加等原因，大肠癌、乳房癌、前列腺癌等不断增加，由于人口老龄化、吸烟人口增加以及空气污染而导致肺癌增加。在这种情况下，迫切需要创造出有助于促进人类健康、提高健康生活质量以及促进人类保健的可以早期预防以及癌症的抗癌物质。
3.另一方面，乳酸菌广泛分布在人类及动物的口腔、肠道、阴道、粪便以及泡菜等发酵食品中，并与人及动物的健康息息相关。乳酸菌具有肠道调节、抑制有害菌、免疫调节、降低血液胆固醇、抗癌等各种促进健康的效果。
4.目前，在韩国公开专利第10-2010-0013184号中公开了肠膜明串珠菌菌株的抗癌活性，但仅记载了对大肠癌的预防或效果的具体实施例，并未记载除此之外的其它癌症的具体实验例或实施例。

技术实现要素：

5.技术问题
6.本发明的目的在于，提供一种包含明串珠菌属菌株作为有效成分的癌症的预防或用药物组合物。
7.并且，本发明的另一目的在于，提供一种包含明串珠菌属菌株作为有效成分的癌症的预防或改善用食品组合物或食品添加剂组合物。
8.并且，本发明的又一目的在于，提供一种包含明串珠菌属菌株作为有效成分的癌症的预防或改善用饲料组合物或饲料添加剂组合物。
9.技术方案
10.为此，本发明人努力试图从泡菜中寻具有癌症的预防以及效果的乳酸菌菌株，最终通过分离并鉴别对多种癌症具有抗癌活性的新型明串珠菌属(leuconostoc)菌株来完成了本发明。
11.为了实现上述目的，提供一种包含明串珠菌属菌株或其培养物作为有效成分的癌症的预防或用药物组合物。
12.并且，本发明提供一种包含明串珠菌属菌株或其培养物作为有效成分的癌症的预防或改善用食品组合物或食品添加剂组合物。
13.并且，本发明提供一种包含明串珠菌属菌株或其培养物作为有效成分的家畜的癌
症预防或改善用饲料组合物或饲料添加剂组合物。
14.发明的效果
15.本发明的明串珠菌属菌株或其培养物对各种癌症呈现出优秀的抗癌活性，因此可以有效地用作人类或动物的癌症、预防或改善等用途的组合物。
附图说明
16.图1为示出将本发明的组合物向大肠癌ct26细胞移植小鼠静脉注射1次后，观察随着时间经过而变化的肿瘤大小的肿瘤的照片的图。
17.图2为示出将本发明的组合物向大肠癌ct26细胞移植小鼠静脉注射1次后，随着时间经过测定肿瘤生长率的图表的图。
18.图3为示出在大肠癌ct26、sw620以及hct116细胞株处理本发明的组合物并测定细胞生长率(cell viability assay)的图表的图。
19.图4为示出在胰腺癌aspc-1细胞株处理本发明的组合物并测定细胞生长率(cell viability assay)的图表的图。
20.图5为示出在膀胱癌t24细胞株处理本发明的组合物并测定细胞生长率(cell viability assay)的图表的图。
21.图6为示出在黑素瘤b16-f10细胞株处理本发明的组合物并测定细胞生长率(cell viability assay)的图表的图。
22.图7为示出在正常ccd986-sk细胞株处理本发明的组合物并测定细胞生长率(cell viability assay)的图表的图。
23.图8为示出在大肠癌mc38细胞株处理本发明的组合物并拍摄在细胞转移(转移实验，migration assay)后的图像的照片的图。
24.图9为示出在大肠癌mc38细胞株处理本发明的组合物并测定细胞转移抑制能力的图表的图。
具体实施方式
25.以下，将通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于具体说明本发明，对于本领域普通技术人员来说，根据本发明的主旨，本发明的范围不受这些实施例的限制是显而易见的。
26.本发明的包含明串珠菌属(leuconostoc)菌株作为有效成分的组合物可具有预防或癌症的效果，并可以用做药剂学组合物。
27.本发明的明串珠菌属(leuconostoc)菌株为乳酸菌菌株。上述明串珠菌属菌株作为益生菌，具有乳酸菌的一般肠道调节效果以及免疫增强效果。众所周知，明串珠菌属的乳酸菌具有肠道调节效果以及免疫增强效果。
28.上述明串珠菌属菌株可以为肠膜明串珠菌(leuconostoc mesenteroides)、肉明串珠菌(leuconostoc carnosum)、嗜柠檬酸明串珠菌(leuconostoc citreum)、贺氏明串珠菌(leuconostoc holzapfelli)或乳明串珠菌(leuconostoc lactis)中的一种。
29.通过用于对微生物进行鉴别及分类的16s rrna碱基序列分析结果表示，通过本发明的实施例从泡菜中分离的肠膜明串珠菌菌株具有序列1(seq id no：1)的核酸序列。
30.因此，将具有序列1(seq id no：1)的16s rrna碱基序列的本发明的微生物命名为肠膜明串珠菌lb-lm1(leuconostoc mesenteroides lb-lm1)，并于2020年04月24日保藏在韩国微生物保藏中心(保藏编号：kccm12701p)。
31.可以通过在mrs液体培养基中接种0.1％至10％的上述明串珠菌属菌株并在25℃至37℃的温度下培养4小时至48小时来使用。
32.优选地，上述培养的方法为静置培养方法，但不限于此。
33.在本发明中，“益生菌(probiotics)”应理解为“在包括人类在内的动物的胃肠道内通过改善宿主肠内微生物环境来给宿主的健康带来有益的影响的活的微生物”。在以单独或复合菌株的形态将具有益生菌活性的活的微生物以干燥的细胞形态或发酵产物的形态提供时，益生菌可以给宿主的肠内菌带来有益的影响。
34.上述癌症可以为选自膀胱癌、乳腺癌、黑素瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、喉癌、喉癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、舌癌、皮肤癌、脑瘤、子宫癌、胆囊癌、口腔癌、肾癌、肝癌、肺癌、结肠癌、直肠癌和结肠癌可以是选自由癌症组成的组中的任何一种癌症，但不限于此。
35.包含于包含本发明的明串珠菌属菌株或其培养物作为有效成分的组合物可以用作用于预防或改善癌症的食品组合物或食品添加剂组合物。能够以活菌体或死菌体的方式存在，并且，还能够以干燥或冷冻干燥的形态存在。并且，明串珠菌属菌株的培养物可以为有效成分，上述培养物可以包含活菌培养液或死菌上清液。本发明所属技术领域的普通技术人员应该知道适合包含于多种组合物的乳酸菌的形态及配制方法。
36.上述组合物可以通过口服或胃肠外给药。胃肠外给药可以通过静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、经皮给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药及直肠内给药等方式给药，优选地，可以通过静脉注射的方法给药，但不限定于此。
37.上述组合物的适当给药量可以根据配制方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、疾病状态、饮食、给药时间、给药途径、代谢速度及反应敏感性之类的因素给出多种处方。
38.在将本发明的组合物用作药物组合物的情况下，除上述有效成分外，本发明的药剂学组合物可以使用药剂学上适合的、生理学上可接受的辅助剂来制备，上述辅助剂可以使用赋形剂、崩解剂、甜味剂、结合剂、包衣剂、膨胀剂、润滑剂、滑泽剂或香味剂等。
39.为了给药，除上述有效成分以外，上述药物组合物还可以通过包含一种以上的药剂学上可接受的载体来优选地配制为药物组合物。
40.例如，为了配制为片剂或胶囊剂，有效成分可以与乙醇、甘油、水等之类的口服、无毒性的药剂学上可接受的非活性载体结合。并且，可以根据需要包含适当的结合剂、润滑剂、崩解剂及发剂以及混合物。适当的结合剂包括淀粉、明胶、葡萄糖或β-乳糖之类的天然糖、玉米甜味剂、阿拉伯胶、黄芪胶或油酸钠之类的天然或合成胶、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等，但不限定于此。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等，但不限定于此。在以液体溶液的形态配制的组合物中可接受的药剂学载体可以使用灭菌及适于活体的生理盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲生理盐水、白蛋白注射溶液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇及混合一种以上这些成分来使用，可以根据需要添加抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等其他普通的添加剂。并且，还可以添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂及润滑剂来配制为水溶液、悬浮液等之类的注射用剂型、丸药、胶囊、颗粒或片剂。
41.进而，可以将remington's pharmaceutical science，mack publishing company，easton pa中公开的方法用作本发明相关技术领域的适当的方法，根据各疾病或成分来优选地配制。
42.包含本发明的明串珠菌属(leuconostoc)菌株或其培养物作为有效成分的组合物可以用作用于预防或改善癌症的食品组合物或食品添加剂组合物。
43.上述食品组合物可以以保健功能食品的形式存在。
44.上述“保健功能食品”是指根据有关保健功能食品的法律，使用具有对人体有用的功能性的原料或成分制备及加工的食品(第三条第一项)，“功能性”是指通过调节营养素或生理学作用等之类的保健用途来在人体的结构及功能中获得有用的效果(同一条的第二项)。
45.上述食品组合物还可以包括食品添加物，若无特别说明，“食品添加物”是否适当则根据韩国食品药品监督管理局认可的韩国食品添加物法典的总则及通常的试验方法等并按照与相关品种有关的规格及标准来判定。
46.收录于上述“食品添加物法典”的品种有例如酮类、甘氨酸、柠檬酸钾、烟酸、肉桂酸等化学合成品、柿子素、甘草提取物、结晶纤维素、瓜尔豆胶等天然添加物、l-谷氨酸钠制剂、面类添加碱剂、防腐剂、焦油素制剂等混合制剂类。
47.包含本发明的有效成分的食品可以为面包、糕类、干果类、糖果类、巧克力类、口香糖、果酱类之类的饼干类、冰淇淋类、冰果类、冰淇淋粉末类之类的冰淇淋制品类、牛奶类、低脂牛奶类、乳糖分解牛奶、加工乳类、山羊奶、发酵乳类、黄油乳类、浓缩乳类、奶油类、黄油类、天然奶酪、加工奶酪、奶粉类、乳清类之类的乳加工品类、肉食加工品、蛋加工品、汉堡包之类的肉食制品类、鱼饼、火腿、香肠、培根等鱼肉制品之类的鱼肉制品类、拉面类、干面类、生面类、汤面类、豪华干面类、改良熟面类、冷冻面类、意大利面类之类的面类、水果饮料、蔬菜类饮料、碳酸饮料、豆乳类、酸奶等的乳酸菌饮料、混合饮料之类的饮料、酱油、黄豆酱、辣椒酱、干黄酱、清国酱、混合酱、食醋、酱类、番茄酱、咖喱、调味汁之类的调味食品、人造黄油、起酥油以及比萨，但不限定于此。
48.除上述以外，本发明的组合物还可以包含多种营养剂、维生素、电解质、风味剂、着剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。此外，本发明的组合物还可以包含用来制备天然果汁、果汁饮料及蔬菜饮料的果肉。这些成分可单独或组合来使用。
49.包含本发明的有效成分的饮料组合物对其他成分没有特别限制，可以与普通饮料一样包含多种香味剂或天然碳水化合物等。上述天然碳水化合物的例有单糖(例如葡萄糖、果糖等)、二糖(例如麦芽糖、蔗糖等)、多糖(例如糊精、环糊精等)之类的普通的糖以及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇。除上述以外，还可以有利地将天然香味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙a、甘草酸等))以及合成香味剂(糖精、阿巴斯甜等)用作香味剂。
50.并且，包含本发明的明串珠菌属(leuconostoc)菌株或其培养物作为有效成分的组合物可以用作用于预防或改善家畜的癌症的饲料组合物或饲料添加剂组合物。
51.在将上述组合物制备为饲料添加剂的情况下，上述组合物可以制备为20％至90％的高浓缩液或粉末或颗粒形态。上述饲料添加剂还可以包含柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸、苹果酸等有机酸或磷酸钠、磷酸钾、酸性焦磷酸盐、聚磷酸盐(聚合磷酸盐)等磷酸盐或多
酚、儿茶素、α生育酚、迷迭香提取物、维生素c、绿茶提取物、甘草提取物、甲壳素、鞣酸、植酸等天然抗氧化剂中的一种或一种以上。在制备为饲料的情况下，上述组合物可以配制为普通的饲料形态，可以包含普通的饲料成分。
52.上述饲料及饲料添加剂还可以包含由粉碎或破碎的小麦、燕麦、大麦、玉米及大米；植物蛋白饲料，例如以芸苔、大豆以及葵花为主要成分的饲料；动物蛋白饲料，例如血粉、肉粉、骨粉及鱼粉；以及糖分及乳制品，例如各种奶粉及乳浆粉末组成的干燥成分等，此外还可以包含营养补充剂、消化及吸收促进剂、生长促进剂等。
53.上述饲料添加剂可以单独向动物给药，或者在食用载体中与其他饲料添加剂组合来给药。并且，上述饲料添加剂可以在追肥饲料中，或是将其与动物饲料直接混合，或者在饲料外以单独剂型的方式轻松地向动物给药。在上述饲料添加剂与饲料单独给药的情况下，可以与相关领域公知的药剂学上可接受的食用载体组合制备为即时释放或缓释剂型。上述载体可以为固体或液体载体，例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、玉米片、花生油、橄榄油、芝麻油及丙二醇。在使用固体载体的情况下，饲料添加剂可以为片剂、胶囊剂、散剂、含片或糖衣片剂或微分散性形态的追肥饲料。在使用液体载体的情况下，饲料添加剂可以为明胶软质胶囊剂，或者糖浆剂或悬浮液、溶液剂的剂型。
54.并且，上述饲料及饲料添加剂可以包含辅助剂，例如，保存剂、稳定剂、湿润剂或润滑剂、溶液促进剂等。上述饲料添加剂通过浸注、喷雾或混合的方式添加于动物的饲料来使用。
55.本发明的饲料或饲料添加剂可以适用于包括哺乳类、家禽及鱼类的大多数动物的饮食中。
56.上述哺乳类不仅可以为猪、牛、绵羊、山羊以及用于实验的啮齿动物，还可以为宠物(例如狗、猫)，上述家禽类可以为鸡、火鸡、鸭、鹅、雉鸡以及鹌鹑等，上述鱼类可以为鲤鱼及鳟鱼等，但不限定于此。
57.实施例1.菌株的分离以及鉴别
58.破碎各种泡菜试样后，将泡菜液用磷酸盐缓冲液(pbs，phosphate buffered saline)连续稀释(serial dilution，103～108)并涂抹于作为第一乳酸菌选择性培养基的mrs之后，在30℃或37℃的温度下分别培养24小时。将所形成的菌落分离成单个菌落后，在作为明串珠菌属选择性培养基的苯乙醇蔗糖培养基(phenylethyl alcohol sucrose agar)上划线涂抹并在20℃的温度下培养24小时。培养后，收集所形成的单个菌落并放在mrs液体培养基中进行培养。从培养了24小时的培养液中提取基因组dna(genomic dna)。为了确认16srdna碱基序列，委托macrogen公司分析所获取的基因组dna产物。通过国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information(ncbi，www.ncbi.nlm.nih.gov))的局部序列排比检索基本工具(basic local alignment search tool(blast))分析所确认的碱基序列的相似度，通过上述结果来最终命名为肠膜明串珠菌lb-lm1(leuconostoc mesenteroides lb-lm1)菌株，并于2020年4月24日保藏在韩国微生物保藏中心。
59.实施例2.菌株的培养
60.在30ml的mrs液体培养基中接种1％的所分离的肠膜明串珠菌lb-lm1(leuconostoc mesenteroides lb-lm1)菌株并在37℃的温度下静置培养6小时。培养后，通
mesenteroides lb-lm1)菌株的转移抑制能力。在100mm的培养皿中准备2
×
106cell的mc38细胞后，通过moi 1处理肠膜明串珠菌lb-lm1(leuconostoc mesenteroides lb-lm1)菌株并在5％co2、37℃的温度条件下培养24小时。培养后，用磷酸盐缓冲液清洗2次并处理0.25％胰蛋白酶-edta(trypsin-edta)来解吸细胞。用10ug/ml的纤维粘连蛋白(fibronectin)预先涂抹trans-well腔室膜(trans-well chamber membrane)的外侧，将解吸的细胞放入腔室(chamber)内侧并在5％co2、37℃的温度条件下培养24小时。培养后，用磷酸盐缓冲液清洗2次并用迪夫快速染(diff quik)溶液进行染。在进行充分的干燥后通过显微镜拍摄图像来测定细胞数量并算出转移率结果。
93.将处理肠膜明串珠菌lb-lm1(leuconostoc mesenteroides lb-lm1)菌株后拍摄大肠癌mc38细胞转移后的图像呈现在图8。
94.如图8所示，确认到与对照组相比，处理肠膜明串珠菌lb-lm1(leuconostoc mesenteroides lb-lm1)菌株的mc38大肠癌细胞株通过腔室(chamber)移动的细胞数量减少。
95.并且，将在大肠癌mc38细胞株处理肠膜明串珠菌lb-lm1(leuconostoc mesenteroides lb-lm1)菌株并计算的转移率呈现在图9。
96.如图9所示，随着确认处理肠膜明串珠菌lb-lm1(leuconostoc mesenteroides lb-lm1)菌株的mc38大肠癌细胞株的转移率减少27.5％，确认到肠膜明串珠菌lb-lm1菌株对抑制大肠癌的转移具有优异的功效。
97.[保藏编号]
[0098]
保藏机构名称：韩国微生物保藏中心(国外)
[0099]
保藏编号：kccm12701p
[0100]
保藏日期：2020年04月24日
[0101]

技术特征：

1.一种癌症的预防或用药物组合物，其特征在于，包含明串珠菌属菌株作为有效成分。2.根据权利要求1所述的癌症的预防或用药物组合物，其特征在于，上述明串珠菌属菌株为肠膜明串珠菌、肉明串珠菌、嗜柠檬酸明串珠菌、贺氏明串珠菌或乳明串珠菌。3.根据权利要求2所述的癌症的预防或用药物组合物，其特征在于，上述肠膜明串珠菌菌株为肠膜明串珠菌lb-lm1，其保藏编号为kccm12701p。4.根据权利要求1所述的癌症的预防或用药物组合物，其特征在于，上述癌症为大肠癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌或黑素瘤。5.根据权利要求1所述癌症的预防或用药物组合物，其特征在于，上述组合物能够通过口服给药或非口服给药的方法给药。6.根据权利要求5所述的癌症的预防或用药物组合物，其特征在于，上述非口服给药的方法为静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、内皮给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药或直肠内给药。7.一种癌症的预防或改善用食品组合物，其特征在于，包含肠膜明串珠菌lb-lm1菌株或其培养物作为有效成分，上述肠膜明串珠菌lb-lm1的保藏编号为kccm12701p。8.根据权利要求7所述的癌症的预防或改善用食品组合物，其特征在于，上述食品为保健功能食品。9.根据权利要求7所述的癌症的预防或改善用食品组合物，其特征在于，上述食品为选自由面包、年糕、糖果、巧克力、口香糖、冰淇淋、牛奶、芝士、肉制品、鱼肉制品、泡菜、酱油、大酱、辣椒酱、春酱、清麴酱、食醋、番茄酱、咖喱、调料、饮料以及发酵乳组成的组中的一种食品。10.一种癌症的预防或改善用食品添加剂组合物，其特征在于，包含肠膜明串珠菌lb-lm1菌株或其培养物作为有效成分，上述肠膜明串珠菌lb-lm1的保藏编号为kccm12701p。11.一种家畜的癌症预防或改善用饲料组合物，其特征在于，包含肠膜明串珠菌lb-lm1菌株或其培养物作为有效成分，上述肠膜明串珠菌lb-lm1的保藏编号为kccm12701p。12.根据权利要求11所述的家畜的癌症预防或改善用饲料组合物，其特征在于，上述家畜为选自由猪、牛、马、羊、兔、山羊、鼠、仓鼠、豚鼠、狗、猫、鸡、火鸡、鸭、鹅、野鸡、鹌鹑、鲤鱼、鲫鱼以及鳟鱼组成的组中的一种。13.一种家畜的癌症预防或改善用饲料添加剂组合物，其特征在于，包含肠膜明串珠菌lb-lm1或其培养物作为有效成分，上述肠膜明串珠菌lb-lm1的保藏编号为kccm12701p。

技术总结

本发明涉及一种包含从泡菜中分离的属于明串珠菌属(Leuconostoc)的菌株或其培养物作为有效成分的癌症的预防或用组合物。本发明的明串珠菌属菌株或其培养物呈现优异的抗癌活性，因此可以有效地用作人类或动物的癌症、预防或改善等用途的组合物。预防或改善等用途的组合物。预防或改善等用途的组合物。

技术研发人员：

陳和燮

受保护的技术使用者：

利斯科生物科技有限公司

技术研发日：

2021.01.27

技术公布日：

2022/12/29