一种评估猪达100kg体重日龄的方法

1.本发明属于分子生物学技术领域，涉及与猪达100kg体重日龄相关snp标记、检测方法和应用。

背景技术：

2.纵观世界各国猪种选育方法，大体上经历了三个阶段。第一阶段为1960年以前的阶段，主要以表型选择为主，即根据性状优劣直接进行选育，由于没有涉及到遗传基础，因此进展缓慢。第二阶段为1960—1985年，这一阶段随着对遗传学和基因组学有关理论的深入了解及计算机技术的发展，人们可以透过复杂的表面现象(表型与表型值)，剖析其遗传基础，根据基因型选种，提出了blup法估计育种值等方法，提高了选种效率，加快了选育进展。第三阶段是1986年至今，随着基因工程技术的发展，人们逐步将分子标记技术、dna重组技术和转基因技术等用于猪的育种领域，由此进入了分子育种与常规育种相结合阶段，进一步提高了育种效率和进度。
3.分子标记生物技术是20世纪末人类科技史中最令人瞩目的高新技术之一。其中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，snp)是目前研究和应用最广泛的分子标记。snp标记包括单个碱基的缺失、插入、转换和颠换，是人类可遗传变异中最为常见的一种，占所有基因多态性的90％以上。snp通常是一种双等位基因，或多态的变异。snp在基因组中数量巨大，分布频密，而且其检测易于自动化和批量化，因而被认为是最具应用价值的新一代遗传标记。
4.进入21世纪以来，许多家畜如猪、牛等物种的全基因组测序纷纷宣告完成，从而获得了大量的基因组序列信息，并建立了各自物种的基因组数据库。通过生物信息学手段对dna数据库中的数据进行比较分析，为发现新的snps提供了一种便捷的方法，大大提高了研究人员搜寻新snp的速度，节省了大量人力物力。因此，生物信息学方法手段已成为我们进行分子标记技术研究中必不可少的工具。

技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对猪生长性状的分子育种，提供与猪达100kg体重日龄相关的snp标记。
6.本发明提供一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄的产品，所述产品为用于检测待测猪基因组中snp标记rs321528342的多态性或基因型的的物质，所述snp标记rs321528342为猪参考基因组10.2版本参考序列1号染体上如序列1所示序列的第151位，其为c或t。
7.其中，所述检测snp标记rs321528342的多态性或基因型的物质如下a1)或a2) 或a3)或a4)：
8.a1)用于扩增含有snp标记rs321528342的dna片段的引物对；
9.a2)含有a1)的pcr试剂；
10.a3)含有a1)或a2)的试剂盒；
11.a4)用于检测snp标记rs321528342的多态性或基因型的snp芯片。
12.其中，所述用于扩增含有snp标记rs321528342的dna片段的引物对为如下
13.uep_seq-1：gggcgccctggccttggcaa(序列2)
14.ext1_seq-1：gggcgccctggccttggcaac(序列3)
15.ext1_seq-1：gggcgccctggccttggcaat(序列4)
16.上述的产品在鉴定或辅助鉴定猪眼肌面积中的应用也应在本发明的保护范围之内。
17.上述的产品在猪育种中的应用也应在本发明的保护范围之内。
18.本发明提供一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法，所述方法包括：检测待测猪基因组中snp标记rs321528342的基因型，ct基因型猪的达100kg体重日龄小于cc基因型猪的达100kg体重日龄；
19.其中，所述snp标记rs321528342为猪参考基因组10.2中1号染体上如序列 1所示序列的第151位，其为c或t；
20.所述cc基因型为snp标记rs321528342为cc；
21.所述ct基因型为snp标记rs321528342为ct。
22.上述的方法在鉴定或辅助鉴定达100kg体重日龄中的应用也应在本发明的保护范围之内。
23.上述的方法在猪育种中的应用也应在本发明的保护范围之内。
24.本发明提供一种猪的育种方法，所述方法包括：检测待测猪基因组中权利要求1 所述snp标记rs321528342的基因型，选择基因型为ct型的猪进行培育。
25.本发明采用sequenom技术进行基因分型，通过关联分析发现了snp位点rs321528342对猪达100kg体重日龄有显著影响，该位点位于猪enssscg00000004081 基因内。本发明发现ct型个体猪达100kg体重日龄显著低于cc型个体。因此，本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法，可以通过选育 rs330973858核苷酸位点的ct型个体作为种猪，就可以筛选出达100kg体重日龄小的猪。
26.上述猪为约克夏纯种猪。
27.上述育种是指培育猪达100kg体重日龄小的猪。
28.本发明的有益效果在于：本发明提供的snp标记与猪100kg体重日龄相关。该 snp标记rs321528342位于国际猪基因组10.2版本参考序列猪1号染体上，且具有 t/c多态性。该位点处，tc型个体具有更短的100kg体重日龄。因此，可以通过鉴定该snp标记的不同基因型来筛选更短的100kg体重日龄的种猪，提高养猪企业和整个生猪养殖业的经济效益，具有十分重要的社会价值。
具体实施方式
29.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
30.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所
描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
31.实施案例：
32.1试验动物来源
33.河北衡水种猪场的约克夏纯种猪。
34.2提取猪基因组dna
35.采集384头猪耳组织样本，4份/头，其中1份用于个体dna提取。
36.参考天根生物科技公司组织dna提取试剂盒说明书，按以下步骤顺序进行dna 提取：
37.(1)先在缓冲液gd和漂洗液pw中分别加入68ml和200ml无水乙醇，充分混匀。
38.(2)采集组织样约100mg置于2mlep管内，完全剪碎后加200μl缓冲液ga，振荡至彻底悬浮。
39.(3)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀后放在56℃金属浴中消化过夜，直至耳样组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
40.(4)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，放在70℃金属浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
41.(5)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
42.(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中，吸附柱放入收集管中，随后以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。
43.(7)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
44.(8)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
45.(9)重复操作步骤(8)
46.(10)将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
47.(11)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，将离心得到的溶液再加入吸附柱cb3中，室温放置2min，12,000rpm离心 2min将溶液收集到离心管中。
48.经过nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度统一稀释到50ng/μl，并于-20℃下保存备用。
49.3、snp分型检测检测方法
50.(1)利用质谱检测的方法，使用sequenom公司的引物设计软件assaydesign3.1，设计 pcr反应和单碱基扩展引物并合成。
51.(2)pcr反应引物为：1st-pcrp-1：acgttggatgttcagtccctagtatcggag(如序列表中的序列5所示)；2nd-pcrp-1：acgttggatgtcttctggtaaagctccctg(如序列表中的序列6所示)。
52.(3)利用设计好的引物在进行质谱检测后进行基因型鉴定。
53.(4)分子标记序列所述的snp位点分别位于chromosome1:13,949,555，存在t/c多态性。
54.(5)chromosome1:13,949,555位点的snp分型的单碱基引物为：uep_seq-1： gggcgccctggccttggcaa(如序列表中的序列2所示)；ext1_seq-1： gggcgccctggccttggcaac(如序列表中的序列3所示)；ext1_seq-1： gggcgccctggccttggcaat(如序列表中的序列4所示)。
55.(6)对包含约克夏猪基因组扩增的pcr产物进行测序判读该位点的t/c多态性；
56.所述snp标记rs321528342为猪参考基因组10.2版本参考序列1号染体上如序列1所示序列的第151位，其为c或t，在序列表中用y表示。
57.4、或者采用基于sequenom平台的snp分型检测进行snp分型。
58.表1反应体系(384孔pcr板+38％的试剂损耗)
[0059][0060]
表2循环参数为：
[0061][0062]
表3sap消化的反应体系(384孔pcr板+38％的试剂损耗)
[0063]
reagentconcentrationvolume(ul)waterna810.9sap buffer10x90.1sap1.7u/ul159.0total 2/well
[0064]
表4sap消化的循环参数
[0065]
temperature(℃)time(minute)cycle3740185514∞1
[0066]
表5延伸反应的反应体系(384孔pcr板+38％的试剂损耗)
[0067]
reagentconcentrationvolume(ul)waterna400.2iplex bufferplus10x106iplex terminatorna106primer mix0.6-1.3um426.1iplex enzymena21.7total 2/well
[0068]
表6延伸反应的循环参数
[0069][0070][0071]
5、上机检测：
[0072]
a)将反应产物(共9ul)稀释3倍，使用树脂进行脱盐。
[0073]
b)将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶。
[0074]
c)上机进行质谱检测，并收集数据，判读rs321528342位点的基因型。
[0075]
6、统计分析
[0076]
采用gemma统计分析软件的混合线性模型进行统计分析。统计分析模型为：
[0077]
y＝wa+xβ+μ+ε；
[0078]
y代表个体表型值；w代表协变量；a代表对应系数；x代表snp基因型；β代表对应的snp效应；μ代表剩余多基因效应；ε代表剩余残差效应。
[0079]
7.结果分析
[0080]
采用popgene3.2计算snp标记位点的基因型频率和等位基因频率，结果如表7 所示：
[0081]
表7、rs321528342位点在本体中基因型频率和等位基因频率
[0082][0083]
表8给出了snp位点rs321528342与猪100kg体重日龄的关联分析结果。由表8 可知，rs321528342位点与猪100kg体重日龄性状显著相关(p《0.1)，其中在 rs321528342突变个体中，tc型个体猪100kg体重日龄显著低于cc型个体(p《0.1)。由此可见，在猪体中，继代选育rs321528342位点的tc型，可逐步缩短猪100kg 体重日龄，提高生猪养殖的经济效
益。
[0084]
表8、rs321528342位点不同基因型个体间的100kg体重日龄差异
[0085][0086]
本发明采用sequenom技术进行基因分型，通过关联分析发现snp位点 rs321528342对猪达100kg体重日龄有显著影响，该位点位于猪enssscg00000004081 基因内。本发明发现ct型个体猪达100kg体重日龄显著低于cc型个体。因此，本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法，可以通过选育 rs330973858核苷酸位点的ct型个体作为种猪，就可以筛选出达100kg体重日龄短的猪。
[0087]
本发明提供的snp标记与猪达100kg体重日龄相关。该snp标记rs321528342 位于国际猪基因组10.2版本参考序列猪1号染体上，且具有t/c多态性。该位点处，ct型个体具有更短的100kg体重日龄。因此，可以通过鉴定该snp标记的不同基因型来筛选达100kg体重日龄更短的种猪，提高养猪企业和整个生猪养殖业的经济效益，具有十分重要的社会价值。
[0088]
上述方法中，也可以基于neogen公司的neogen_por80k芯片平台进行snp分型检测：基于snp的分型平台软件gencall version为7.0.0将1,173个个体的数据进行分型工作：期间涵盖表型数据和基因型数据的质量控制，基因型和表型的整合，得到rs321528342位点的基因型。
[0089]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：

1.一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄的产品，所述产品为用于检测待测猪基因组中snp标记的多态性或基因型的物质，所述snp标记为猪参考基因组10.2版本参考序列1号染体上如序列1所示序列的第151位核苷酸，其为c或t。2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，所述检测snp标记的多态性或基因型的物质如下a1)或a2)或a3)或a4)：a1)用于扩增含有snp标记的dna片段的引物对；a2)含有a1)的pcr试剂；a3)含有a1)或a2)的试剂盒；a4)用于检测snp标记的多态性或基因型的snp芯片。3.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，所述用于扩增含有snp标记的dna片段的成套引物对包括序列为序列2、序列3和序列4所示的dna分子。4.权利要求1-3任一所述的产品在鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄中的应用。5.权利要求1-3任一所述的产品在猪育种中的应用。6.一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法，其特征在于，所述方法包括：检测待测猪基因组中权利要求1中所述的snp标记的基因型，ct基因型猪的达100kg体重日龄小于cc基因型猪的达100kg体重日龄；其中，所述snp标记为猪参考基因组10.2中1号染体上如序列1所示序列的第151位，其为c或t；所述cc基因型为snp标记为cc的纯合型；所述ct基因型为snp标记为ct的杂合型。7.权利要求6所述的方法在鉴定或辅助鉴定达100kg体重日龄中的应用。8.权利要求6所述的方法在猪育种中的应用。9.一种猪的育种方法，其特征在于，所述方法包括：检测待测猪基因组中权利要求1中所述snp标记的基因型，继代选育基因型为ct型的猪进行培育。

技术总结

本发明公开了一种评估猪达100kg体重日龄的方法,所述方法包括：检测待测猪基因组中的SNP标记的基因型，CT基因型猪的达100kg体重日龄小于CC基因型猪的达100kg体重日龄。所述SNP标记为猪参考基因组10.2版本参考序列1号染体上如序列1所示序列的第151位核苷酸，其为C或T。本发明提供的SNP标记与猪100kg体重日龄相关，位于国际猪基因组10.2版本参考序列猪1号染体上，且具有T/C多态性。CT基因型个体具有更短的100kg体重日龄。因此，可以通过鉴定该SNP标记的不同基因型来筛选更短的100kg体重日龄的种猪。日龄的种猪。