用于固定酶及生物活性物的再生丝素蛋白及其复合材料的制作方法

专利名称

：用于固定酶及生物活性物的再生丝素蛋白及其复合材料的制作方法

技术领域

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本发明属高分子化学技术领域，是一种酶及生物活性物的固定基材。
酶是一种高效、高度专一的生物催化剂，在人类历史上它的应用很早就开始了，而且日益广泛。但酶一个致命的弱点是稳定性较低，对于高温、有机溶剂或极端的PH极其敏感。从而给酶的分离、制备、应用以及回收带来了一定的困难。固定化酶的出现克服了这一缺点，为酶的应用开辟了新的前景。
酶的固定化方法很多，大致可以分为物理方法(如吸附、、包埋)和化学方法(如共价键合)。固定化酶的性能如何取决于固定基材及方法。最近几年，发现丝素蛋白作为酶的固定基材具有其它高分子材料所没有的优点。它固定酶的原理是建立在丝素蛋白从可溶性的结构转变成不溶性的3一折叠结构同时完成酶的固定化。1986年日本的Nakayama，H.等用丝素蛋白固定了脂肪酶，随后日本学者Asakura，T.等报道用丝素蛋白固定了葡萄糖化酶、过氧化物酶等。本发明者也曾用丝素蛋白固定了葡萄糖化酶和脲酶，并制成了酶电极作为生物传感器。90年代以来，日本学者还用丝素蛋白来固定抗体、抗原、动物细胞及微生物。用丝素蛋白作为酶及生物活性物的固定基材，虽然有其独特的优点。但是，丝素蛋白一般直接从桑蚕中制取，受到季节的严格限制。另一方面，丝素蛋白在干燥条件下及有机体系中容易变脆，影响了它有应用。
本发明的目的在于提供一种来源广泛、性能优良的材料作为酶及生物活性物的固定基材。
过去人们一直认为蚕丝在丝织厂经过拉伸和高温处理，蚕丝蛋白发生变性，失去了它原有的一些性能，不能恢复其原来的结构。因而，没有人利用丝织厂里的废丝，作为固定酶及生物活性物的基本材料来源。本发明为解决目前固定基材的材料来源问题，从丝织厂废蚕丝中制得再生丝素蛋白，并进一步利用性能优良的高分子材料进行物理改性，获得性能优良的再生丝素蛋白高分子复合材料，作为酶及生物活性物的固定基材。
本发明采用丝织厂里的废蚕丝经过再生处理得到再生丝素蛋白。这种再生丝素蛋白仍具有活蚕体中的蚕丝蛋白的有关性能，可以应用于酶及其他生物活性物的固定。这些酶包括葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶、脲酸氧化酶、氨基酸氧化酶、脂肪酸、纤维素酶等各种酶，生物活性物包括抗体、抗原、动物细胞、微生物等。用再生丝素蛋白固定后，其活性保持不变，生物寿命大大延长。
再生丝素蛋白的制备方法如下将丝织厂的废蚕丝用0.1～3％的NaHCO3在90～105℃温度条件处理20～60分钟，然后用去离子水清洗，再将其溶解在7—10MLiBr溶液中，在半透膜袋中透析48～96小时，除去不溶物，即得到完全清晰透明的再生丝素蛋白溶液。对酶(或生物活性物)固定化时，按一定比例的酶溶液和再生丝素蛋白溶液完全混和均匀。除去溶剂水，根据需要，可以将固定化酶制成粉末、颗粒、胶冻及膜薄等。对其他生物活性物的固定化方法相似。
为了克服再生丝素蛋自在干燥状态下和在有机体系中变脆不利于重复使用的问题，本发明进一步用性能优良的高分子材料进行物理改性，即将再生丝素蛋白和这些高分子材料制成复合材料。用于复合的高分子材料有聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、海藻酸纳、纤维素及其衍生物等。这些复合材料作为酶和生物活性物的固定基材非常理想，既保持了丝素蛋白的优点，又发挥了高分子材料的优良性能，消除了丝素蛋白的弱点，从而解决了工业化生产中的原料来源和材料性能问题。
复合材料的制备方法如下将前述的高分子材料的一种，如聚乙烯醇，完全溶解于水中，除去一些不溶物，得到具有一定粘度的清晰透明的高分子材料溶液，重量浓度为1—5％，按1∶0.4～1∶6的比例，更合适为1∶3～1∶5的比例与重量浓度为1—3％的再生丝素蛋白溶液，完全混合，除去溶剂，即得到复合材料。根据需要，可以将这种复合材料制成粉末、颗粒、胶冻及薄膜等。
酶的固定化是把酶完全溶解于由上述再生丝素蛋白和某种高分子复合材料配制而成的溶液中，除去溶剂水，即得到不同形状的固定化酶。其他生物活性物的固定化方法都类似。
由于采用包理方法，不用任何交联剂，所以方便可行，根据需要，固定化酶可以制成粉末、颗粒、胶冻及薄膜，固定化酶可以在更宽的PH值(6.0～8.0℃)、更高的温度(60℃)时使用，而且保存2个月后，活性基本不变，连续工作8小时酶的活性还可以保存85％。用再生丝素蛋白固定生物活性物，如抗体、抗原、动物细胞、微生物等，它们的活性也基本保持不变，寿命大大增长。上述这些固定物可以应用于生物传感器及反应器等方面。如固定化的葡萄糖氧化酶可以制成葡萄糖传感器，过氧化物酶可以在更高的温度和更宽的PH值范围内使用，而且快速、重现性好，测定一个样品只要20秒，同一样品10次测定的标准偏差只有2.8％。
下面以葡萄糖氧化酶固定为例子，说明本发明提供的再生丝素蛋白及其高分子复合材料作为固定基材的有关性能。以再生丝素蛋白用于对葡萄糖氧化酶的固定，得到的固定化酶的性能如下线性范围2.5×10-5～3.2×10-3mol/L，使用的PH值范围为5.0～9.0，最佳值为7.0～7.5。使用的温度范围不高于65℃，使用寿命在30℃下连续工作5小时，活性仍达80％，保存寿命在4℃下保存75天，活性没有明显变化，有90％的活性。
以再生丝素蛋白与聚乙烯醇的复合材料用于对葡萄糖氧化酶的固定。复合材料性能吸水性和机械强度大大提高，纯再生丝素膜的吸水性为100％，最大拉伸强度为3.4×103牛顿/cm2，而复合材料的吸水性提到500％，最大拉伸强度提高到5.9×103牛顿/cm2。固定化酶的性能线性范围为1.0× 10-5～1.8×10-3mol/L，使用的PH值范围为5.0～9.0，最佳值为7.0～7.5，使用的温度范围为在50℃以下，使用寿命在30℃下连续工作5小时，活性还有85％，保存寿命在4℃下保存75天，其活性变化不大，仍有86％的活性。

权利要求

1.一种用于固定酶及生物活性物的基材，其特征于该基材为由废丝经过再生处理制得的再生丝素蛋白及其高分子复合材料。
2.根据权利要求1所述的用于固定酶及生物活性物的基材，其特征在于复合材料中的高分子材料为聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、海藻酸钠、纤维素及其衍生物。
3.根据权利要求1所述的用于固定酶及生物活性物的基材，其特征在于其中的再生丝素蛋自由如下方法制备将丝织厂的废丝用0.1～3％的NaHCO3在90～105℃温度下处理20～60分钟，然后用去离子水清洗，再将其溶解于7—10MLiBr溶液中，在半透膜袋中透折48～96小时，除去不溶物，即得清晰透明的再生丝素蛋白溶液。
4.根据权利要求2所述的用于固定酶及生物活性物的基材，其特征在于其中的复合材料由如下方法制备将高分子材料完全溶解于水中，除去不溶物，得到浓度为1—5％的清晰透明的高分子材料溶液，再按1∶0.4～1∶6的比例与浓度为1～3％的再生丝素蛋白溶液完全混合，除去溶剂，即得到复合材料。

全文摘要

本发明属高分子化学技术领域，是一种酶及生物活性物的固定基材。本发明利用丝织厂的废丝，经处理制得再生丝素蛋白，并进一步利用高分子材料进行物理改性，获得再生丝素蛋白高分子复合材料。用再生丝素蛋白及其高分子复合材料作为固定基材，可以克服丝素蛋白的材料来源和材料性能的问题，并使固定化酶及生物活生物具有良好的性能。根据需要产品可以制成粉末、颗粒、胶冻及膜等形式。活性可以在更宽的pH值、温度范围内保留，寿命也大大提高。