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用于抑制致病性大肠杆菌增殖的组合物和方法与流程

用于抑制致病性大肠杆菌增殖的组合物和方法
1.本技术要求于2020年4月4日提交的美国非临时专利申请号16/840,334的优先权，该申请出于所有目的以引用方式并入，如同在本文中完整阐述一样。
技术领域
2.本发明涉及用于抑制致病性大肠杆菌(escherichia coli)增殖的组合物和方法，更具体地说，涉及含肌尾噬菌体科噬菌体(myoviridae bacteriophage)的组合物及其使用方法。

背景技术：

3.大肠杆菌是一种革兰氏阴性、兼性厌氧、杆状大肠杆菌属大肠菌型细菌。在血清学上，根据其是否含有体细胞(o)、鞭毛(h)或荚膜(k)抗原进行细分，已知这些抗原与大肠杆菌的致病性相关。致病性大肠杆菌是指获得了少量的能够在大肠杆菌中表达的毒力因子的大肠杆菌，根据其发病特征和毒素种类，有五种致病性大肠杆菌，即肠出血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌和肠聚集性大肠杆菌。
4.致病性大肠杆菌可引起多种疾病，如食物中毒、急性胰腺炎、尿路感染、败血症和癌症。在致病性大肠杆菌相关的癌症中，结直肠癌是最常见的癌症之一，约占所有癌症病例的10％和所有癌症死亡的8％。此外，结直肠癌在全球非常常见，并通过促使正常粘膜向腺癌的转变的结肠上皮细胞突变的累积而发展。作为导致结直肠癌发生的主要原因之一，结肠息肉是指结肠粘膜异常生长并成为突出到肠内的疣状肿块的情况。它通常分为可能发展成癌症的肿瘤性息肉和不太可能发展成癌症的非肿瘤性息肉。在各种类型的息肉中，腺瘤性息肉随着时间的推移更有可能发展为癌症。虽然致病性大肠杆菌引起的腹泻是一种值得注意的疾病，但一些致病性大肠杆菌的定殖与促使腺瘤性息肉的形成而促使结直肠癌的发展有关。
5.通常，疫苗和抗生素被用于致病性大肠杆菌的传染性疾病的预防和。在这里，由于抗生素耐药性致病性大肠杆菌的增加，抗生素的有效性一直在不断下降，需要研发除目前处方抗生素以外的有效方法。
6.最近，使用噬菌体作为防治细菌性传染性疾病的对策引起了广泛关注。噬菌体是感染细菌的非常小的微生物，通常简称为“噬菌体”。一旦噬菌体感染细菌细胞，噬菌体就会在细菌细胞内增殖。增殖后，噬菌体的后代破坏细菌细胞壁并从宿主细菌中逃脱，表明噬菌体具有杀灭细菌的能力。噬菌体感染细菌的方式的特点是其非常高的特异性，因此感染特定细菌的噬菌体类型的数量是有限的。也就是说，某种噬菌体只能感染特定的细菌，这表明某种噬菌体仅能杀灭特定的细菌而不能伤害其他细菌。由于噬菌体的这种细菌特异性，噬菌体仅对目标细菌具有抗菌作用，但不影响包括人类在内的动物中的共生细菌。广泛用于细菌的传统抗生素附带地也会影响多种细菌。这会导致诸如正常菌紊乱的问题。另一方面，噬菌体的使用不会干扰正常菌，因为目标细菌被选择性地杀灭。因此，可以安全地使用噬菌体，与任何其他抗生素相比，这大大降低了使用中发生不良反应的可能性。
7.由于噬菌体具有杀灭细菌的独特的能力，自发现以来，噬菌体作为一种防治细菌感染的潜在的有效对策引起了人们的关注，并进行了大量相关研究。
8.噬菌体往往对细菌具有高度特异性。由于这种特异性，噬菌体通常仅对某些细菌菌株具有抗菌作用，即使这些细菌属于同一菌种。此外，噬菌体的抗菌强度可能取决于目标菌株的类型。因此，有必要收集多种有用的噬菌体，以便有效控制特定细菌。因此，为了研发针对致病性大肠杆菌的有效噬菌体利用方法，必须获得对致病性大肠杆菌具有抗菌作用的多种噬菌体。此外，需要筛选产生的噬菌体，以确定它们在抗菌强度和抗菌谱方面是否优于其他噬菌体。

技术实现要素：

9.所要解决的技术问题
10.因此，本发明考虑到相关技术中遇到的问题并且旨在解决这些问题。
11.在一个实施方式中，用于预防或由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的组合物包括：具有裂解致病性大肠杆菌的能力的肌尾噬菌体科噬菌体以及药学上可接受的载体。
12.在另一个实施方式中，肌尾噬菌体科噬菌体包括如seq id no:1所述的序列。
13.在另一个实施方式中，肌尾噬菌体科噬菌体的浓度为1
×
101pfu/ml至1
×
10
30
pfu/ml或1
×
101pfu/g至1
×
10
30
pfu/g。
14.在另一个实施方式中，肌尾噬菌体科噬菌体的浓度为1
×
104pfu/ml至1
×
10
15
pfu/ml或1
×
104pfu/g至1
×
10
15
pfu/g。
15.在另一个实施方式中，药学上可接受的载体是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸酯(propylhydroxybenzoate)、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油。
16.在另一个实施方式中，组合物还包括选自由润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂组成的组的一个或多个。
17.在另一个实施方式中，致病性大肠杆菌是肠出血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌或致癌性大肠杆菌。
18.在另一个实施方式中，感染或疾病是食物中毒、胃肠炎、腹泻、尿路感染、新生儿脑膜炎、溶血性尿毒症综合征、腹膜炎、乳腺炎、败血症、革兰氏阴性肺炎、志贺氏菌病、痢疾或癌症。
19.在另一个实施方式中，组合物是溶液、悬浮液、油乳剂、水溶性介质、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊。
20.在另一个实施方式中，组合物进一步包括具有裂解致病性大肠杆菌或非大肠杆菌细菌种的能力的第二噬菌体。
21.在另一个实施方式中，肌尾噬菌体科噬菌体具有20-70分钟的潜伏期和80-200pfu/感染细胞的裂解量。
22.在另一个实施方式中，潜伏期为35-40分钟，裂解量为110-120pfu/感染细胞。
23.在一个实施方式中，用于预防或由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的方法
包括向受试者给药肌尾噬菌体科噬菌体；以及用肌尾噬菌体科噬菌体裂解致病性大肠杆菌。
24.在另一个实施方式中，肌尾噬菌体科噬菌体包括如seq id no:1所述的序列。
25.在另一个实施方式中，肌尾噬菌体科噬菌体的浓度为1
×
101pfu/ml至1
×
10
30
pfu/ml或1
×
101pfu/g至1
×
10
30
pfu/g。
26.在另一个实施方式中，肌尾噬菌体科噬菌体的浓度为1
×
104pfu/ml至1
×
10
15
pfu/ml或1
×
104pfu/g至1
×
10
15
pfu/g。
27.应当理解，上述一般描述和以下详细描述都是示例性和解释性的，旨在提供对所要求保护的本发明的进一步解释。
28.发明的有益效果
29.与基于抗生素的传统组合物和方法相比，本技术的用于抑制致病性大肠杆菌增殖的组合物和方法对致病性大肠杆菌具有高特异性。该组合物可用于预防或致病性大肠杆菌感染，而不影响其他有用的共生菌，并且具有较小的副作用。一般来说，当使用抗生素时，共生菌也受到损害，因此由于其使用而产生各种副作用。同时，在噬菌体对相同细菌菌种表现出抗菌活性的情况下，噬菌体的每种抗菌特性(例如抗菌强度和抗菌谱(宿主范围))是不同的，并且噬菌体通常仅对相同细菌菌种中的某些细菌菌株有效。因此，本技术的组合物和方法在其工业应用中提供了不同的效果。
附图说明
30.附图是为了提供对本发明的进一步理解，被纳入本说明书并构成本说明书的一部分，附图说明了本发明的实施方式，并与描述一起用于解释本发明的原理。
31.在附图中：
32.图1是示出噬菌体esc-cop-15的形态的电子显微照片。
33.图2是噬菌体esc-cop-15的主要结构蛋白的分析结果。
34.图3是示出噬菌体esc-cop-15杀灭大肠杆菌能力的实验结果的照片。透明区是由目标细菌裂解形成的斑块。
35.图4是噬菌体esc-cop-15的一步生长曲线。
具体实施方式
36.现在将详细参考本发明的实施方式，其示例在附图中示出。
37.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种名为esc-cop-15的肌尾噬菌体科噬菌体，其具有特异性杀灭大肠杆菌的能力，并具有包含如seq id no:1所述序列的基因组。本发明还提供了使用包含其作为活性成分的组合物用于预防和由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的方法。
38.噬菌体esc-cop-15由本技术的发明人分离，然后于2019年11月15日保藏在韩国生命工学研究院(korea research institute of bioscience and biotechnology)的韩国典型培养物保藏中心(korea collection for type cultures)(保藏号：kctc 14027bp)。
39.噬菌体esc-cop-15的潜伏期和裂解量分别为20-70分钟和80-200pfu/感染细胞，优选分别为35-40分钟和110-120pfu/感染细胞，但不限于此。
40.此外，本发明提供了一种可用于预防或由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的组合物，其包括噬菌体esc-cop-15作为活性成分。
41.因为包含在本发明组合物中的噬菌体esc-cop-15能有效杀灭致病性大肠杆菌，所以认为其在预防致病性大肠杆菌感染或由致病性大肠杆菌引起的疾病方面有效。因此，本发明的组合物能够被用于预防和由致病性大肠杆菌引起的疾病。
42.本发明中由致病性大肠杆菌引起的疾病包括食物中毒、胃肠炎、腹泻、尿路感染、新生儿脑膜炎、溶血性尿毒症综合征、腹膜炎、乳腺炎、败血症、革兰氏阴性肺炎、志贺氏菌病、痢疾和癌症，但不限于此。
43.本发明组合物中包含的药学上可接受的载体是通常用于制备药物制剂的载体，其示例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸酯(propylhydroxybenzoate)、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。除了上述成分之外，本发明的组合物还可以包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。
44.在本发明的组合物中，包括噬菌体esc-cop-15作为活性成分。包括的噬菌体esc-cop-15的浓度为1
×
101pfu/ml至1
×
10
30
pfu/ml或1
×
101pfu/g至1
×
10
30
pfu/g，优选浓度为1
×
104pfu/ml至1
×
10
15
pfu/ml或1
×
104pfu/g至1
×
10
15
pfu/g。
45.本发明的组合物可以根据本发明所属领域的普通技术人员使用单位剂量或多剂量容器形式的药学上可接受的载体和/或赋形剂来容易地进行的方法进行配置。然后，制剂可以是溶液、悬浮液或油乳剂或水溶性介质、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式。可以另外包括分散剂或稳定剂。
46.为了提高上述目的的有效性，可在本发明组合物中进一步包括对非大肠杆菌细菌菌种具有抗菌活性的噬菌体。此外，在本发明的组合物中还可以包括对大肠杆菌具有抗菌活性的其他种类的噬菌体。可以附加地包括这些噬菌体，以使抗菌效果最大化，因为噬菌体的每种抗菌性质(例如抗菌强度和抗菌谱(宿主范围))在噬菌体对相同细菌菌种表现出抗菌活性的情况下是不同的。
47.在本说明书中，术语“预防(prevention)”和“预防(prevent)”表示(i)阻断致病性大肠杆菌感染；和(ii)抑制由致病性大肠杆菌感染引起的疾病的进展。
48.在本说明书中，术语“(treatment)”和“(treat)”表示所有以下活动：(i)抑制由致病性大肠杆菌引起的疾病；和(ii)减轻由致病性大肠杆菌引起的疾病的病理状况。
49.在本说明书中，术语“致病性大肠杆菌”表示肠出血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌，肠致病性大肠菌、肠聚集性大肠杆菌和致癌性大肠杆菌，但不限于此。
50.在本说明书中，术语“由致病性大肠杆菌引起的疾病”和“致病性大肠菌感染”表示食物中毒、胃肠炎、腹泻、尿路感染、新生儿脑膜炎、溶血性尿毒症综合征、腹膜炎、乳腺炎、败血症、革兰氏阴性肺炎、志贺氏菌病、痢疾和癌症，但不限于此。
51.在本说明书中，术语“潜伏期”表示噬菌体微粒在受感染的宿主细胞内繁殖所需的时间。
52.在本说明书中，术语“裂解量”表示每个被感染的细菌产生的噬菌体的数量。
53.在本说明书中，术语“分离(isolate)”、“分离(isolating)”和“分离(isolated)”表示通过应用各种实验技术从自然界中分离噬菌体的行为，以及确保能够区分目标噬菌体和其他噬菌体的特性的行为，并且还包括使用生物工程技术增殖目标噬菌体从而使得目标噬菌体可工业应用的行为。
54.如以下示例所示，本发明的实际的和当前优选的实施方式是说明性的。
55.然而，应当理解，本领域技术人员在考虑本公开内容的基础上，可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
56.实施例1：能够杀灭大肠杆菌的噬菌体的分离
57.从环境或临床样本中收集样本，以分离能够杀灭大肠杆菌的噬菌体。这里，用于噬菌体分离的大肠杆菌菌株已经由本技术的发明人预先分离并鉴定为大肠杆菌。
58.下文详细描述了分离噬菌体的步骤。将收集的样本添加到以1/1000的比例接种大肠杆菌的tsb(胰酶大豆肉汤)培养基(酪蛋白消化物17g/l；大豆消化物3g/l；葡萄糖2.5g/l；氯化钠5g/l；磷酸氢二钾2.5g/l)，然后在37℃振荡培养3-4小时。培养完成后，以8,000rpm离心20分钟，回收上清液。回收的上清液以1/1000的比例接种大肠杆菌，然后在37℃振荡培养3-4小时。当样本含有噬菌体时，为了充分增加噬菌体的数量(滴度)，将上述步骤重复总共5次。重复该步骤5次后，将培养液以8,000rpm离心20分钟。离心后，使用0.45μm过滤器过滤回收的上清液。将获得的滤液用于典型的斑点试验，以检查其中是否包含能够杀灭大肠杆菌的噬菌体。
59.斑点试验如下进行：以1/1000的比例将大肠杆菌接种到tsb培养基，然后在37℃下振荡培养过夜。将2ml(od
600
为1.5)的上述制备的大肠杆菌培养液涂抹在tsa(酪蛋白消化物15g/l；大豆消化物5g/l，氯化钠5g/l；琼脂15g/l)平板上。将平板放置在清洁的工作台上约30分钟以干燥涂抹的溶液。干燥后，将10μl制备好的滤液点在其上涂有大肠杆菌的平板培养基上，然后放置干燥约30分钟。干燥后，将被点滴的平板培养基在37℃培养一天，然后检查在滴有滤液的位置透明区的形成。在滤液产生透明区的情况下，则判断其中包括能够杀灭大肠杆菌的噬菌体。通过上述检查，可以获得含有具有杀灭大肠杆菌能力的噬菌体的滤液。
60.从上述确认的滤液中分离出纯噬菌体，以得到能够杀灭大肠杆菌的噬菌体。传统的噬菌斑测定用于分离纯噬菌体。详细地说，使用灭菌的尖端回收在噬菌斑测定过程中形成的斑块，然后将其添加到大肠杆菌的培养溶液中，然后在37℃培养4-5小时。培养后，以8,000rpm离心20分钟以获得上清液。将大肠杆菌培养液以1/50的体积比添加到获得的上清液中，然后在37℃培养4-5小时。为了增加噬菌体的数量，重复上述步骤至少5次。然后，以8,000rpm离心20分钟，以获得最终上清液。使用得到的上清液进一步进行噬菌斑测定。一般来说，纯噬菌体的分离不是通过步骤的单次迭代完成的，因此使用上述得到的斑块重复上述步骤。在至少5次重复该步骤后，获得含有纯噬菌体的溶液。通常重复分离纯噬菌体的步骤，直到生成的斑块在大小和形态上变得彼此相似。此外，使用电子显微镜确认纯噬菌体的最终分离。重复上述步骤，直到使用电子显微镜确认分离出纯噬菌体。根据常规方法操作电子显微镜。简言之，将含有纯噬菌体的溶液加载到铜网格上，然后用2％醋酸铀酰进行负染并干燥。然后使用透射式电子显微镜观察其形态。分离的纯噬菌体的电子显微照片如图1所
示。根据形态学特征，确认上述分离的新噬菌体属于肌尾噬菌体科噬菌体。
61.对含有上述确认的纯噬菌体的溶液进行以下纯化过程。以噬菌体溶液的总体积计，以1/50的体积比将大肠杆菌培养液添加到含有纯噬菌体的溶液中，然后进一步培养4-5小时。培养后，以8,000rpm离心20分钟以获得上清液。重复该步骤总共5次，以获得含有足够数量的噬菌体的溶液。将最终离心得到的上清液使用0.45μm过滤器过滤，然后采用常规聚乙二醇(peg)沉淀工艺。具体地，将peg和nacl添加到100ml滤液中，直到达到10％ peg 8000/0.5m nacl，然后在4℃下放置2-3小时。此后，以8,000rpm离心30分钟以获得噬菌体沉淀。将所得噬菌体沉淀悬浮于5ml缓冲液中(10mm tris-hcl、10mm mgso4、0.1％明胶、ph 8.0)。所得材料称为噬菌体悬浮液或噬菌体溶液。
62.因此，收集上述纯化的纯噬菌体，命名为噬菌体esc-cop-15，然后于2019年11月15日保藏在韩国生命工学研究院(korea research institute of bioscience and biotechnology)的韩国典型培养物保藏中心(korea collection for type culture)(保藏号：kctc 14027bp)。
63.实施例2：噬菌体esc-cop-15基因组的分离和序列分析
64.噬菌体esc-cop-15的基因组如下进行分离。从使用与实施例1相同的方法获得的噬菌体悬浮液中分离基因组。首先，为了去除悬浮液中包含的大肠杆菌的dna和rna，将200u的脱氧核糖核酸酶i(dnase i)和核糖核酸酶a(rnase a)分别添加到10ml噬菌体悬浮溶液中，然后在37℃放置30分钟。静置30分钟后，为了停止脱氧核糖核酸酶i(dnase i)和核糖核酸酶a(rnase a)的活性，向其中加入500μl的0.5m乙二胺四乙酸(edta)，然后静置10分钟。此外，将所得混合物进一步在65℃放置10分钟，然后向其中加入100μl蛋白酶k(20mg/ml)以破坏噬菌体的外壁，随后在37℃反应20分钟。之后，向其中加入500μl 10％十二烷基硫酸钠(sds)，然后在65℃反应1小时。反应1小时后，向反应溶液中加入10ml以25:24:1的组分比混合的苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液，然后彻底混合。此外，将所得混合物以13,000rpm离心15分钟以分离成多层。在分离的层中，选择上层，并以1.5的体积比向其中加入异丙醇，随后以13,000rpm离心10分钟以沉淀基因组。收集沉淀物后，向沉淀物中加入70％乙醇，然后以13,000rpm离心10分钟以洗涤沉淀物。回收洗涤的沉淀物，真空干燥，然后溶于100μl水中。重复该过程以获得足够量的噬菌体esc-cop-15的基因组。
65.通过使用来自首尔国立大学环境管理国家仪器中心(national instrumentation center for environmental management,seoul national university)的illumina mi-seq设备进行下一代测序分析，获得了上述获得的噬菌体esc-cop-15基因组序列信息。最终分析的噬菌体esc-cop-15的基因组大小为152,531bp，全基因组序列由seq id no:1表达。
66.使用blast调查对上述获得的噬菌体esc-cop-15基因组序列与先前报道的噬菌体基因组序列的同源性(相似性)进行了研究，发现噬菌体esc-cop-15的基因组序列与大肠杆菌噬菌体esco13(基因库登录号kx552041.2)的序列具有相对高的同源性(同一性：79％)。然而，噬菌体esc-cop-15基因组上的开放阅读框(open reading frame)(orf)数量为292，而大肠杆菌噬菌体esco13具有282个开放阅读框，与噬菌体esc-cop-9不同。
67.根据这一结果，可以得出结论，噬菌体esc-cop-15一定是一种不同于传统报道的噬菌体的新型噬菌体。此外，由于噬菌体的抗菌强度和抗菌谱通常取决于噬菌体的类型，因此认为噬菌体esc-cop-15可以提供不同于先前报道的任何其他噬菌体的抗菌活性。
68.实施例3：噬菌体esc-cop-15的主要结构蛋白的分析
69.进行一维电泳以分析噬菌体esc-cop-15的主要结构蛋白。为了获得组成噬菌体esc-cop-15外壁的蛋白质，将200μl的实施例1中制备的噬菌体悬浮液与800μl丙酮混合，并剧烈旋转。混合物在-20℃下静置10分钟。以13,000rpm在4℃离心20分钟以除去上清液，然后空气干燥。将沉淀物重新悬浮在50μl电泳样本缓冲液(5
×
)中，然后将其煮沸5分钟。通过一维电泳分析制备的样本。因此，如图2所示，确认了大小约为13kda、35kda、100kda和157kda的主要结构蛋白。
70.实施例4：噬菌体esc-cop-15杀灭致病性大肠杆菌能力的研究
71.研究了噬菌体esc-cop-15杀灭致病性大肠杆菌的能力。为了研究杀灭能力，以与实施例1中所述相同的方式使用斑点试验观察透明区的形成。将总共6株已鉴定为pks阳性的大肠杆菌菌株(其为pks基因组岛的阳性载体)用作致病性大肠杆菌以研究杀灭能力。噬菌体esc-cop-15具有裂解和杀灭作为实验目标的6株致病性大肠杆菌中总共5株的能力。其实验结果示于表1中，代表性结果示于图3中。
72.[表1]噬菌体esc-cop-15的抗菌活性测试
[0073][0074][0075]
同时，也在单独的实验中研究了噬菌体esc-cop-15对支气管败血症博代氏杆菌(bordetella bronchiseptica)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)、屎肠球菌(enterococcus faecium)、缓症链球菌(streptococcus mitis)、乳房链球菌(streptococcus uberis)和铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的杀灭能力。结果，噬菌体esc-cop-15不具有杀灭这些细菌的能力。
[0076]
因此，证实噬菌体esc-cop-15具有较强的杀灭致病性大肠杆菌的能力和针对致病性大肠杆菌的广谱抗菌谱，这表明噬菌体esc-cop-15可以用作用于预防和致病性大肠杆菌感染的组合物的活性成分。
[0077]
实施例5：噬菌体esc-cop-15的生长特性
[0078]
噬菌体esc-cop-15的生长特性通过一步生长曲线分析进行分析。噬菌体esc-cop-15的一步生长曲线分析如下进行：将50ml tsb(胰酶大豆肉汤，difco)培养基以1/1000的比例接种大肠杆菌，然后振荡培养直至指数期(od
600
＝0.3～0.4)。培养完成后，以8,000rpm离心5分钟，回收细菌细胞沉淀物。将回收的沉淀物悬浮在50ml tsb中。所得材料可称为细菌悬浮液。将噬菌体esc-cop-15与细菌悬浮液以0.1的感染复数(moi)混合，并在室温下培养10分钟，然后以12,000rpm离心30秒。除去上清液后，将含有噬菌体感染的细菌细胞的沉淀物悬浮于50ml tsb中，并在37℃振荡培养。在60分钟内以5分钟间隔取等分试样，并立即通过常规噬菌斑测定法测定等分试样中的滴度(图4)。
[0079]
噬菌体esc-cop-15的潜伏期估计约为35
±
5分钟，平均裂解量约为110
±
10pfu/感染细胞。
[0080]
实施例6：关于使用噬菌体esc-cop-15预防致病性大肠杆菌感染的实验实施例
[0081]
将100μl噬菌体esc-cop-15悬浮液(1
×
108pfu/ml)加入含有9ml tsb培养基的试管中。在含有9ml tsb培养基的另一试管中，仅进一步添加相同量的tsb培养基。然后将致病性大肠杆菌(pks阳性菌株ccarm 1g930)培养液添加到每个试管中，使得在600nm处的吸光度达到约0.5。添加致病性大肠杆菌后，将试管转移到37℃的培养箱中，然后进行振荡培养，在此期间观察致病性大肠杆菌的生长。如表2所示，观察到在添加了噬菌体esc-cop-15悬浮液的试管中抑制了致病性大肠杆菌的生长，而在未添加噬菌体悬浮液的试管中没有抑制致病性大肠杆菌的生长。
[0082]
[表2]噬菌体esc-cop-15的细菌生长抑制试验
[0083][0084]
上述结果表明，本发明的噬菌体esc-cop-15不仅抑制致病性大肠杆菌的生长，而且具有杀灭致病性大肠杆菌的能力。因此，得出结论，噬菌体esc-cop-15可用作用于预防致病性大肠杆菌感染的组合物的活性成分。
[0085]
实施例7：噬菌体esc-cop-15对动物模型中大肠杆菌感染的预防作用
[0086]
研究了噬菌体esc-cop-15对受大肠杆菌影响的断奶仔猪的预防作用。将4头25日龄断奶仔猪组在一起；每个猪圈(1.1m
×
1.0m)共饲养2组猪。提供加热系统，并控制周围环境。始终控制猪圈的温度和湿度，每天清洁地板。从实验的第1天开始，按照常规饲料供应步骤向实验组的猪(添加噬菌体)喂食添加了1
×
108pfu/g的噬菌体esc-cop-15的饲料，同时按照常规步骤向对照组的猪(不添加噬菌体)喂食不添加噬菌体esc-cop-15的相同的饲料。从实验第7天开始，两组的饲料均被1
×
108cfu/g致病性大肠杆菌污染2天，然后分别为实验
组和对照组每天提供两次，以引起致病性大肠杆菌感染。给药的致病性大肠杆菌悬浮液制备如下：使用tsb培养基在37℃培养致病性大肠杆菌(菌株ccarm 1g931)18小时，之后分离细菌并使用生理盐水(ph 7.2)将细菌调节至109cfu/ml。从提供受污染饲料2天后的第二天(实验的第9天)开始，实验组(添加噬菌体)的猪按照之前的常规饲料供应步骤再次喂食添加了1
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108pfu/g噬菌体esc-cop-15且不污染致病性大肠杆菌的饲料，而对照组(不添加噬菌体)的猪按照常规步骤喂食不添加噬菌体的相同饲料。从实验第9天开始，每天检查所有试验动物的腹泻情况。通过根据腹泻指数进行测量来确定腹泻程度。腹泻指数采用常用的粪便稠度(fc)评分来测量(正常：0，软便：1，轻度腹泻(loose diarrhea)：2，严重腹泻：3)。结果如表3所示。
[0087]
[表3]粪便稠度评分
[0088][0089]
从上述结果可以证实，本发明的噬菌体esc-cop-15可以非常有效地抑制致病性大肠杆菌的感染。
[0090]
实施例8：使用噬菌体esc-cop-15致病性大肠杆菌的传染性疾病的实施例
[0091]
噬菌体esc-cop-15对致病性大肠杆菌引起的疾病的效果评估如下：将40只8周龄小鼠分为两组，每组20只小鼠，然后将每组5只小鼠的亚组分别饲养在单独的实验鼠笼中，实验进行7天。在实验的第二天，通过腹腔注射向所有小鼠给药0.1ml致病性大肠杆菌悬浮液。给药的致病性大肠杆菌悬浮液制备如下：使用tsb培养基在37℃培养致病性大肠杆菌(菌株ccarm 1g931)18小时，之后分离细菌并使用生理盐水(ph 7.2)将细菌调节至109cfu/ml。在给药致病性大肠杆菌后2小时，通过腹腔注射给实验组小鼠(用噬菌体悬浮液给药)给药109pfu的噬菌体esc-cop-15。通过腹膜内注射给对照组小鼠(不给药噬菌体悬浮液)给药0.1ml盐水。对照组和实验组均同等喂食饲料和饮用水。从给药致病性大肠杆菌开始直到试验结束，每天观察小鼠是否存活。结果如下表4所示。
[0092]
[表4]存活率
[0093][0094]
从上述结果可以明显地得出结论，本发明的噬菌体esc-cop-15在致病性大肠杆菌引起的疾病方面非常有效。
[0095]
本领域技术人员将认识到，上述描述中公开的概念和具体实施方式可以容易地用作改进或设计其他实施方式以实现本发明的相同目的的基础。本领域技术人员还将理解，这样的等效实施方式不脱离所附权利要求中所述的本发明的精神和范围。
[0096]
本领域技术人员将清楚，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明
进行各种改进和变化。因此，本发明旨在覆盖本发明的改进和变化，只要它们在所附权利要求及其等价物的范围内。
[0097]
保藏号
[0098]
保藏机构名称：kctc
[0099]
保藏号：kctc 14027bp
[0100]
保藏日期：20191115

技术特征：

1. 一种用于预防或由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的组合物，包括：具有裂解致病性大肠杆菌的能力的肌尾噬菌体科噬菌体，和药学上可接受的载体。2. 根据权利要求1所述的组合物，其中肌尾噬菌体科噬菌体包括如seq id no:1所述的序列。3. 根据权利要求1所述的组合物，其中肌尾噬菌体科噬菌体的浓度为1
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10
1 pfu/ml至1
×
10
30 pfu/ml或1
×
10
1 pfu/g至1
×
10
30
pfu/g。4. 根据权利要求3所述的组合物，其中肌尾噬菌体科噬菌体的浓度为1
×
10
4 pfu/ml至1
×
10
15
pfu/ml或1
×
104pfu/g至1
×
10
15
pfu/g。5.根据权利要求1所述的组合物，其中药学上可接受的载体是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油。6.根据权利要求1所述的组合物，还包括：选自由润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂组成的组的一个或多个。7.根据权利要求1所述的组合物，其中致病性大肠杆菌是肠出血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌或致癌性大肠杆菌。8.根据权利要求1所述的组合物，其中感染或疾病是食物中毒、胃肠炎、腹泻、尿路感染、新生儿脑膜炎、溶血性尿毒症综合征、腹膜炎、乳腺炎、败血症、革兰氏阴性肺炎、志贺氏菌病、痢疾或癌症。9.根据权利要求1所述的组合物，其中组合物是溶液、悬浮液、油乳剂、水溶性介质、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊。10. 根据权利要求1所述的组合物，其中肌尾噬菌体科噬菌体具有20-70分钟的潜伏期和80-200 pfu/感染细胞的裂解量。11. 根据权利要求1所述的组合物，其中潜伏期为35-40分钟，裂解量为110-120 pfu/感染细胞。12.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括：具有裂解致病性大肠杆菌或非大肠杆菌细菌菌种的能力的第二噬菌体。13. 一种用于预防或由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的方法，包括：向受试者给药肌尾噬菌体科噬菌体；以及用肌尾噬菌体科噬菌体裂解致病性大肠杆菌。14. 根据权利要求13所述的方法，其中肌尾噬菌体科噬菌体包括如seq id no:1所述的序列。15. 根据权利要求13所述的方法，其中肌尾噬菌体科噬菌体的浓度为1
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10
1 pfu/ml至1
×
10
30 pfu/ml或1
×
10
1 pfu/g至1
×
10
30 pfu/g。16. 根据权利要求15所述的方法，其中肌尾噬菌体科噬菌体的浓度为1
×
10
4 pfu/ml至1
×
10
15 pfu/ml或1
×
10
4 pfu/g至1
×
10
15 pfu/g。

技术总结

一种用于预防或由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的组合物，包括具有裂解致病性大肠杆菌的能力的肌尾噬菌体科噬菌体和药学上可接受的载体。一种用于预防或由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的方法，包括向受试者给药肌尾噬菌体科噬菌体以及用肌尾噬菌体科噬菌体裂解致病性大肠杆菌。科噬菌体裂解致病性大肠杆菌。科噬菌体裂解致病性大肠杆菌。