一种三层复合结构胶原蛋白基人工皮肤及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种三层复合结构胶原蛋白基人工皮肤及其制备方法。

背景技术：

2.皮肤是人体最大的器官，能够有效保护身体的组织和器官免受外界因素的伤害。皮肤能够为人体提供重要的生理功能，包括体温调节、水合作用、排汗和维生素d的合成等。皮肤的严重破坏将会导致机体关键功能的损害，进而导致并发症，甚至严重时可能会导致死亡。由于烧烫伤、皮肤溃疡等事故或疾病引起皮肤大面积损伤时，皮肤无法自我修复，需要通过皮肤移植手术进行。皮肤缺损的关键是促进创面的愈合，防止内环境的紊乱及微生物感染造成并发症。皮肤缺损的传统方法中，自体皮肤移植物来源有限，而异体皮肤移植物则存在免疫排斥、疾病传播和伦理等问题。
3.利用组织工程构建具有类似正常皮肤结构和功能的人工皮肤，在修复大面积全层皮肤缺损中备受关注。胶原蛋白基人工皮肤，具有良好的组织再生能力、高生物相容性、低细胞毒性、低免疫排斥等优点，在组织工程人工皮肤领域具有巨大的开发潜力。单层胶原蛋白基人工皮肤难以模拟全层皮肤结构，并且存在机械性能差、交联剂残留毒性等缺点。因此，构建具有良好机械性能和生物相容性，并能修复全层皮肤缺损的人工皮肤，意义重大。发明专利cn104984407b公开了一种组织工程人工皮肤及其制备方法，该人工皮肤包括表皮层和真皮层，表皮层为胶原蛋白或胶原蛋白与壳聚糖的共混材料，真皮层为胶原蛋白或胶原蛋白与壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、海藻酸盐或聚乙烯醇的共混材料，存在机械强度欠佳的风险；发明专利cn106853263a公开了一种双层人工皮肤及其制备方法，上层为表面修饰有纳米银的硅橡胶膜，下层为胶原复合物膜，上、下层通过硅凝胶粘合在一起。
4.发明人在研究的过程中意外的发现了一种方法，通过所述方法一步制备双层支架层，包括胶原膜层-胶原海绵层，使用所述的双层支架层制备三层复合结构的胶原蛋白基人工皮肤。所述人工皮肤具有类似正常皮肤的结构、良好的机械性能和高生物相容性，胶原膜在组织修复中发挥良好的二次屏障作用。所述人工皮肤对全层皮肤缺损有优异的修复效果，在皮肤医学、组织修复用制品等领域有广泛的应用前景。

技术实现要素：

5.具体方案如下：
6.本发明的首要目的是提供一种三层复合结构胶原蛋白基人工皮肤，所述的人工皮肤包括硅胶膜层和双层多孔支架层，所述的双层多孔支架层包括胶原膜层-胶原海绵层，三层结构从上至下分别为硅胶膜层-胶原膜层-胶原海绵层，所述的硅胶膜层厚度为0.3-1mm，所述的胶原膜层厚度为0.4-10μm，所述的胶原海绵层的厚度为1.5-5mm，总厚度为1.8-7mm。
7.优选的，所述的胶原海绵层的孔隙率为76-90％，所述胶原海绵层具有三维多孔结构，平均孔径大小为60-150μm，所述的胶原膜层无孔径。
8.优选的，所述的双层多孔支架层由以下重量份的原料通过程序冻干、梯度升温制备得到：83～93wt％胶原和7-17wt％粘多糖；
9.所述的程序冻干，将模具放置在冷冻干燥机中，从室温冷却至-35℃，恒温冷冻8-24h；
10.所述的梯度升温，以5℃/h的升温速率，将材料从-35℃升温至-20℃；以0.78℃/h升温速率，从-20℃升温至-15℃，保温1h；以2℃/h升温速率，从-15℃升温至-5℃；以7.5℃/h升温速率，从-5℃升温至25℃，保温真空干燥16h。
11.优选的，所述胶原蛋白为ⅰ型胶原蛋白；所述粘多糖为硫酸软骨素和/或透明质酸。
12.本发明的第二目的是提供所述的人工皮肤的制备方法，包括如下步骤：
13.(1)使用醋酸溶液分别溶解并配制胶原蛋白和粘多糖溶液，在搅拌下，按照比例将粘多糖溶液逐滴缓慢加入胶原溶液，搅拌均匀；
14.(2)将步骤(1)中配置的溶液真空除泡，去除有气泡部分；将材料均匀平铺在聚乙烯模具中，程序冻干，梯度升温，得到双层多孔支架材料；
15.所述的程序冻干，将模具放置在冷冻干燥机中，从室温冷却至-35℃，恒温冷冻8-24h；
16.所述的梯度升温，以5℃/h的升温速率，将材料从-35℃升温至-20℃；以0.78℃/h升温速率，从-20℃升温至-15℃，保温1h；以2℃/h升温速率，从-15℃升温至-5℃；以7.5℃/h升温速率，从-5℃升温至25℃，保温真空干燥16h；
17.(3)将步骤(2)得到的双层多孔支架材料热脱氢处理24h，降温至室温后，双重交联，洗涤，冷冻干燥，得到双层多孔支架层；
18.(4)将硅胶的a、b组分按1:1的比例混合均匀，搅拌，真空脱泡，将混合硅胶平铺至步骤(3)得到的双层多孔支架层的胶原膜层上，固化硅胶，得到人工皮肤。
19.优选的，步骤(3)所述的所述双重交联，是双层多孔支架层通过物理方法、化学方法或两者结合的方法进行交联后形成的。
20.优选的，步骤(3)所述的交联是将双层多孔支架材料浸入40％乙醇溶液配置的edc-nhs溶液中，在37℃恒温箱内交联12h，edc含量为50mmol/l，edc/nhs的摩尔比为5：1，洗涤是先用40％乙醇洗2次，后使用超纯水清洗3-4次。
21.本发明的第三目的是提供所述的人工皮肤在制备组织修复用制品中的应用。
22.本发明的第四目的是提供一种由所述的人工皮肤制得的组织修复用制品。
23.优选的，所述组织修复用制品为疝气修复补片、女性盆底功能障碍性疾病修复系统、人工肩袖、硬脑膜修复补片、脊膜修复补片、心包膜补片、人工牙膜、创伤修复产品、烧伤修复产品、瘘创面修复产品、填塞产品或脏器创面修复产品。
24.本发明的有益效果是：
25.(1)本发明提供了一种通过程序冻干、梯度升温的方法制备得到的双层多孔支架层，所述的双层多孔支架层为胶原膜层-胶原海绵层，包括具有致密结构的胶原膜层和均一网状结构的胶原海绵层；
26.(2)本发明利用所述的双层多孔支架层制备得到三层结构的人工皮肤，具有良好的机械性能和溶胀、溶失性能，为创伤修复提供了运输营养和代谢产物的作用；具有良好的拉伸强度，可适用于与机体的缝合；具有良好的抗酶解能力和生物降解性，在修复创面早期
能够防止伤口回缩，并在伤口修复后发生生物降解，避免二次清创和材料残留的问题；
27.(3)本发明所述的双层多孔支架材料，具有高生物相容性和低细胞毒性，克服了戊二醛交联制备得到的人工皮肤存在的交联剂残留导致的细胞毒性问题；具有良好的内部孔隙结构，为细胞生长提供良好的支架，促进细胞的增殖和粘附；
28.(4)本发明所述的胶原膜层可发挥良好的层间隔离作用，有效防止外层硅胶材料渗透浸入真皮层，从而更好的保护人工皮肤真皮层内环境的稳定，促进细胞浸润与生长；
29.(5)本发明所述的人工皮肤无致热性，血液相容性好，表明其具有良好的生物安全性；
30.(6)本发明所述的人工皮肤，对全层皮肤缺损有优异的修复效果，在皮肤医学、组织修复用制品等领域有广泛的应用潜力。
附图说明
31.图1胶原蛋白基人工皮肤制备的流程图
32.图2不同冷冻程序制备的双层多孔支架层的sem表征
33.图3胶原蛋白基人工皮肤的结构表征
34.(a)人工皮肤下层真皮层宏观观察，(b)人工皮肤弯折宏观观察，(c)pbs溶液中保存的人工皮肤，(d)、(g)人工皮肤三层结构的sem表征，(e)、(h)人工皮肤多孔海绵的sem表征，(f)胶原膜层的sem表征，(i)双层多孔支架层(胶原海绵层与胶原膜层)的sem表征。
35.图4胶原蛋白基人工皮肤真皮层的理化性质
36.(a)傅立叶变换红外分析(ftir)，(b)交联度，(c)溶失率，(d)溶胀，(e)拉伸强度，(f)抗酶解能力。
37.图5胶原蛋白基人工皮肤的生物相容性和生物活性
38.(a)细胞毒性，(b)细胞增殖，(c)细胞黏附，(d)活细胞/死细胞染，(e)细胞在浸提液中的生长形态，(f)细胞在材料上的生长形态，(g)细胞在材料中的迁移。
39.图6胶原蛋白基人工皮肤的生物安全性
40.(a)热原实验，(b)溶血实验。
41.图7胶原蛋白基人工皮肤的创面修复性能
42.(a)创面观察，(b)he染，(c)masson染。
具体实施方式
43.以下实施例，进一步的详细说明本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步的理解本发明，而不构成对其权利的限制。
44.实施例一、三层结构的胶原蛋白基人工皮肤的制备
45.制备方法1：
46.使用醋酸溶液分别溶解并配制ⅰ型胶原蛋白和硫酸软骨素母液。在搅拌下，将硫酸软骨素母液逐滴缓慢加入ⅰ型胶原蛋白溶液，并加入适量醋酸溶液稀释使溶液最终浓度胶原的含量为5mg/ml，硫酸软骨素含量为1mg/ml，之后再进行搅拌使溶液均匀。将上述步骤中配置的溶液于真空干燥箱中真空除泡，去除上方有气泡部分。将材料均匀平铺在聚乙烯模具中，在冷冻干燥机中，梯度升温，程序冻干，得到双层多孔支架材料。材料移至真空干燥箱
内，110℃热脱氢处理。材料自然降温至室温后，浸入edc-nhs溶液(edc-nhs溶液中，edc含量为50mmol/l，edc/nhs的摩尔比为5：1)中交联。之后清洗材料残留交联剂，再次冷冻干燥，得到双层多孔支架层。在室温条件下，将硅胶的a、b组分按1:1的比例均匀混合在一起，300rpm下搅拌10min，真空脱泡。之后将混合硅胶均匀平铺至双层多孔支架层的胶原膜层上方，60℃固化硅胶3h。灭菌处理后，胶原蛋白基人工皮肤浸入pbs溶液中保存。
47.制备方法2：
48.使用醋酸溶液分别溶解并配制ⅰ型胶原蛋白和硫酸软骨素母液。在搅拌下，将硫酸软骨素母液逐滴缓慢加入ⅰ型胶原蛋白溶液，并加入适量醋酸溶液稀释使溶液最终浓度胶原的含量为5mg/ml，胶原蛋白与硫酸软骨素含量比12.5:1，之后再进行搅拌使溶液均匀。将上述步骤中配置的溶液于真空干燥箱中真空除泡，去除上方有气泡部分。将材料均匀平铺在聚乙烯模具中，在冷冻干燥机中，梯度升温，程序冻干，得到双层多孔支架材料。材料移至真空干燥箱内，110℃热脱氢处理。材料自然降温至室温后，浸入edc-nhs溶液(edc-nhs溶液中，edc含量为50mmol/l，edc/nhs的摩尔比为5：1)中交联。之后清洗材料残留交联剂，再次冷冻干燥，得到双层多孔支架层。在室温条件下，将硅胶的a、b组分按1:1的比例均匀混合在一起，300rpm下搅拌10min，真空脱泡。之后将混合硅胶均匀平铺至双层多孔支架层的胶原膜层上方，60℃固化硅胶3h。灭菌处理后，胶原蛋白基人工皮肤浸入pbs溶液中保存。
49.制备方法3：
50.所述人工皮肤的制备方法，包括以下步骤：
51.(1)使用0.5m醋酸溶液分别溶解并配制ⅰ型胶原蛋白和硫酸软骨素母液。在搅拌下，将硫酸软骨素母液逐滴缓慢加入ⅰ型胶原蛋白溶液，并加入适量0.5m醋酸溶液稀释使溶液最终浓度为ⅰ型胶原蛋白5mg/ml、硫酸软骨素0.67mg/ml。之后再进行搅拌使溶液均匀12h转速1200rpm。以上过程均在冰水浴中完成，温度不高于4℃。
52.(2)将上述步骤(1)中于真空干燥箱中真空除泡，去除上方有气泡部分。将材料均匀平铺在聚乙烯模具中，厚度在3-5mm。程序冻干：将模具放置在冷冻干燥机中，从室温冷却至-35℃，恒温冷冻10h。在之后真空冷冻干燥的过程中，梯度升温：以5℃/h的升温速率，将材料从-35℃升温至-20℃；以0.78℃/h升温速率，从-20℃升温至-15℃，保温1h；以2℃/h升温速率，从-15℃升温至-5℃；以7.5℃/h升温速率，从-5℃升温至25℃，保温真空干燥16h，得到双层多孔支架材料ccs。
53.(3)将步骤(2)中材料移至110℃预热真空干燥箱内，热脱氢处理24h。材料自然降温至室温后，得到dht处理材料dccs。浸入40％乙醇溶液配置的edc-nhs溶液(edc-nhs溶液中，edc含量为50mmol/l，edc/nhs的摩尔比为5：1)中交联，在37℃恒温箱内交联12h。之后清洗材料残留交联剂，先用40％乙醇洗2次，后使用超纯水清洗3-4次，再次冷冻干燥，得到双重交联处理后双层多孔支架edccs。
54.(4)在室温条件下，将硅胶的a、b组分按1:1的比例均匀混合在一起，300rpm下搅拌10min，真空脱泡。之后将混合硅胶均匀平铺至(3)双层多孔支架层的胶原膜层上方，60℃固化硅胶3h。灭菌处理，胶原蛋白基人工皮肤tlccs浸入pbs溶液中保存。
55.(5)灭菌处理后，胶原蛋白基人工皮肤浸入pbs溶液中保存。制备的流程图如图1所示。
56.对比例1：
57.其他的操作步骤与实施例一相同，步骤(2)中的程序冻干为将模具放置在冷冻干燥机中，从室温冷却至-20℃，恒温冷冻10h。
58.对比例2：
59.其他的操作步骤与实施例一相同，步骤(2)中的程序冻干为将模具放置在冷冻干燥机中，从室温冷却至-80℃，恒温冷冻10h。
60.对比例3：
61.其他的操作步骤与实施例一相同，步骤(2)中的程序冻干为-35℃进行10h预冻(与实施例一相同)，之后将模具置于冷冻干燥机中，在之后真空冷冻干燥的过程中，线性升温，以5℃/h的升温速率，将材料从-35℃升温至25℃,保温真空干燥32h，得到线性升温冻干的海绵材料。
62.对比例4：
63.其他的操作步骤与实施例一相同，将(2)中的程序冻干为-35℃进行10h预冻(与实施例一相同)，之后将模具置于普通冷冻干燥机中，在之后真空冷冻干燥的过程中，以室温冻干，真空干燥44h，得到常温冻干的海绵材料。
64.不同冷冻程序制备的双层多孔支架层的sem表征如图2所示。图2中a1-a4为对比例1制备得到的支架材料，其在-20℃程序冻干，底层为具有网孔结构的胶原海绵，但网孔不均一，且顶层形成的胶原膜层不完整，有大量孔隙存在；b1-b4为实施例一制备得到的支架材料，其底层为胶原海绵且网状结构大小均一，顶层形成的胶原膜层致密光滑且无孔隙；c1-c4为对比例2制备得到的支架材料，其在-80℃程序冻干，底层形成的胶原海绵层没有均一的网孔结构，顶层未形成完整的胶原膜层；d1-d4为对比例3制备得到的支架材料，底层为多孔海绵，顶层未形成胶原膜；e1-e4为对比例4制备得到的支架材料，底层为多孔海绵，顶层也未形成胶原膜。因此，线性升温和常温冻干均无法制备得到顶层具有胶原膜的双层支架材料。
65.实施例一中制备得到的胶原蛋白基人工皮肤的宏观结构及sem微观结构如图3所示。人工皮肤的海绵层为乳白均匀固体，如图(a)所示；硅胶膜层与胶原蛋白双层支架具有良好的界面结合，如图(b)所示；人工皮肤浸入pbs溶液中，呈乳白半透明固体，如图(c)所示。人工皮肤的sem图如3(d)和(g)所示，形成硅胶膜层-胶原膜层-胶原海绵层的三层复合结构，并具有良好的界面稳定性；多孔支架层的sem图如3(e)和(h)所示，形成胶原膜-海绵的双层结构，双层界面过渡自然，胶原膜层致密光滑；海绵层的sem图如3(f)和(i)所示，呈相互连通的多孔结构，孔隙均匀分布，孔隙平均大小为92.44μm。该孔隙结构可提高人工皮肤的吸水容量，并为细胞提供有益的生长条件。
66.实施例二、双层多孔支架层的理化性能表征
67.1.样品制备。
68.edccs：双重交联制备的双层多孔支架层，具体制备方法参照实施例一。
69.control：传统戊二醛交联制备的支架材料，具体制备方法如下：
70.配制ⅰ型胶原蛋白和硫酸软骨素混合溶液步骤与实施例一相同。配制混合溶液后保持转速1200rpm。取50％戊二醛溶液，使用0.5m醋酸溶液稀释，缓慢逐滴滴加至溶液中，使戊二醛终浓度为0.5％。滴加完成后，撤出冰水浴，保持搅拌，在室温中交联4h后，真空干燥箱中真空除泡，去除上方有气泡部分。将材料均匀平铺在聚乙烯模具中，将模具放置在冷冻
干燥机中，梯度预冻及升温程序与实施例一中相同，得到传统戊二醛制备支架材料。
71.eccs：传统edc-nhs交联制备的支架材料，具体制备方法如下：
72.配制ⅰ型胶原蛋白和硫酸软骨素混合溶液步骤与实施例一相同。配制混合溶液后保持转速1200rpm。取edc-nhs溶液，使用0.5m醋酸溶液配制，缓慢逐滴滴加至(1)中溶液中，使edc-nhs终浓度为50mmol/l，edc/nhs的摩尔比为5:1，并调节溶液ph至5.5。滴加完成后，撤出冰水浴，保持搅拌，在室温中交联12h后，真空干燥箱中真空除泡，去除上方有气泡部分。将材料均匀平铺在聚乙烯模具中，将模具放置在冷冻干燥机中，梯度预冻及升温程序与实施例一中相同，得到传统edc-nhs交联制备支架材料。
73.dccs：热脱氢交联制备的支架材料：
74.配制ⅰ型胶原蛋白和硫酸软骨素混合溶液步骤与实施例一相同，后采取热脱氢交联制备支架材料；
75.ccs：未交联处理制备的双层多孔支架材料：
76.配制ⅰ型胶原蛋白和硫酸软骨素混合溶液步骤与实施例一相同。
77.2.傅立叶变换红外分析(ftir)
78.截取小块胶原蛋白基人工皮肤样品，在研钵中剪碎，研磨后与kbr混合均匀，在压片机中压为透明薄片，用nexus 670型红外光谱仪测其红外扫描图谱，扫描范围4000～400cm-1，分析数据。
79.3.交联度
80.将5mg未交联与交联的双层多孔支架层加入1ml 4％(w/v)的nahco3溶液中30分钟。然后加入1ml新制备的0.5％(v/v)的tnbs去离子水，在40℃水浴中孵育2小时。加入3ml6m盐酸终止反应，并在60℃孵育90分钟以溶解胶原蛋白。将混合物用5毫升去离子水稀释并冷却到室温。对照(空白样品)除在加入tnbs之前加入盐酸外，均按上述程序进行。将每个溶液300μl转移到96孔板上，用微孔板分光光度计(synergytm 2，biotek，usa)在345nm处记录吸光度。由以下公式计算材料的交联度cd(％)。
[0081][0082]
式中odc为交联双层多孔支架层的吸光度；odn为未交联的吸光度；odb为空白对照组的吸光度。
[0083]
4.溶失率测定
[0084]
称取少量双层支架材料在干燥器中干燥至恒重，然后在10ml离心管中称取材料的初始重量m1(g)，加入超纯水。将37℃的恒温培养箱预热30min，按顺序将材料放入其中，恒温持续振荡24h，220rpm。之后离心，将残留的材料冷冻干燥，在干燥器中干燥至恒重，称取最终重量m2(g)。依公式2-2计算可得溶失率d(％)。其中ccs、dccs和control作为参比对照。
[0085][0086]
5.溶胀性能
[0087]
称取材料质量m0(g)，放入一定体积的去离子水当中，保证水能够完全浸没材料，置于37℃恒温水浴中。在一定时间的间隔点称取浸润后材料的的质量m
t
(g)，称重前用滤纸擦去材料表面多余的水分。按照公式2-3计算不同时间间隔点的溶胀比sr。
[0088][0089]
6.拉伸强度
[0090]
将材料剪成50
×
20mm的长方形，在室温，条件下用游标卡尺测其厚度，然后使用万能材料实验机测定其拉伸力学性能，设定参数拉伸速度为60mm/min，记录材料的宽度w(mm)、厚度d(mm)、断裂时的负荷f(n)。由公式计算材料的拉伸强度rm(kpa)。
[0091][0092]
7.体外可降解性能评价
[0093]
将经过去离子水浸泡过后冷冻干燥的样品在干燥器中平衡24h后，逐一称取10ml离心管质量m1(g)，离心管内分别加入样品后再次称量得样品初始质量与离心管质量和m2(g)，将上述材料编号。
[0094]
使用去离子水配制0.05mol/l磷酸钠缓冲液(即pbs缓冲溶液，ph为7.4)。称取ⅳ型胶原酶，并使用pbs溶液配制溶液并稀释至0.5u/ml的ⅳ型胶原酶溶液。
[0095]
将上述编号后的样品离心管中，加入0.5u/ml的ⅳ型胶原酶溶液，封口膜封口，于37℃，220rpm恒温振荡摇床上进行体外降解实验。在1、4、7、14、21、28d时各取出3份，每次离心并用去离子水小心地充分洗涤3次，确保材料不残留有酶与pbs溶液成分。然后将样品存放于-80℃冰箱中，待实验结束后一起放入冷冻干燥机内冷冻干燥，之后干燥器中存放24h后称得质量wt(g)。按公式分别计算质量降解率md(％)(mass degradation percentage，md)。
[0096][0097]
所述双层多孔支架层的理化性能表征如图4所示。dht与edc-nhs双重交联制备的多孔支架层的ftir表征如图4(a)所示，其具有酰胺ⅰ、ⅱ、ⅲ的特征吸收峰表明，双重交联的多孔支架层中的胶原蛋白保持完整的三螺旋结构。多孔支架层的交联度如图4(b)所示，dht交联支架材料dccs的交联度为34.7％，edc-nhs交联支架材料eccs的交联度为31.5％，而双重交联支架材料edccs的交联度为79％，表明dht与edc-nhs双重交联可显著提高支架材料的交联度。多孔支架层的溶失率如图(c)所示，ccs的溶失率高达46.8％，dht交联的dccs和ga交联的control的溶失率分别为18.9％和17.9％，而双重交联的edccs的溶失率为15.9％，表明edccs的空间结构保持良好的稳定性，有利于伤口修复过程中细胞的浸润与迁移。多孔支架层的溶胀比如图4(d)所示，ccs在2h左右达到溶胀平衡，交联的支架材料dccs、edccs和control在6h左右达到溶胀平衡。未交联的ccs最终溶胀比仅为33，dht交联的dccs和ga交联的control分别为72和58，而双重交联的edccs则可达到95，表明edccs具有良好的溶胀性能，可以为伤口修复提供湿润的内环境，并可吸收创面渗出物。
[0098]
多孔支架层的拉伸强度如图4(e)所示，未交联的ccs抗拉伸性能较差，拉伸强度仅为30.96kpa；交联后的dccs和edccs，拉伸强度分别提高到40.33kpa和50.78kpa；与ccs、dccs和control相比，双重交联的edccs具有良好的拉伸强度，适宜于与机体的缝合。多孔支架层的体外可降解性能如图4(f)所示，在含有胶原酶的pbs溶液中，未交联的ccs第1天即几乎完全降解，质量降解率md为86.27％；ga交联的control第28天的质量降解率md为62.44％，双重交联的edccs第28天的质量降解率md为40.37％，表明双重交联的edccs具有
良好的抗酶解能力和生物降解性，在修复创面早期能够防止伤口回缩，内部孔隙结构能为细胞提供适宜的生长环境，并在伤口修复后发生生物降解，避免二次清创和材料残留的问题，更有利于皮肤创面修复再生。这些结果表明，所述双层多孔支架层edccs具有良好的机械性能、溶胀性能、稳定性和生物降解性。
[0099]
实施例三、三层复合结构的胶原蛋白基人工皮肤的生物活性
[0100]
1.胶原蛋白基人工皮肤的制备
[0101]
使用醋酸溶液分别溶解并配制ⅰ型胶原蛋白和硫酸软骨素母液。在搅拌下，将硫酸软骨素母液逐滴缓慢加入ⅰ型胶原蛋白溶液，并加入适量醋酸溶液稀释使溶液最终浓度胶原的含量为88wt％，硫酸软骨素含量为12wt％，之后再进行搅拌使溶液均匀。将上述步骤中配置的溶液于真空干燥箱中真空除泡，去除上方有气泡部分。将材料均匀平铺在聚乙烯模具中，在冷冻干燥机中，梯度升温，程序冻干，得到双层多孔支架材料。材料移至真空干燥箱内，110℃热脱氢处理。材料自然降温至室温后，浸入edc-nhs溶液(edc-nhs溶液中，edc含量为50mmol/l，edc/nhs的摩尔比为5：1)中交联。之后清洗材料残留交联剂，再次冷冻干燥。在室温条件下，将硅胶的a、b组分按1:1的比例均匀混合在一起，300rpm下搅拌10min，真空脱泡。之后将混合硅胶均匀平铺至双层多孔支架层的胶原膜层上方，60℃固化硅胶3h。灭菌处理后，胶原蛋白基人工皮肤浸入pbs溶液中保存。
[0102]
以下实验中将双重交联的双层多孔支架层表示为“edccs”，传统戊二醛制备支架材料表示为对照组“control”，ⅰ型胶原制备支架材料表示为“col”，将三层复合结构胶原基人工皮肤表示为“tlccs”，除去胶原膜层的胶原基人工皮肤表示为“tlccs
‑”
。
[0103]
2.细胞毒性
[0104]
在无菌状态下，将材料分别在紫外灯下照射48h灭菌。将材料分别以2mg/ml的浸提浓度，在含有10％牛血清的dmem高糖培养液中密封，在37℃恒温摇床中220rpm进行浸提24h后得到材料浸提液备用。将100μl成纤维细胞悬液接种至96孔板，将其置于温度37℃恒温恒湿培养箱，培养24h。待细胞完全贴壁伸展，吸出培养液，使用pbs溶液清洗两次，加入100μl各材料浸提液，对照组加入100μl含有10％牛血清的dmem高糖培养液。在培养箱中培养24h、48h、72h后，使用cck-8染料进行染。吸出96孔板中的原培养液，使用pbs洗涤3次，再加入使用dmem培养液稀释至10％的cck-8染料，在37℃恒温恒湿培养箱孵育1h，使用酶标仪测定450nm波长下的吸光度。根据24h细胞存活率将材料的细胞毒性分级，可分为5级：0级(细胞存活率≥100)、1级(80≤细胞存活率≤99)、2级(50≤细胞存活率≤79)、3级(30≤细胞存活率≤49)、4级(0≤细胞存活率≤29)。材料细胞毒性等级为0或1级，合格；细胞毒性等级为2级，应结合细胞形态来对材料进行综合评价；细胞毒性等级为3～5级，不合格。
[0105]
3.活细胞死细胞染成像
[0106]
用胰酶消化培养皿中的l929成纤维细胞，并进行细胞计数。将1ml成纤维细胞悬液接种至激光共聚焦培养皿，将其置于温度37℃恒温恒湿培养箱，培养24h。待细胞完全贴壁伸展，吸出培养液，使用pbs溶液清洗两次，加入1ml各材料浸提液，每三天更换一次浸提液。分别培养至1、4、7天时，用hoechst33342/pi染料染，观察不同浸提液对细胞的影响。在激光共聚焦显微镜下使用490nm激发检测到活细胞(黄绿荧光)和死细胞(红荧光)，另外使用545nm观察死细胞(红荧光)。
[0107]
4.细胞增殖
[0108]
将100μl成纤维细胞悬液接种至96孔板，将其置于温度37℃恒温恒湿培养箱培养24h。待细胞完全贴壁伸展，吸出培养液，使用pbs溶液清洗两次，加入100μl各材料浸提液，每三天更换一次浸提液。对照组加入100μl含有10％牛血清的dmem高糖培养液，每三天更换一次。分别培养至1、4、7天时使用cck-8染料进行染。吸出96孔板中的原培养液，使用pbs洗涤3次，再加入使用dmem培养液稀释至10％的cck-8染料，在37℃恒温恒湿培养箱孵育，使用酶标仪测定450nm波长下的吸光度。
[0109]
5.细胞在浸提液中的生长形态
[0110]
用胰酶消化培养皿中的l929成纤维细胞，并进行细胞计数。将1ml成纤维细胞悬液接种至激光共聚焦培养皿，培养24h。待细胞完全贴壁伸展，吸出培养液，使用pbs溶液清洗两次，加入1ml各材料浸提液，培养4天后使用hoechst 33258(ex/em＝360nm/465nm)和鬼笔环肽-四甲基罗丹明异硫氰酸酯(ex/em＝540nm/570nm)染料染观察不同浸提液对细胞形态的影响，每三天更换一次浸提液。
[0111]
6.细胞黏附
[0112]
在无菌状态下，将相同体积、厚度的胶原海绵、多孔双层支架材料分别在紫外灯下照射48h灭菌，并放置于24孔板中备用，对照组为空白孔板组。用胰酶消化培养皿中的l929成纤维细胞，并进行细胞计数。将500μl成纤维细胞悬液接种至上述12孔板，将其置于温度37℃恒温恒湿培养箱，分别培养4、8h。吸去原培养液使用pbs溶液清洗3次，对照组不进行pbs溶液清洗。通过hoechst 33258溶液来测定黏附细胞的总脱氧核糖核酸定量比较材料的黏附细胞的能力。使用酶标仪测定激发波长360nm，发射波长465nm处的荧光强度，每个材料平行测定3次。其中空白组为dmem培养液，对照组细胞黏附率设定为100％，其余各材料的细胞黏附率为相对于对照组的百分含量。
[0113]
7.细胞在材料上的生长形态
[0114]
在无菌状态下，将厚度为3mm的edc交联多孔双层支架材料置于6孔板中，加入1ml 75％乙醇溶液，浸泡1h，更换75％乙醇溶液，再次浸泡1h，重复3次。吸去乙醇溶液，使用灭菌后的超纯水浸泡1h，更换新的灭菌超纯水，重复3-5次，充分清洗。将材料放在激光共聚焦培养皿中，胶原膜层向下。在超净台中自然晾干。将500μl成纤维细胞悬液接种至激光共聚焦培养皿，将其置于温度37℃恒温恒湿培养8h，再加入500μl dmem全培养基，每三天更换一次培养液。在培养箱中培养4d后，使用hoechst 33258(ex/em＝360nm/465nm)和鬼笔环肽-四甲基罗丹明异硫氰酸酯(ex/em＝540nm/570nm)染料染观察不同浸提液对细胞形态的影响。在激光共聚焦显微镜下荧光观察，使用360nm激发观察到细胞核(蓝荧光)，使用540nm激发观察到细胞质(红荧光)。
[0115]
8.细胞在人工皮肤内部的生长形态
[0116]
在无菌状态下，将灭菌后的胶原基置于6孔板中。细将500μl成纤维细胞悬液接种至人工皮肤，再加入500μl dmem全培养基，将其置于温度37℃恒温恒湿培养。每三天更换一次培养液。分别在3、7天将上述材料使用多聚甲醛溶液固定24h以上，之后常规石腊包埋处理，切片分别进行苏木精-伊红染(hematoxylin-eosin staining，he染)。
[0117]
所述胶原蛋白基人工皮肤的生物活性结果如图5所示，实验中使用l929成纤维细胞。双层多孔支架材料浸提液的细胞毒性结果如图5(a)，细胞增殖如图5(b)，活细胞/死细胞成像如图5(d)，细胞生长形态如图5(e)所示，双层支架材料edccs无细胞毒性，细胞可在
材料浸提液中大量增殖，并呈良好的伸展状态。双层多孔支架层的细胞黏附结果如图5(c)，其具有良好的细胞黏附能力；细胞在多孔支架材料上的形态如图5(f)所示，细胞能够在材料上黏附增殖，保持良好的长梭形形态，并且有向内层结构生长的趋势，有利于创面修复过程中的细胞的黏附和迁移；三层复合结构的胶原蛋白基人工皮肤的细胞迁移结果如图5(g)所示，细胞可成功迁移到双层多孔支架材料内部，并在海绵层上增殖生长；与无胶原膜层的对照组相比，胶原膜层可有效防止外层硅胶材料渗透浸入到海绵层中，能够起到层间隔离的作用，更好的保护人工皮肤的真皮层内环境的稳定，促进细胞浸润与生长。这些结果表明，所述胶原蛋白基人工皮肤具有良好的生物相容性和生物活性，能够有效促进细胞的黏附、增殖和迁移。
[0118]
实施例四、三层复合结构的胶原基人工皮肤的生物安全性
[0119]
1.双层多孔支架层的制备
[0120]
使用醋酸溶液分别溶解并配制ⅰ型胶原蛋白和硫酸软骨素母液。在搅拌下，将硫酸软骨素母液逐滴缓慢加入ⅰ型胶原蛋白溶液，并加入适量醋酸溶液稀释使溶液最终浓度胶原的含量为83～93wt％，硫酸软骨素含量为6～16wt％，之后再进行搅拌使溶液均匀。将上述步骤中配置的溶液于真空干燥箱中真空除泡，去除上方有气泡部分。将材料均匀平铺在聚乙烯模具中，在冷冻干燥机中，梯度升温，程序冻干，得到双层多孔支架材料。材料移至真空干燥箱内，110℃热脱氢处理。材料自然降温至室温后，浸入edc-nhs溶液(edc-nhs溶液中，edc含量为50mmol/l，edc/nhs的摩尔比为5：1)中交联。之后清洗材料残留交联剂，再次冷冻干燥。本实验中将双重交联的双层多孔支架层记为“edccs”，传统戊二醛制备支架材料作为对照组(control)进行比较。
[0121]
2.热原实验
[0122]
试验液制备：将胶原基人工皮肤真皮层部分与对照组材料真皮层分别浸提在0.9％氧化钠注射液中，(37
±
1)℃，(48
±
2)h，注射前需水浴加热至38℃。
[0123]
试验新西兰大白兔准备：3只，体重2.0～3.4kg，雌雄不限，测量直肠温度并记录，测量8次、30min/次，且最高与最低体温相差不超过0.4℃的大白兔为合格。
[0124]
按照国家标准gb/t 16886.11-2011《医疗器械生物学评价第11部分:全身毒性试验》的规定，按中华人民共和国药典2015年版四部通则1142热原检查法规定，使用家兔法对胶原基人工皮肤进行评价，确定胶原基人工皮肤的致热性。试验结果有效性判定标准：初试3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔升温总和低于1.3℃；或在复试5只家兔中，体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔不超过1只，且初试、复试合并8只家兔体温升高总和为3.5℃或低于3.5℃，可判定为合格。
[0125]
试验并记录大白兔体温：通过固定器稳固大白兔，在开始注射试验液前每隔30min测量体温1次，两次体温之差不得超过0.2℃，超过以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。测定正常体温15min以内，经耳缘静脉注射已温热至38℃的试验样品的试验液，剂量为10ml/只。注射完毕后每隔30min测量并记录体温1次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度，计算3只兔子体温升高总和，如6次体温均低于正常体温，则升温为负值时以0℃计。
[0126]
3.溶血实验
[0127]
(1)称取一定量的双层多孔支架材料，用生理盐水漂洗3次，按照0.05g/ml的比例，
加入一定量的生理盐水，在37℃条件下温育1h，制备出材料浸提液。
[0128]
(2)取新鲜兔血1ml，加入5m l浓度为0.1mg/ml(肝素钠/生理盐水)抗凝剂抗凝并稀释。以2500rpm的速度，离心10min以取得红细胞。红细胞用2ml生理盐水洗5次，然后取10ml生理盐水稀释红细胞。
[0129]
(3)取稀释过的红细胞0.2ml分别加入生理盐水0.8ml(阴性对照组)、去离子水0.8ml(阳性对照组)、材料浸提液0.8ml，混匀，每组设置3个平行样，并分别在37℃水浴环境下孵育1h。所有样品室温静置3h。最后悬混液以3000rpm速度离心10min，取上层清液，移至96孔板中每孔100μl，酶标仪在575nm波长下，测其吸光值。并按照如下公式计算溶血率(hr％)。
[0130][0131]
所述胶原蛋白基人工皮肤的生物安全性如图6所示。使用0.9％氯化钠注射液作为空白组，双层多孔支架层edccs和对照组双层多孔支架材料进行热原试验，如图6(a)所示，3h内家兔体温升高总和，分别是0.1℃、0.2℃、0.9℃，低于1.3℃，说明材料试验液均无致热性。双层多孔支架层edccs溶血率如图6(b)所示，溶血率为0.82％，显著低于国家标准，说明双层多孔支架材料具有良好的血液相容性。这些结果表明，所述胶原蛋白基人工皮肤无致热性，具有良好的血液相容性，表明其生物安全性良好。
[0132]
实施例五、三层复合结构的胶原蛋白基人工皮肤的创面愈合性能
[0133]
1.sd大鼠全层皮肤缺损模型的构建与
[0134]
选取体重150-200g sd雄性大鼠，选用的10％水合氯醛腹腔内麻醉，按照0.3ml/100g体重剂量麻醉大鼠。所有手术操作均在经过灭菌的房间进行。使用剃毛器褪去大鼠背部毛发，0.9％氯化钠注射液清洗，使用脱毛膏对残余毛发进行脱毛，再使用0.9％氯化钠注射液清洗，并擦干残余水分并注意大鼠的保暖工作。使用碘伏进行背部裸露皮肤的消毒，使用15ml离心管管口在背部靠上部位描记出直径1.5cm的圆形区域，使用手术剪刀彻底去除全层皮肤，制造圆形全层皮肤缺损，深达筋膜，并止血。空白组缺损创面无外敷材料；实验组缺损创面外敷三层复合结构胶原基人工皮肤；对照组缺损创面外敷对照组人工皮肤。在边缘处用5号真丝缝纫线与创伤边缘皮肤缝合，所有组再外敷1层灭菌凡士林纱布、3层普通灭菌纱布包裹伤口，并用弹性绷带和氧化锌胶带加以固定。实验动物采取单笼喂养，避免了动物之间的相互舔纸伤口。每天观察sd大鼠饲养情况及检查伤口材料是否脱落。
[0135]
2.人工皮肤修复sd大鼠全层皮肤缺损的评价
[0136]
术后第7、10、14、18、21、25天创面拍照并每组各处死4只动物，取创缘组织及肉芽组织，体积分数10％甲醛固定，常规石腊包埋处理，切片分别进行进行苏木精-伊红染(hematoxylin-eosin staining，he染)、masson三染。
[0137]
所述胶原蛋白基人工皮肤修复全层皮肤缺损的效果如图7(a)所示。术后第7天，伤口结痂，实验组痂面面积较小，颜浅且表面光滑，说明实验组恢复情况良好；空白组伤口呈鲜红，裸露面积较其他组更大，创面出现明显的渗血现象，边缘存在感染和红肿现象。术后第10天，皮肤缺损处进一步愈合，结痂面积减小。术后第14天，实验组和对照组皮肤缺损处大部分已经愈合，仅中心部分有小面积的结痂存在，周围新生皮肤有毛发长出。与对照组相比，实验组的结痂较小，愈合情况优于对照组。空白组的结痂较大。术后第18天，实验组
结痂基本脱落，创面周围出现新生毛发；对照组和空白组仍有小面积结痂，表明实验组促进伤口愈合效果明显优于对照组和空白组。术后第21天，实验组创面基本愈合，在原创伤处中心位置皮肤呈浅白和少量淡粉。术后第25天，实验组创面完全愈合，新生皮肤表面光滑、泽较好，无明显的增生现象，毛发生长明显增多；对照组创面中心仍有小面积新生较薄皮肤，呈淡粉；空白组未愈合创面明显大于其它各组。综上所述，实验组可明显促进伤口愈合，具有良好创面修复效果。
[0138]
全层皮肤缺损模型创面的he染如图7(b)所示。创面愈合初期(1w)，空白组创面向下凹陷，而实验组与对照组未出现明显凹陷现象，炎症反应严重，伤口中的血液和渗出的胶原蛋白原很快凝固，形成凝块，凝块表面干燥，逐渐形成痴皮。创面愈合中期(2w)，各组均可见新生组织，创面处中有大量的炎症细胞和成纤维细胞；实验组皮肤附件向内层迁移，肉芽组织上方出现明显的表皮组织再生。创面愈合后期(3w)，上皮组织角化明显，皮肤附件更新加快，结构接近于正常皮肤组织。he染结果表明，实验组在结构重塑方面比其他组更快。
[0139]
全层皮肤缺损模型创面的masson染如图7(c)所示。创面愈合初期，空白组真皮层较薄，而实验组与对照组有部分胶原表达并伴随着丰富的微血管。创面愈合中期，实验组可见创面中有大量胶原纤维表达，胶原纤维趋于规则排布，纤维束较粗，对照组也有胶原纤维表达但排布松散。创面愈合后期，实验组上层表皮角化明显，胶原排列致密。masson染结果表明，实验组胶原纤维的表达优于其他组。
[0140]
利用sd大鼠背部全层皮肤缺损创面模型，对三层复合结构的胶原蛋白基人工皮肤的修复效果进行了系统评估。在大体观察中，实验组25天创面完全愈合，新生皮肤表面光滑且无明显的增生现象，说明胶原蛋白基人工皮肤有效地促进全层皮肤缺损创面的愈合。he染结果表明，人工皮肤能够促进创面的结构重塑，有利于全层皮肤组织的修复。masson染结果表明，人工皮肤显著促进胶原蛋白纤维的表达，有利于创面真皮层胶原纤维的再生。因此，胶原蛋白基人工皮肤对全层皮肤缺损有优异的修复能力。
[0141]
综上所述，本发明提供了一种通过程序冻干、梯度升温的方法制备得到的双层多孔支架层，所述的双层多孔支架层为胶原膜层-胶原海绵层，包括具有致密结构的胶原膜层和均一网状结构的胶原海绵层；本发明利用所述的双层多孔支架层制备得到三层结构的人工皮肤，具有良好的机械性能和溶胀、溶失性能，为创伤修复提供了运输营养和代谢产物的作用；具有良好的拉伸强度，可适用于与机体的缝合；具有良好的抗酶解能力和生物降解性，在修复创面早期能够防止伤口回缩，并在伤口修复后发生生物降解，避免二次清创和材料残留的问题；本发明所述的双层多孔支架材料，具有高生物相容性和低细胞毒性，克服了戊二醛交联制备得到的人工皮肤存在的交联剂残留导致的细胞毒性问题；具有良好的内部孔隙结构，为细胞生长提供支架，促进细胞的增殖和粘附；本发明所述的胶原膜层可发挥良好的层间隔离作用，有效防止外层硅胶材料渗透浸入真皮层，从而更好的保护人工皮肤真皮层内环境的稳定，促进细胞黏附与生长；本发明所述的人工皮肤无致热性，血液相容性好，表明其具有良好的生物安全性；所述的人工皮肤，对全层皮肤缺损有优异的修复效果，在皮肤医学、组织修复用制品等领域有巨大的应用潜力。

技术特征：

1.一种三层复合结构胶原蛋白基人工皮肤，其特征在于，所述的人工皮肤包括硅胶膜层和双层多孔支架层，所述的双层多孔支架层包括胶原膜层-胶原海绵层，所述的硅胶膜层厚度为0.3-1mm，所述的胶原膜层厚度为0.4-10μm，所述的胶原海绵层的厚度为1.5-5mm，总厚度为1.8-7mm。2.如权利要求1所述的人工皮肤，其特征在于，所述的胶原海绵层的孔隙率为76-90％，平均孔径大小为60-150μm。3.如权利要求1所述的人工皮肤，其特征在于，所述的双层多孔支架层由以下重量份的原料通过程序冻干、梯度升温制备得到：83～93wt％胶原和7-17wt％粘多糖；所述的程序冻干，将模具放置在冷冻干燥机中，从室温冷却至-35℃，恒温冷冻8-24h；所述的梯度升温，以5℃/h的升温速率，将材料从-35℃升温至-20℃；以0.78℃/h升温速率，从-20℃升温至-15℃，保温1h；以2℃/h升温速率，从-15℃升温至-5℃；以7.5℃/h升温速率，从-5℃升温至25℃，保温真空干燥16h。4.如权利要求3所述的人工皮肤，其特征在于，所述胶原蛋白为ⅰ型胶原蛋白；所述粘多糖为硫酸软骨素和/或透明质酸。5.如权利要求1-4任一项所述人工皮肤的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)使用醋酸溶液分别溶解并配制胶原蛋白和粘多糖溶液，在搅拌下，按照比例将粘多糖溶液逐滴缓慢加入胶原蛋白溶液，搅拌均匀；(2)将步骤(1)中配置的溶液真空除泡，去除有气泡部分；将材料均匀平铺在聚乙烯模具中，程序冻干，梯度升温，得到双层多孔支架材料；所述的程序冻干，梯度升温，将模具放置在冷冻干燥机中，从室温冷却至-35℃，恒温冷冻8-24h；以5℃/h的升温速率，将材料从-35℃升温至-20℃；以0.78℃/h升温速率，从-20℃升温至-15℃，保温1h；以2℃/h升温速率，从-15℃升温至-5℃；以7.5℃/h升温速率，从-5℃升温至25℃，保温真空干燥16h；(3)将步骤(2)得到的双层多孔支架材料热脱氢处理，交联，冷冻干燥，得到双层多孔支架层；(4)将硅胶的a、b组分按1:1的比例混合均匀，搅拌，真空脱泡，将混合硅胶平铺至步骤(3)得到的双层多孔支架层的胶原膜层上，固化硅胶，得到人工皮肤。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的所述双重交联，是双层多孔支架层通过物理方法、化学方法或两者结合的方法进行交联后形成的。7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的交联是将双层多孔支架材料浸入乙醇溶液配置的edc-nhs溶液中，恒温交联，edc含量为50mmol/l，edc/nhs的摩尔比为5：1。8.如权利要求1-4任一项所述的人工皮肤在制备组织修复用制品中的应用。9.一种由权利要求1-4任一项所述的人工皮肤制得的组织修复用制品。10.根据权利要求9所述的组织修复用制品，其特征在于，所述组织修复用制品为疝气修复补片、女性盆底功能障碍性疾病修复系统、人工肩袖、硬脑膜修复补片、脊膜修复补片、心包膜补片、人工牙膜、创伤修复产品、烧伤修复产品、瘘创面修复产品、填塞产品或脏器创面修复产品。

技术总结

本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种三层复合结构胶原蛋白基人工皮肤及其制备方法。所述的人工皮肤包括三层结构，从上至下分别为硅胶膜层-胶原膜层-胶原海绵层，所述的硅胶膜层厚度为0.3-1mm，所述的胶原膜层厚度为0.4-10μm，所述的胶原海绵层的厚度为1.5-5mm，总厚度为1.8-7mm。所述人工皮肤材料多孔支架层主要成分为牦牛胶原蛋白和硫酸软骨素，通过梯度升温冻干法和双重交联处理得到。所述人工皮肤不仅具有良好的机械强度、溶胀性能和抗酶解性能，同时具有良好的生物活性及全层皮肤损伤创面的修复效果，在医疗领域具有广阔的应用前景。应用前景。应用前景。