一种采用茉莉酸甲酯调节油茶基因的方法

1.本技术涉及一种采用茉莉酸甲酯调节油茶基因的方法，属于生物

技术领域

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背景技术

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：：2.油茶(camelliaoleifera)是山茶科山茶属植物，是我国特有的食用油料树种，有2300多年的栽培和利用历史是我国重要的木本食用油料树种，在我国资源丰富、栽培面积大，其适应性强、耐干早瘠薄，一年种植多年收益，在我国生态建设事业和山区农民脱贫致富中占有重要地位。油茶籽是油茶的种子。茶油主要由棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸及花生烯酸组成，油茶籽油中不饱和脂肪酸含量高达80％以上，其中油酸含量达70％以上，接近甚至超过了橄榄油，且富含人体必需的多种微量元素和活性成分。提高油茶种子含油率是今后很长一段时间油茶育种的重大目标和技术难关,而且通过常规育种技术难以实现。为了实现这个宏大目标,加速油茶品种改良进程,一个可行的方法就是发现各类植物调节剂可以影响脂肪酸和油脂合成的关键酶,或者研究控制油茶种子细胞的数量及面积等方法,最终达到提高油茶种子油含量的目的。3.油茶脂类代谢涉及多种酶类，其中，脂肪酸合成起始步骤是乙酸辅酶a羧化酶(acc，ec6.4.1.2)催化乙酰辅酶a产生丙二酸辅酶a，在质体中丙二酰辅酶a含量仅有乙酰辅酶a的10％，因此丙二酰辅酶a含量可能是脂肪酸合成途径重要的调控因素，通过提高乙酸辅酶a羧化酶活性能够促进脂肪酸合成，这一点在细菌中已得到证实。研究人员从油茶中克隆了accase的4个亚基的cdna序列和基因组序列，通过多重与实时荧光定量研究了它们在油茶种子不同发育阶段及不同组织器官中的表达规律，并在拟南芥中研究它们的过量表达和干扰对油脂合成的影响(参见王保明，油茶accase基因的克隆及功能研究，中南林业科技大学，博士学位论文，公开日：2012-10-15)。4.长链脂肪酰基coa合成酶(lacs，longchainfattyacidacyl-coasynthetasemember，ec6.2.1)几乎在生物体内所有脂肪酸衍生物的生化合成途径中起着关键作用。目前关于lacs基因及其生化研究在细菌、酵母和哺乳动物中有详细报道，在高等植物中lacs也逐渐有深入研究，有文献报道模式植物拟南芥中已鉴定出9个lacs家族成员，并证实各atlacs在不同器官中有不同的表达模式，在脂肪酸相关油脂代谢的不同节点起着重要作用。本领域已知，油茶中lacs参与脂肪酸合成(pinglinetal.seedtranscriptomicsanalysisincamelliaoleiferauncoversgenesassociatedwithoilcontentandfattyacidcomposition.int.j.mol.sci.2018,19,118，1-17)。也有报道指出，油茶中lacs4蛋白与bzip60在油茶种子萌发过程中共表达(参见，wenfanggongetal.full-lengthtranscriptomefromcamelliaoleiferaseedprovidesinsightintothetranscriptvariantsinvolvedinoilbiosynthesis.j.agric.foodchem.2020,68,49,14670–14683)。5.植物油酸(oleicacid，18:1)是以硬脂酸为底物由可溶性硬脂酰酰基载体蛋白脱饱和酶(stearoylacyl-carrier-proteindesaturase，sad，ec1.14.99.6)所催化形成的。sad家族成员对于特定的底物链长具有特异性，将双键引入脂肪酸烃链不同的碳原子间，由于sad是植物调控18:0到18:1的唯一酶，因此在调控植物细胞不饱和脂肪酸水平方面起着关键作用，sad的作用在于催化硬脂酸首次去饱和形成油酸，这是不饱和脂肪酸合成途径中的第一步去饱和反应，拟南芥和油茶等的植物的sad相关基因已经得到克隆，拟南芥植株经过sad转化后硬脂酸和棕榈酸含量降低而油酸和棕榈油酸的含量增加，表明sad基因具有控制饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸转化的功能。6.fad即脂肪酸去饱和酶(fattyaciddesaturase)，属于脂酰-脂去饱和酶(acyl-lipiddesaturase)，是植物脂肪酸去饱和酶中重要的一类。研究人员最早从模式植物拟南芥中克隆得到fad基因，共分离得到5个基因家族成员，分别是fad2、fad3、fad6、fad7、fad8；随后，研究人员相继从大豆、芝麻、橄榄树等油料作物中克隆得到了fad基因的不同家族成员。7.茉莉酸甲酯(meja)是一种植物激素。茉莉酸甲酯作为一种常见的信号物质存在于植物体内，影响植物新陈代谢，参与种子萌发、开花结果、果蔬储存期抗氧化、香气物质形成和病虫抗逆性形成等植物生理过程。8.褪黑素(melatonin，mt)又名松果体素，化学名称为n-乙酰基-5甲氧基胺，是广泛存在于动物和植物等有机体内的一类重要的吲哚类化合物。外源褪黑素在作物种子萌发、根系发育、果实成熟、抗逆性等方面具有重要的调控作用。9.茉莉酸甲酯和褪黑素具备促进种子萌发和植株生长的作用，但既有可能是种子细胞数目增加，也有可能细胞本身体积增大使种子膨大，因此，茉莉酸甲酯和褪黑素对于油茶种子发育的影响及原因有必要做出进一步研究。10.植物激素对脂肪酸合成基因的影响在不同物种中的表现不同甚至相反，这些基因的表达量在同一物种中对同一植物激素的反应趋势(升高或降低)也并不总是一致的。因此，人们希望到一种能够同时提高油茶脂肪酸合成相关基因的植物激素，以便提高油茶含油率并促进油茶育种技术发展。技术实现要素：11.为了解决上述问题，本技术提供一种同时提高油茶脂肪酸合成途径中多个基因表达的方法，对油茶树整体喷施茉莉酸甲酯，所述多个基因为长链脂肪酰基coa合成酶基因lacs、乙酸辅酶a羧化酶基因acc，硬脂酰酰基载体蛋白脱饱和酶基因sad，和脂肪酸去饱和酶基因fad。12.在一些实施方式中，lacs为lacs4，所述acc为acc1，所述sad为sad1，sad6，所述fad为fad2，fad3。13.在一些实施方式中，喷施的期间为油茶种子的油脂合成初期、或油脂合成高峰期、和/或油脂合成后期。14.在一些实施方式中，喷施的浓度为0.1-5mmol/l，优选为0.5mmol/l。15.本技术还提供一种提高油茶种子的细胞数目的方法，对油茶树整体喷施茉莉酸甲酯或褪黑素。16.在一些实施方式中，茉莉酸甲酯的浓度为0.5mmol/l，或所述褪黑素的浓度为100μmol/l。17.本技术还提供一种提高油茶种子含油量的方法，在油茶种子的油脂合成高峰期和/或油脂合成后期，对油茶树整体喷施茉莉酸甲酯。在一些实施方式中，喷施的浓度为0.1-5mmol/l，优选为0.5mmol/l。附图说明18.图1为本技术实施例1的不同发育阶段的油茶果实和种子。19.图2为本技术实施例1的不同浓度的外源meja(j)和mt(m)处理对油茶种子体积和重量的影响。20.图3为本技术实施例1的外源meja(j0.5)和mt(m100)处理对油茶种子体积和重量的影响。21.图4为本技术实施例1的用石蜡切片观测油茶种子发育。22.图5为本技术实施例1的石蜡切片观测外源meja(j0.5)和mt(m100)处理对油茶种子内外种皮细胞数目及细胞面积的影响。23.图6为本技术实施例2的不用浓度外源meja和sham处理后油茶种子含水率和含油率的变化。24.图7为本技术实施例2的对照与0.5mmol/l的meja处理后种仁油体变化图。25.图8为本技术实施例3的油脂合成与代谢途径中差异基因表达量变化彩图。26.图9为本技术实施例3的油脂合成与代谢途径中差异基因表达量变化数值。27.图10为油茶种子细胞数目、脂肪酸合成相关基因表达等与油脂含量的关系示意图。具体实施方式28.为了具体阐述本技术具有普适性的设计思路，下面以具体的实验参数为例进行展示，但不应当反而成为限制本技术保护范围的理由。29.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。30.本技术的一个目的在于：提供一种提高油茶脂肪酸合成途径中相关基因表达的方法，其特征在于，对油茶树整体喷施茉莉酸甲酯，所述油茶脂肪酸合成途径中相关基因为长链脂肪酰基coa合成酶基因(lacs)。31.根据上述方法，所述基因还包括以及乙酸辅酶a羧化酶基因(acc)，和/或硬脂酰酰基载体蛋白脱饱和酶基因(sad),和/或脂肪酸去饱和酶(fad)。32.本技术的另一个目的在于，一种提高油茶脂肪酸合成途径中相关基因表达的方法，其特征在于，对油茶树整体喷施茉莉酸甲酯，所述油茶脂肪酸合成途径中相关基因为硬脂酰酰基载体蛋白脱饱和酶基因(sad)。33.根据上述方法，所述基因还包括长链脂肪酰基coa合成酶基因(lacs)，以及乙酸辅酶a羧化酶基因(acc)和/或脂肪酸去饱和酶(fad)。34.根据上述方法，所述acc为acc1，和/或所述lacs为lacs4，和/或所述sad为sad1，sad6，和/或所述fad为fad2，fad3。35.根据上述方法，所述茉莉酸甲酯的喷施浓度为0.1-5mmol/l，优选0.5mmol/l。根据上述方法，所述茉莉酸甲酯用喷雾器进行整株喷施至叶片滴水为止。根据上述方法，所述茉莉酸甲酯每隔一个月喷施一次，直至果实成熟。36.本技术的另一个目的在于，提供一种提高油茶种子细胞数目的方法，其特征在于，对油茶树整体喷施茉莉酸甲酯和/或褪黑素。37.根据上述方法，所述茉莉酸甲酯的浓度为0.5mmol/l，或所述褪黑素的浓度为100μmol/l。根据上述方法，所述茉莉酸甲酯或褪黑素用喷雾器进行整株喷施至叶片滴水为止。根据上述方法，所述茉莉酸甲酯或褪黑素每隔一个月喷施一次，直至果实成熟，所述提高油茶脂肪酸合成途径中相关基因表达的时间发生在油茶种子成熟期。38.本技术的目的还在于，提供茉莉酸甲酯在提高油茶不饱和脂肪酸含量和/或提高油茶种子含油率中的应用。39.本技术的目的还在于，提供茉莉酸甲酯在同时提高油茶脂肪酸合成途径中乙酸辅酶a羧化酶基因(acc)，长链脂肪酰基coa合成酶基因(lacs)，硬脂酰酰基载体蛋白脱饱和酶基因(sad)，以及脂肪酸去饱和酶(fad)表达中的应用。40.根据上述应用，其中所述acc为acc1，和/或所述lacs为lacs4，和/或所述sad为sad1，sad6，和/或所述fad为fad2，fad3。41.根据上述应用，所述茉莉酸甲酯的喷施浓度为0.1mmol/l-5mmol/l，优选0.5mmol/l。42.上述脂肪酸合成途径的基因均为本领域已知，例如，所述acc1基因可以是genbank登录号为xp_028107774.1的乙酸辅酶a羧化酶基因，所述fad2基因可以是genbank登录号为agh32914.1、ain52150.1的脂肪酸去饱和酶基因，所述fad3基因可以是genbank登录号为xp_028121231.1的脂肪酸去饱和酶基因，所述lacs4基因可以是genbank登录号为xp_028120550.1、xp_028065343.1、alf39596.1的长链脂肪酰基coa合成酶基因，所述sad1可以是genbank登录号为xp_028062579.1的脂肪酸去饱和酶基因，所述sad6可以是genbank登录号为xp_028092290.1的脂肪酸去饱和酶基因。43.本技术首次明确了茉莉酸甲酯和褪黑素对油茶种子细胞数目的影响，茉莉酸甲酯对油茶种子不饱和脂肪酸积累的影响，并通过差异表达明确了茉莉酸甲酯对油茶脂肪酸合成过程中关键基因表达量的影响，为提高油茶种子含油率，增加油茶单位面积产量和总产量以及油茶一些丰产栽培措施的应用提供了支持,具有重要的理论价值和重大的应用价值(见图10)。44.实施例1茉莉酸甲酯和褪黑素处理对于油茶种子发育的影响45.1.1激素喷施46.试验选取茉莉酸甲酯(meja：0.1mm、0.5mm、2.5mm、5mm)和褪黑素(mt：50μm、100μm、150μm、200μm)两种植物生长调节剂，各设置4个激素浓度，采用单因素试验设计，试验设置不同浓度的外源meja、mt和对照(ck)共计9个处理，以等量清水为对照。每个处理3棵树，喷施时加入0.01％tween-20，用喷雾器进行整株喷施至叶片滴水为止。从3月初开始，每隔一个月喷施一次，直至果实成熟。本试验为大田试验，采用周期性采样的方法。从2020年3月28日开始，每隔14天进行一次样品采集，直至果实成熟时期(10月24日)。采样部位为每株树中上部分，随机挑选。新鲜样品置于冰盒中带回实验室用于后续实验测定。47.1.2种子重量和体积测定48.将不同时期采集的新鲜种子进行称重，每100个种子为一组，共重复3次。称重的种子之后使用沉水法测定种子体积。49.1.3结果50.通过调查发现种子快速膨大的时间为7-9月份。种子在3-7月份主要是种皮发育阶段，8-10月份主要是胚发育阶段(图1)。51.使用不同浓度的meja和mt发现，0.5mmol/l的meja(j0.5)和100μmol/l的mt(m100)可以显著提高种子的体积与重量，在快速膨大期间，分别增加了30％和15％以上(图2，图3)。52.胚珠的内外珠被均形成种皮，它们分别形成内种皮和外种皮。外种皮细胞径向伸长，细胞壁不断木质化加厚，细胞腔缩小，细胞排列紧密，这层细胞最终发育成黑的木质化的壳状种皮。显微观察结果显示内种皮从5月23日开始逐渐被消耗，从7月18日开始慢慢变为膜状，位于壳状的种皮和肥厚的子叶之间(图4)。53.为了进一步方便统计细胞数目和面积，将种子划分为三个区域(合点端为区域上，中部为区域中，另一端为区域下)。内外种皮区域的细胞数量主要从3月2日8增加至5月23日，之后开始下降。细胞面积与数目呈相反变化趋势，并且在各个处理之间没有显著性差异。表明外源激素主要通过增加种子发育前期种皮中的细胞数量影响种子大小(图5)。54.实施例2茉莉酸甲酯对油茶种子含水率和含油率的影响55.2.1激素喷施56.试验选取茉莉酸甲酯(meja)和茉莉酸甲酯抑制剂：水杨苷异羟肟酸(sham)两种植物生长调节剂，各设置4个激素浓度，采用单因素试验设计，试验设置不同浓度的外源meja、sham和对照(ck)共计9个处理(表1)，以等量清水为对照。每个处理3棵树，喷施时加入0.01％tween-20，用喷雾器进行整株喷施至叶片滴水为止。从4月初开始，每隔一个月喷施一次，直至果实成熟。本试验为大田试验，采用周期性采样的方法。从2020年4月9日开始，每隔14天进行一次样品采集，直至果实成熟时期(10月24日)。采样部位为每株树中上部分，随机挑选。新鲜样品置于冰盒中带回实验室用于后续实验测定。57.表1外源生长调节剂单因素试验设计58.table1testfactorlevelofgrowthregulator[0059][0060]2.2种子含水率及含油率的测定[0061]将不同时期采集的新鲜种子进行称重(记质量为w1)，并在60℃烘箱中干燥至恒重(记质量为w2)。重复实验3次。含水率(％)＝[(w1-w2)/w1]*100％[0062]采用索式抽提法进行油茶种子油脂的提取。将不同时期采集的新鲜种子在60℃的烘箱中烘干至恒重。干燥后的种子用研磨机碾碎成粉末。将约5g的油茶种子粉末放入折叠好的滤纸管中，包成油包用脱脂棉密封后用细棉线系紧，随后插入索氏抽提器中。将约50ml石油醚加入索氏抽提器相连接的铝制油杯中进行萃取。设定机器的提取温度为75℃。索氏抽提器抽提的流程如下：用套管将样品在溶剂中煮沸30min。然后漂洗150min，蒸发60min对溶剂进行回收，最后将提取后的油从油杯中取出，保存在离心管中备用。含油率(％)＝[(提取前油杯重量-提取后油杯重量)/粉末重量]*100％。[0063]2.3种子油体观察[0064]选取新鲜的油茶果实，用单面刀片剖出种子，挑选正常、饱满的种子，去除内外种皮，切取种仁中间部分，使用双面刀片将其切成薄片，置于普通显微镜下观察到合适的细胞视野后使用尼罗红染液(用丙酮配置成1mg/ml的母液置于4度冰箱保存，使用时用无菌水稀释成10μg/ml)避光染10min，期间用头适当的吹打几次，使染更加充分。随后使用无菌水冲洗几次，将染液冲洗干净。使用无菌水封片，吸干多余水分后置于激光共聚焦显微镜下进行观察。在512nm的波长下进行观察并拍照。[0065]2.4种子脂肪酸组分的测定[0066]脂肪酸组分的测定参考国家标准gb5009.168-2016。准确称取待测油样60.0mg(精确至0.1mg)至具塞试管中，准确加入2.0ml内标溶液(5mg/ml的十一碳酸甘油三酯溶液)。再加入4ml异辛烷溶解试样，必要时可以微热使试样溶解后加入200μl氢氧化钾甲醇溶液(2mol/l)，盖上玻璃塞猛烈振摇30s后静置至澄清。加入约1g硫酸氢钠，猛烈振摇，中和氢氧化钾。待盐沉淀后，将上层溶液移至上机瓶中，上机进行谱分析。[0067]利用气相谱仪分析油脂的主要脂肪酸组分。谱条件：采用氢火焰离子化检测器，谱柱(60m×0.25mm×0.2μm)。载气为氮气，分流比为1:50。1μl自动进样。加热程序：首先，在50℃下保持2分钟，然后将温度升高到170℃(10℃/min)并保持10分钟。之后，将温度升高至180℃(2℃/min)并保持10分钟。最后，将温度升高至220℃(4℃/min)并保持22分钟。[0068]2.5结果[0069]1》外源meja和sham处理对油茶种子含水率的影响[0070]如图6a所示，油茶种子含水率在整个油脂合成期间处于不断下降的趋势。对不同处理后的种子含水率进行比较发现0.1mmol/l和0.5mmol/l的meja处理后含水率降低更为明显。而5mmol/l的meja处理后含水率总体上与ck相近或略高于ck。sham处理后各浓度的含水率总体上略低于ck。[0071]2》外源meja和sham处理对油茶种子含油率的影响[0072]如图6b所示。8月1日之前，种子含油率极低，趋近于零。不同浓度的meja处理后种子含油率差异显著。在整个油脂合成的过程中，0.5mmol/l的meja处理后，含油率提高最为显著，成熟时(10月24日)相较于ck提高了43.07％。其次是0.1mmol/l的meja处理，成熟时相较于ck增加了28.69％。而5mmol/l的meja处理后对含油率的抑制作用显著。[0073]对四个浓度的sham处理后种子含油率的变化情况进行比较，总体上4mmol/l和8mmol/l的sham处理后含油率相较于ck有所增加。而2mmol/l和10mmol/l的sham处理后与ck相近。[0074]3》外源meja和sham处理对油茶种仁油体的影响[0075]由图6b可知，0.5mmol/l的meja处理后含油率增加最为显著。因此，我们选择了ck及0.5mmol/l的meja处理后的样品，对其种仁细胞内的油体变化情况进行观察。结果如图7所示，8月初，ck及0.5mmol/l的meja处理后种仁细胞内油体数目极少，几乎观察不到；8月中旬种仁细胞内已出现少量的极小体积的油体，且主要分布在细胞壁周围。8月29日至9月12日，油体的数目增多且聚集在细胞壁附近。9月下旬以后，油体的体积增大且向细胞中央分布。成熟时(10月24日)，油体的体积最大，且充满种仁细胞。与ck油体的变化情况相比，0.5mmol/l的meja处理后种仁细胞内油体形态与ck无差异，但油体的数目显著增多。[0076]4》外源meja和sham处理对油茶种子脂肪酸含量的影响[0077]a.外源meja和sham处理对油茶种子油酸相对含量的影响[0078]如表2所示，随着种子内部油脂的合成，油酸的相对含量呈现出一个不断增长的趋势。不同浓度的meja处理后油酸相对含量差异显著。其中，0.1mmol/l、0.5mmol/l和2.5mmol/l的meja处理后油酸相对含量相较于ck提高了，且在油脂合成前期的影响更显著。而成熟时，0.5mmol/l的meja处理后的油酸相对含量相较于ck只提高了4.04％。5mmol/l的meja处理后对油酸相对含量表现出抑制作用。[0079]比较不同浓度的sham处理后油酸相对含量变化情况发现，2mmol/l的sham处理后种子油酸相对含量总体上与ck相近。8mmol/l的sham处理效果相对更好，成熟时，其油酸相对含量相较于ck提高了1.82％。[0080]表2不同浓度的meja和sham处理后油茶种子油酸相对含量的变化[0081][0082]b.外源meja和sham处理对油茶种子亚油酸相对含量的影响[0083]不同浓度meja和sham处理后种子中亚油酸相对含量的变化情况如表3所示。油茶种子中亚油酸相对含量在油茶果实生长发育过程中总体上有一个先下降再上升再下降的趋势。在8月中上旬，4个浓度的外源meja处理后亚油酸的相对含量都高于对照组，但增量较少。8月下旬9月下旬之间，4个浓度的meja处理后亚油酸的相对含量都低于对照组。10月份，5mmol/l的meja处理后亚油酸的相对含量高于对照组，而其余浓度均低于对照组。综合来看，不同浓度meja处理后对亚油酸相对含量的抑制作用更明显，成熟时，各处理浓度间的数值差异较小。[0084]不同浓度sham喷施处理后，8月中上旬，亚油酸相对含量较对照组稍高，但增加量较少。而8月下旬直至果实成熟期间，亚油酸相对含量都稍低于对照组。综合不同浓度的meja和sham处理效果来看，外源meja和sham处理总体上都呈现降低亚油酸相对含量的作用。[0085]表3不同浓度的meja和sham处理后油茶种子亚油酸相对含量的变化[0086][0087]c.外源meja和sham处理对油茶种子亚麻酸相对含量的影响[0088]不同浓度meja和sham处理后种子中亚麻酸相对含量的变化情况如表4所示。油茶种子中亚麻酸相对含量随着油茶果实的生长发育进行而逐渐降低。8月中上旬，0.5mmol/l的meja处理后亚麻酸的相对含量高于对照组；8月中下旬至9月下旬，4个浓度的meja处理后亚麻酸相对含量相较于对照组降低；而10月份，除5mmol/l的外源meja处理后亚麻酸的相对含量高于对照组外，其余浓度处理均低于对照组；成熟时，处理间数值差异较小。[0089]利用不同浓度的sham处理后，总体上亚麻酸的相对含量相较于对照组也降低了。[0090]表4不同浓度的meja和sham处理后油茶种子亚麻酸相对含量的变化[0091][0092][0093]d.外源meja和sham处理对油茶种子不饱和脂肪酸相对含量的影响[0094]不同浓度meja和sham处理后种子中不饱和脂肪酸相对含量的变化情况如表5所示，油茶种子中不饱和脂肪酸的相对含量随着油茶果实的生长发育进行而不断提高。8月份，0.5mmol/l的meja处理后对不饱和脂肪酸相对含量的促进作用更为显著。其中，8月15日不饱和脂肪酸相对含量相较于ck提高了28.18％。成熟时(10月24日)，不饱和脂肪酸相对含量相较于ck提高了3.42％。5mmol/l的meja处理后对不饱和脂肪酸相对含量的抑制作用显著。[0095]比较不同浓度的sham处理后种子不饱和脂肪酸相对含量发现，除了8月15日之外，2mmol/l、4mmol/l、8mmol/l和10mmol/l的sham处理后的不饱和脂肪酸相对含量与ck相近或者稍低于ck。[0096]表5不同浓度的meja和sham处理后油茶种子不饱和脂肪酸相对含量的变化[0097][0098][0099]实施例3植物激素对油茶种子脂肪酸合成相关基因表达的影响[0100]3.1样品收集[0101]综合meja处理后油茶种子中含油率、不饱和脂肪酸相对含量、饱和脂肪酸相对含量的结果表明，0.5mm的meja处理对油茶种子含油率、不饱和脂肪酸相对含量、饱和脂肪酸相对含量的促进作用更为显著。另外，‘华硕’种子7月份(油脂合成初期)的含油量极低，9月份是油脂合成的高峰期，10月底是油茶种子成熟期(油脂合成后期)。因此，本次研究选择了7月18日、9月12日、10月24日的0.5mm的meja处理后的种子作为研究材料，清水处理作为对照材料。收集这3个日期的样品，分别标记为ck1(7月18日清水对照)，j1(7月18日0.5mm的meja处理后的种子)，ck2(9月12日清水对照)，j2(9月12日0.5mm的meja处理后的种子)，ck3(10月24日清水对照)，j3(10月24日0.5mm的meja处理后的种子)利用高通量转录组测序的手段，对其脂肪酸合成途径差异表达基因进行研究。[0102]3.2转录组测序及分析[0103]对测序得到的原始结果rawreads利用fastp进行质控，过滤低质量的reads，其中包括去除含adapter、含n比例大于10％的reads、全部都是a碱基及低质量(质量值q≤20的碱基数占整条read的50％以上)的reads，得到cleanreads。与参考基因组比对后进行转录本重构，得到完整转录本。然后利用rpkm(readsperkilobasepermillionmappedreads)值计算差异表达的基因。按照edger的一般过滤标准(log2|foldchange|》1，fdr《0.05)进行基因差异表达分析，foldchange表示两样品间rpkm的比值。[0104]3.3外源meja处理对油茶种子转录组的影响[0105]3.3.1差异表达基因kegg富集分析[0106]差异表达基因富集涉及脂质的通路共有11条(表6)。ck1vsj1主要富集在α-亚麻酸代谢通路上。ck2vsj2主要富集在不饱和脂肪酸的生物合成、泛酸和辅酶a生物合成、脂肪酸代谢、α-亚麻酸代谢、脂肪酸代谢、脂肪酸生物合成、脂肪酸降解及甘油酯代谢上。而ck3vsj3在这11条通路上均有富集。[0107]表6筛选出的脂质代谢路径[0108][0109]3.3.2参与脂肪酸合成代谢的差异基因分析[0110]从11条涉及脂质代谢的通路中筛选到了60个与脂肪酸合成和代谢相关的基因。如图8及图9所示，茉莉酸甲酯在油茶种子的油脂合成高峰期和/或油脂合成后期喷施能同时提高多个基因(如lacs4，acc1，sad1，sad6，fad2，fad3)的表达量，但对于kas和fad6影响不大或有抑制作用。[0111]显然，本领域的技术人员可以对本技术进行各种改动和变型而不脱离本技术的精神和范围。这样，倘若本技术的这些修改和变型属于本技术权利要求及其等同技术的范围之内，则本技术也意图包含这些改动和变型在内。当前第1页12当前第1页12

技术特征：

1.一种提高油茶种子的细胞数目的方法，其特征在于，对油茶树整体喷施茉莉酸甲酯和/或褪黑素。2.根据权利要求1所述方法，所述茉莉酸甲酯的浓度为0.5mmol/l，或所述褪黑素的浓度为100μmol/l。3.一种提高油茶种子含油量的方法，其特征在于，在油茶种子的油脂合成高峰期和/或油脂合成后期，对油茶树整体喷施茉莉酸甲酯。4.根据权利要求3的方法，所述喷施的浓度为0.1-5mmol/l。5.根据权利要求3或4的方法，所述喷施的浓度为0.5mmol/l。6.一种同时提高油茶脂肪酸合成途径中多个基因表达的方法，其特征在于，对油茶树整体喷施茉莉酸甲酯，所述多个基因为长链脂肪酰基coa合成酶基因lacs、乙酸辅酶a羧化酶基因acc，硬脂酰酰基载体蛋白脱饱和酶基因sad，和脂肪酸去饱和酶基因fad。7.根据权利要求6的方法，其特征在于，所述lacs为lacs4，所述acc为acc1，所述sad为sad1，sad6，所述fad为fad2，fad3。8.根据权利要求6或7的方法，其特征在于，所述喷施的期间为油茶种子的油脂合成高峰期和/或油脂合成后期。9.根据权利要求6-8之一的方法，所述喷施的浓度为0.1-5mmol/l。10.根据权利要求6-9之一的方法，所述喷施的浓度为0.5mmol/l。

技术总结

本申请涉及一种采用茉莉酸甲酯调节油茶基因的方法。对油茶树整体喷施茉莉酸甲酯后，油茶种子中的细胞数目增加，同时可以提高油茶种子含油率，提高油茶种子中的脂肪酸含量；尤其是，油茶脂肪酸合成和代谢途径中的关键基因，包括乙酸辅酶A羧化酶，长链脂肪酰基CoA合成酶，以及硬脂酰酰基载体蛋白脱饱和酶的表达也得到提高。本申请为提高油茶种子含油量，增加油茶单位面积产量和总产量以及油茶一些丰产栽培措施的应用提供了支持。产栽培措施的应用提供了支持。产栽培措施的应用提供了支持。