84K银腺杨内生菌快速脱毒方法

84k银腺杨内生菌快速脱毒方法
技术领域
1.本发明涉及植物无性繁殖技术领域，具体涉及84k银腺杨内生菌快速脱毒方法。

背景技术：

2.对于84k银腺杨等无性繁殖系的所有木本植物来说，在组培苗的培养过程中，植物体内的内生菌(endophytes)往往难以永久去除，长期的无性繁殖也会使这些木本植物本身积累较多的有害物质，内生菌的污染会导致组培苗的黄化、矮小、甚至死亡等，严重影响了实验材料的保存和遗传转化，造成成苗率低、转化难，增加投入批量生产的成本。
3.目前，对于在植物苗株后续扩繁中又衍生出内生菌的组培苗，严重时多直接舍弃，微量时多采用在培养基中添加抗生素等方式，来抑制植物组织培养中内生菌的生长，降低污染系数，提高组培效率。但前者往往要重新从户外获取野生苗株进行脱毒处理，采取实验材料时又多受季节和天气等外部环境影响:春季材料相比其他季节成活率高，芽活性强；相反夏季成活率低；秋季次之；冬季对于落叶树种来说，无法获得实验材料。同时，雨季后材料污染率高，脱毒不易成功等等。后者则需要在每次配制培养基时都要加入相应的抗生素，且只能短暂地抑制植株体内的内生菌，并未彻底去除，一旦超过抗生素抑制范围或不加抗生素后，内生菌仍旧衍生，而且需要针对不同物种和不同种类内生菌尝试不同的抗生素，并探索相应的浓度梯度，方法效率极低。因此，有必要探索一种高效、简便的84k银腺杨内生菌脱毒方法。

技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供84k银腺杨内生菌快速脱毒方法，旨在克服现有技术中存在的上述不足。
5.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：84k银腺杨内生菌快速脱毒方法，其包括如下步骤：
6.首先，挑选84k银腺杨组培苗株，放入恒温箱内，按照下表进行连续三周的高温黑暗处理：
[0007][0008]
然后，在经历过上述三周的高温黑暗处理后，苗株芽端将长出白或嫩黄芽点，对其进行继代，继代培养基为杨树生根扩繁培养基，培养三个月以上，观察，无内生菌感染的苗株即为脱毒成功的84k银腺杨苗株。
[0009]
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下进一步的具体选择。
[0010]
具体的，杨树生根扩繁培养基的组成如下表所示：
[0011][0012]
具体的，挑选84k银腺杨苗株时统一选择株高在10cm规格组培瓶高度1/3-1/2之间的苗株，且苗株为不含有枯叶、黄叶、褐叶或病菌叶的健壮植株。
[0013]
具体的，继代培养时的培养温度为25℃，光强为2000lx,光照时间为12h/d。
[0014]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0015]
本发明以84k银腺杨组培苗为材料，避免了户外野生苗到无菌组培苗的繁琐，缩短脱毒时间，直接以含内生菌的组培苗为实验材料，短时间内获得新的84k杨无菌组培苗。与传统的脱毒技术相比，脱毒效率高，操作简单。避免因试剂过量或浸泡时间过长，而产生过多的残留对苗株造成损伤，同时避免抗生素在配制培养基时的频繁使用。也为当下其他植物组培苗保存过程中，多次扩繁后产生的内生菌问题提供解决方案参考，保证了实验材料的保存和遗传转化的顺利进行。
附图说明
[0016]
图1为富含内生菌的84k银腺杨组培苗培养基底部状态，标尺为1cm，图中明显可见布满黄内生菌，导致植株根系发黄、褐化；
[0017]
图2为富含内生菌的84k银腺杨组培苗培养基上部状态，标尺为1cm，图2a可见发黄的根系，图2b可见发黄根系及黄褐化脱落的叶片，且脱落的叶片在培养基内也会导致菌落蔓延(叶片周边培养基明显发黄)；
[0018]
图3为本发明实施例21天高温黑暗处理的染菌苗三个月内的脱毒率，wt表示对照组，mon-x表示对实施例苗株间隔观察的月数；
[0019]
图4为本发明对比例0.1％处理的染菌苗三个月内的脱毒率，wt表示对照组，day-xx表示对比例苗株间隔观察的天数；
[0020]
图5为实施例及对比例两种不同方案平均脱毒率与对照组方差分析图,wt表示对照组，gw表示实施例高温黑暗处理，sg表示0.1％处理；
[0021]
图6对照组富含内生菌的污染苗株扩繁后的污染率，ck-ex表示不同对照组苗株；
[0022]
图7为仅温度处理的内生菌污染苗株扩繁后的污染率，gw-x表示仅高温处理的不同组别的苗株；
[0023]
图8为脱毒成功的84k银腺杨无菌组培苗生长状态，标尺为1cm，图8a为底部观察结果，图8b为上部观察结果；
[0024]
图9为脱毒成功的无菌组培苗叶片在遗传转化过程中健康生长状态，图9a为培养初期整体观察结果，图9b为培养后期无菌芽点正常生长示意图。
具体实施方式
[0025]
以下结合附图及具体实施例对本发明作进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0026]
本发明提供一种84k银腺杨内生菌快速脱毒方法，其包括如下步骤：
[0027]
首先，挑选84k银腺杨组培苗株，放入恒温箱内，按照下表进行连续三周的高温黑暗处理：
[0028]
表1三周高温黑暗处理
[0029][0030]
然后，在经历过上述三周的高温黑暗处理后，苗株芽端将长出白或嫩黄芽点，对其进行继代，继代培养基为杨树生根扩繁培养基，培养三个月以上，观察，无内生菌感染的苗株即为脱毒成功的84k银腺杨苗株。
[0031]
其中杨树生根扩繁培养基为089生根培养基，其成分如下表：
[0032]
表2089生根培养基
[0033][0034]
本发明以下实施例或对比例中，选用的84k银腺杨组培苗材料时，以华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室课题组保存的84k(p.alba
×
p.glandulosa)银腺杨内生菌污染组培苗为材料，原是经84k野生植株经过冲洗消毒处理后接种于的089生根培养基上进行生根诱导得到的组培苗株，培养温度：25℃，光强：2000lx，光照时间：12h/d。多年继代后，部分植株内生菌开始逐渐严重，统一选用内生菌严重的84k杨组培苗进行实验，其内生菌污染情况如附图1和2所示。选择苗株高至1/3-1/2组培瓶(高10cm)为宜，不含有枯叶、黄叶、褐叶、病菌叶等不正常叶，最好选择深绿叶片，苗株健壮的植株。
[0035]
在本发明的一个具体实施例中，按上述标准挑选实验苗株放入恒温箱内(一般需要进行预先探索，确定苗株适应的最高温，银腺杨苗株适应的最高温度经探索试验确定为40℃)按照表1中的温度梯度处理三周，恒温箱为恒温慢湿试验箱(其交换时间可设置为50s，交换周期可设置为10min),每周及时对温度进行调整。三周后苗株芽端将长出白或嫩黄芽点，进行继代。继代培养基为089生根扩繁培养基(表2)。后期无内生菌污染的组培苗株即为脱毒成功。
[0036]
另外，作为对比例，本发明对目前常用的户外苗株脱毒常用试剂：10％次氯酸钠、
10％过氧化氢、75％酒精、0.1％、低温茎尖、无菌水培、高温处理等方法进行了“试剂+时间”的探索，结果表明这些常用试剂脱毒处理中以0.1％()的效果最佳，以其作为对比例，具体操作步骤为：挑选实验苗株(同上述实施例)，取芽端2-3cm，放入0.1％溶液，浸泡2-3min，置于灭菌水中清洗表面残留，轻微摇晃2-3min，放到灭菌的滤纸上吸干水分，即完成整个消毒流程，后放置于新的089生根扩繁培养基(表2)。后期无内生菌污染的组培苗株即为脱毒成功。
[0037]
对上述实施例和对比例脱毒处理后的苗株进行后续的观察、二次扩繁、三次扩繁等处理，具体结果如下：
[0038]
对于经过三周高温黑暗脱毒处理的实施例，设置了四组实验组(4
×
10株)，一组对照组(5
×
4株)，对照组不作任何脱毒处理。脱毒后(即经历表1中记载的三周共21天的高温黑暗脱毒处理后)，每隔一个月记录无菌苗株。三个月后，21天高温黑暗处理的首次脱毒三个月后的平均脱毒率达47.5％(图3)，每个月与对照组相比均具有显著性差异。在第一个月内，实验组部分未脱毒成功的苗株内生菌便开始生长，两个月后趋于稳定，第三个月仍有部分新污染苗株出现。对照组苗株在第一个月内10株全部反菌，而21天高温黑暗处理的实验组仅部分反菌，可见其对内生菌具有脱毒效果，且反菌的实验组内生菌生长量也明显减少。首次脱毒成功的无菌苗株随机选取进行二次扩繁38株，仅有1株出现反菌情况，脱毒持久率高达97.37％。三次扩繁，4
×
5株，两个月后无反菌情况，脱毒持久率达100％。
[0039]
对于经0.1％处理的对比例，同样设置四组实验组(4
×
10株)，一组对照组(5
×
4株)，对照组不作任何脱毒处理。脱毒后，每隔半个月记录无菌苗株。0.1％处理的苗株对84k杨内生菌抑制效果较好，但因毒害作用较强，在最初的一二次扩繁时，会导致苗株底部生根困难，生根周期长，且部分最初只长愈伤，需要一定的时间缓解，后期不断扩繁后才有根系。三个月后，首次脱毒的平均脱毒率达67.5％(图4)，每次无菌率均与对照组相比具有显著性差异。第一个月反菌率较低，当毒害逐渐消除，第二个月内生菌开始加快生长，部分出现内生菌反菌，后期又逐步稳定。随机挑选首次脱毒无菌苗株，进行二次扩繁后(38株)，两个月后有4株反菌，脱毒持久率达89.47％。三次扩繁，4
×
5株，两个月后有3株反菌，脱毒持久率达85％。
[0040]
图5为实施例和对比例两种不同脱毒方法的平均脱毒率与对照组方差分析图，图中可见短期内对比例的脱毒率更高。但是综合二次及三次扩繁的长期数据对比看，本发明实施例中高温黑暗处理的方法能够更快的获得脱毒率更持久的苗株。
[0041]
图6为实施例及对比例中，未经任何脱毒处理的对照组(5
×
4株)84k杨内生菌污染组培苗进行扩繁一个月后观察到的组培苗内生菌污染情况，污染率为100％，表明已被内生菌污染的组培苗在后续的扩繁过程中100％会继续影响下一代组培苗的生长。
[0042]
在本发明对脱毒方法的另一个尝试中，按照表1中条件对选定的银腺杨苗株(5
×
4株)仅进行连续21天的高温处理，不作全黑暗处理，而是在7：00-21：00时间内进行光照，光强为2000lx，分别在一个月后(gw-1和gw-4组也观察了两个月后的污染率)对内生菌污染进行观察并统计污染率，扩繁苗株在第二个月时，即全部污染，结果如图7所示，不过内生菌长势相对于未处理苗株来说相对减弱。从图7的结果可见，仅进行连续高温处理，而不保证连续的黑暗，脱毒基本失败，脱毒效果不能满足要求。
[0043]
本发明实施例脱毒成功后的苗株在089生根培养基中，能够健康生长，不含有内生
菌污染(图8)，并且在对脱毒后的无菌植株叶片为材料，进行遗传转化实验时，也不会造成培养基皿内的污染，极高地提高转化效率，获得健康的转基因阳性苗株(图9)。
[0044]
基于以上实施例、对比例及相关试验的数据结果，可知本发明21天高温黑暗处理相比于对比例0.1％处理来说，脱毒率相对较低，但无菌持久率长，获得脱毒苗株快。0.1％处理，虽能达到较高脱毒率，但苗株根系缓冲期长，获得正常生根苗株较慢，且无菌持久率相对较短。
[0045]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.84k银腺杨内生菌快速脱毒方法，其特征在于，包括如下步骤：首先，挑选84k银腺杨组培苗株，放入恒温箱内，按照下表进行连续三周的高温黑暗处理：然后，在经历过上述三周的高温黑暗处理后，苗株芽端将长出白或嫩黄芽点，对其进行继代，继代培养基为杨树生根扩繁培养基，培养三个月以上，观察，无内生菌感染的苗株即为脱毒成功的84k银腺杨苗株。2.根据权利要求1所述的84k银腺杨内生菌快速脱毒方法，其特征在于，杨树生根扩繁培养基的组成如下表所示：3.根据权利要求1所述的84k银腺杨内生菌快速脱毒方法，其特征在于，挑选84k银腺杨组培苗株时统一选择株高在10cm规格组培瓶高度1/3-1/2之间的苗株，且苗株为不含有枯叶、黄叶、褐叶或病菌叶的健壮植株。4.根据权利要求1至3任一项所述的84k银腺杨内生菌快速脱毒方法，其特征在于，继代培养时的培养温度为25℃，光强为2000lx,光照时间为12h/d。

技术总结

本发明涉及一种84K银腺杨内生菌快速脱毒方法，其包括如下步骤：首先，挑选84K银腺杨苗株，放入恒温箱内，进行连续三周的高温黑暗处理；然后，在经历过上述三周的高温黑暗处理后，苗株芽端将长出白或嫩黄芽点，对其进行继代培养，培养三个月以上，观察，无内生菌感染的苗株即为脱毒成功的84K银腺杨苗株。本发明以84K银腺杨组培苗为材料，避免了户外野生苗到无菌组培苗的繁琐，缩短脱毒时间，直接以含内生菌的组培苗为实验材料，短时间内获得新的84K杨无菌组培苗。与传统的脱毒技术相比，脱毒效率高，操作简单。避免因试剂过量或浸泡时间过长，而产生过多的残留对苗株造成损伤，同时避免抗生素在配制培养基时的频繁使用。避免抗生素在配制培养基时的频繁使用。避免抗生素在配制培养基时的频繁使用。