一种人工诱导获得伪雌翘嘴鳜鱼的方法与流程

1.本发明属于鱼类遗传育种领域，具体涉及一种人工诱导获得伪雌翘嘴鳜鱼的方法。

背景技术：

2.翘嘴鳜（siniperca chuatsi），属于鲈形目（perciformes），鳜科（sinipercidae），鳜属（siniperca），俗称鳜鱼、桂花鱼。翘嘴鳜为我国特有淡水名贵鱼类，其肉质鲜美，营养丰富，无肌间刺，深受国内外消费者喜爱。据统计，国内鳜鱼养殖年产量达50万吨以上，直接年产值约300亿元，在淡水名贵鱼类养殖中占重大经济地位。由于国内对鳜鱼亲鱼选育和保种问题的忽视，种质退化、近亲繁殖严重、生长减慢、抗病性减弱等问题日渐突出并制约了鳜鱼养殖业的发展。
3.在每年的2-5月，国内鳜鱼需求量很大，销售价格高，但是塘内鳜鱼储量少。近年来，养殖户为获得更高的利润，选择在越冬期后出售鳜鱼。由于翘嘴鳜的生长具有性别二态性，在越冬期前的2-9个生长月期间，雌鱼的生长速度快于雄鱼，而在越冬期后的9-14个生长月内，雌鱼达到性成熟并减慢生长速度，此时雄鱼的生长速度快于雌鱼。同样地，有研究表明，对于1kg以内的翘嘴鳜，雌鱼大雄鱼小，生长至1kg以上时一般雄鱼大雌鱼小。所以，进行全雄翘嘴鳜的养殖有利于培育大规格优质名贵鱼。
4.另外，鱼类的单性养殖在水产中具有重要意义。一方面，单性养殖可获得生长速度更快、规格一致、性腺发育耗能低的体；另一方面，养殖户可以为单性养殖体提供更有利于该性别体生长的养殖条件，从而缩减养殖成本。
5.然而，在现有研究中，翘嘴鳜的全雄育种研究还是空白。而在现有的其它鱼类全雄鱼种的研究中，通过获得与的y染体的特异性dna片段，判断其性别决定为xx/xy型，即雄性异配；因此，进行全雄鳜鱼单性育种首先需要获得yy超雄鱼。现有技术获得超雄鱼的主要途径包括雌核发育和选择育种；其中，雌核发育的技术难度大，且后代成活率低，而选择育种则技术难度较低，且可获得稳定的家系。
6.上述选择育种的技术路线是：将伪雌鱼（xy
♀
）与正常雄鱼（xy
♂
）交配，从而得到yy超雄鱼后代，理论上超雄鱼在后代中占比25%；然后，将获得的超雄鱼与正常雌鱼交配，从而获得基因型全部为xy的雄鱼子代。所以，通过选择育种培育超雄鱼方法中，伪雌鱼（xy
♀
）的获得是全雄育种的关键。

技术实现要素：

7.本发明目的在于提供一种人工诱导获得伪雌翘嘴鳜鱼的方法，实现高效人工诱导雄性翘嘴鳜性逆转，从而获得可产生卵子的伪雌鱼（xy
♀
）。
8.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种人工诱导获得伪雌翘嘴鳜鱼的方法，其特征在于：在翘嘴鳜孵化后20~25天开始，向其投喂经雌性激素处理的麦鲮，连续投喂8~12天
后，转为投喂正常饵料，养至第二年性成熟，然后从性成熟的翘嘴鳜中筛选得到伪雌翘嘴鳜鱼；所述雌性激素处理的麦鲮为：经过含有17-β雌二醇（e2）的饲料投喂的麦鲮。
9.本发明人对翘嘴鳜的性别决定基因研究发现，雄性决定基因在翘嘴鳜孵化后的20~25天，表达量开始显著提高，所以该时期为其性别决定的关键时期。因此，发明人对进行伪雌鱼诱导培育试验过程中，经过大量的试验确定在该时期起短时间（8~12天）间接投喂17-β雌二醇，就能够影响雄性翘嘴鳜的性腺发育和性别分化，得到伪雌翘嘴鳜鱼（xy
♀
）。而且，本发明利用经过17-β雌二醇投喂处理的麦鲮间接喂养翘嘴鳜，既解决翘嘴鳜不直接摄食激素饲料的难题，也实现了翘嘴鳜伪雌鱼的转化。
10.作为本发明的一个实施例，所述含有17-β雌二醇（e2）的饲料中，每千克饲料含12~16g 17-β雌二醇。
11.作为本发明的另一个实施例，每天两次向翘嘴鳜投喂经雌性激素处理的麦鲮，每次投喂量为其体重的5~7%。
12.在翘嘴鳜孵化后20~25天开始，每天于9：00和18：00分别向翘嘴鳜投喂经雌性激素处理的麦鲮，每次投喂0.5h，共投喂8~12天。
13.作为本发明的另一个实施例，培育翘嘴鳜的水体温度为28~32℃，溶氧量6.0~7.5mg/l，ph值7.5~8.5，总氨氮和亚硝酸盐含量分别《0.1mg/l和《0.05mg/l。
14.作为本发明的一个具体实施例，所述经雌性激素处理的麦鲮的处理方法包括：（1）17-β雌二醇溶液的配制：在棕玻璃瓶将17-β雌二醇完全溶解于无水乙醇，得到浓度为12~16g/l的17-β雌二醇溶液；（2）按1l溶液：1kg饲料的比例，将17-β雌二醇溶液喷洒至麦鲮饲料上并搅拌均匀，随后置于阴凉处将酒精晾干；（3）将经17-β雌二醇处理的饲料投喂麦鲮，投喂饲料过程中少量多次，直至麦鲮摄食完所有的饲料，即可用于投喂翘嘴鳜。
15.本发明在投喂麦鲮前对其进行饥饿24h。
16.作为本发明的一个实施例，本发明对进行翘嘴鳜亲本选育及子代培育，挑选连续选育三代的性成熟雌雄鳜鱼进行交配，获得雌雄性别比为1：1的子代，绝大部分子代开口摄食后，投喂正常麦鲮培育至孵化后20~25天，然后开始投喂经雌性激素处理的麦鲮。
17.作为本发明的另一个实施例，所述的筛选为利用翘嘴鳜y染体特异性标记筛选伪雌翘嘴鳜鱼；具体包括：（1）制备本翘嘴鳜y染体分子标记引物对1（“引物对1”参阅专利cn110777210a）；（2）在性成熟的翘嘴鳜中挑选可产生卵子的个体，对其分别进行电子标签标记后剪取少量鳍条提取dna；（3）以步骤（2）中的dna为模板，采用引物对1进行pcr扩增，扩增反应结束后，进行电泳检测，若电泳结果显示具有y染体特异性dna特异性条带，此时所检测的翘嘴鳜鱼dna样品为伪雌鱼（xy
♀
），若电泳结果显示不具有y染体特异性条带，此时所检测的翘嘴鳜鱼dna样品为正常雌性翘嘴鳜鱼。
18.所述筛选的步骤（2）中dna样品制备采用柱式离心法提取翘嘴鳜鱼dna。
19.所述筛选的步骤（3）中采用引物对1进行pcr扩增时，20μl pcr反应体系中包含dna 50 ng，contig-1上游引物和contig-1下游引物各0.8μl，2
×
taq mastermix 10μl，其余用ddh2o补充。
20.所述筛选的步骤（3）中采用引物对进行pcr扩增时，pcr反应程序是：首先94℃预变性2min；再94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；再72℃终延伸5min。
21.所述筛选的步骤（3）进行电泳检测时，采用质量百分含量为1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的长度。
22.所述筛选的步骤（3）电泳结果显示的特异性条带，采用引物对1扩增出特异性条带的分子大小是374bp。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明提供了一种人工诱导获得伪雌翘嘴鳜鱼的方法，具体通过在翘嘴鳜性别决定的关键时期，通过短时间内间接投喂外源性17-β雌二醇（e2）的方式，影响翘嘴鳜性腺发育和性别分化，实现高效人工诱导雄性翘嘴鳜性逆转，从而有效获得伪雌翘嘴鳜鱼，突破翘嘴鳜全雄育种技术关键。
24.（2）本发明利用e2处理后的饲料投喂麦鲮，而后将处理后的麦鲮投喂翘嘴鳜鱼，这种间接投喂的方法既解决了鳜鱼不能直接摄食激素饲料的难题，又解决了鳜鱼养殖水体中积累大量性激素从而污染养殖水体，导致鳜鱼生长不良等问题。而且，本发明在10天内完成对翘嘴鳜的人工诱导，诱导周期短，因而耗时短、人力成本低，节省了生产成本。
25.（3）本发明通过翘嘴鳜雄性特异性标记筛选伪雌鱼（xy
♀
），该方法通过一次pcr反应即可鉴定出伪雌鱼（xy
♀
），避免了耗时耗力的测交鉴定法。就y染体特异性标记鉴定而言，操作简单、成本低，可在一年内筛选出伪雌鱼（xy
♀
）。
26.（4）本发明确定了高效诱导产生伪雌鱼（xy
♀
）的激素种类、投喂方式、投喂浓度及投喂时间，成功开发了诱导雄性翘嘴鳜性逆转技术，并配套翘嘴鳜遗传性别pcr鉴定技术，建立了新的翘嘴鳜伪雌鱼（xy
♀
）生产技术体系，填补了人工诱导培育翘嘴鳜伪雌鱼（xy
♀
）的技术空白，进而为翘嘴鳜的全雄育种提供基础。
附图说明
27.图1为本发明用17-β雌二醇（e2）诱导产生伪雌鱼（xy
♀
）流程图；图2为y染体特异性标记引物对1筛选伪雌鱼（xy
♀
）pcr产物电泳图；图3为翘嘴鳜的性腺石蜡切片图，黑箭头所指为卵原细胞；图4为雌鱼和伪雌鱼（xy
♀
）血清中e2和11-kt含量。
具体实施方式
28.以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。以下具体实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
29.实施例1人工诱导获得伪雌翘嘴鳜鱼的方法，包括以下步骤：1、翘嘴鳜亲本选育及子代培育：挑选连续选育三代的性成熟雌雄鳜鱼进行交配，获得200尾雌雄性别比约为1：1的子代，绝大部分子代开口摄食后，投喂正常麦鲮培育至孵化后20天；鳜鱼培育所用塑料圆桶的规格为650
×
820mm，每个圆桶放置三个充气石，保证供氧充足；胚胎及幼鱼培育温度为28-32℃，溶氧量6.0-7.5mg/l，ph值7.5-8.5，总氨氮和亚硝酸盐含量分别《0.1mg/l和《0.05mg/l；
2、向翘嘴鳜间接投喂17-β雌二醇（e2）诱导性逆转：（1）17-β雌二醇（e2）溶液的配制：计算出所需e2和无水乙醇的总剂量，于棕玻璃瓶将e2溶解于无水乙醇后置于4℃冰箱中储存，得到e2浓度分别为3g/l、6g/l、12g/l的三种溶液，分别对应3g/l、6g/l、12g/l三个试验组；（2）按1l溶液：1kg饲料的比例，将配好的3g/l、6g/l、12g/l的溶液分别喷洒至麦鲮饲料上并搅拌均匀，随后置于阴凉处将酒精晾干；然后将带有e2的麦鲮饲料通过少量多次的方式投喂饥饿了24h的麦鲮，得到经雌性激素处理的麦鲮；其中，由于麦鲮每天摄食饲料的量约为其体重的20%，故每日含有17-β雌二醇的饲料的投喂量约为麦鲮体重的20%；在每日麦鲮摄食完毕后即可将其用于投喂翘嘴鳜。
30.（3）根据发明人研究，翘嘴鳜在孵化后20~25天是性别决定的关键时期，因此本实施例从翘嘴鳜孵化后第20天开始，每天向其投喂步骤（2）中经雌性激素处理的麦鲮，具体为：每天于9：00和18：00投喂，共投喂两次，每次投喂量为鳜鱼体重的7%，投喂0.5h，共投喂10天；（4）投喂10天后停止投喂经雌性激素处理的麦鲮，转为正常饵料投喂与培育，养至第二年性成熟；3、y染体特异性标记筛选伪雌鱼（xy
♀
）（具体方法可参阅专利cn110777210a）：（1）制备y染体分子标记引物对1，包括：contig1上游引物：5
’‑
gctgctttgaagtctgatacatg-3’，contig-1下游引物：5
’‑
tggtttgtcagattgcacctgta-3’（参阅专利cn110777210a的序列表）；（2）在上述步骤2经过e2投喂的性成熟翘嘴鳜中挑选可产生卵子的个体，对其分别进行电子标签标记后剪取少量鳍条提取dna，采用常规柱式离心法（通用型柱式基因组提取试剂盒，背景康为世纪生物科技有限公司），参照说明书操作步骤制备dna样品，并用1%琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计（nanodrop2000）进行质量和浓度检测；（3）以步骤（2）中的dna为模板，采用引物对1进行pcr扩增，20μl pcr反应体系中包含dna 50 ng，contig-1上游引物和contig-1下游引物各0.8μl，2
×
taq mastermix 10μl，其余用ddh2o补充。pcr反应程序是：首先94℃预变性2min；再94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；再72℃终延伸5min。扩增反应结束后，采用质量百分含量为1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的长度。若电泳结果显示具有374bp的特异性dna特异性条带，此时所检测的翘嘴鳜鱼dna样品为伪雌鱼（xy
♀
），若电泳结果显示不具有特异性条带，此时所检测的翘嘴鳜鱼dna样品为正常雌性翘嘴鳜鱼。
31.经过步骤3的筛选，发现3g/l、6g/l试验组中产生卵子的鳜鱼均为雌鱼，在12g/l试验组中则获得可产生卵子的伪雌鱼（xy
♀
），而且雄鱼逆转为伪雌鱼比例达到100%。如图2所示，利用y染体标记筛选伪雌鱼（xy
♀
），具有两条电泳条带的是伪雌鱼。
32.进一步对获得的伪雌鱼（xy
♀
）的性腺组织进行观察，并检测其血清中雌雄激素水平。
33.如图3所示，为12g/l组中伪雌鱼（xy
♀
）的性腺组织石蜡切片图，可以见到伪雌鱼（xy
♀
）的性腺组织中产生了卵原细胞。如图4所示，对伪雌鱼（xy
♀
）和正常雌鱼（xx
♀
）血清中e2和11-kt含量进行测定，结果显示激素含量差异不显著，表明伪雌鱼（xy
♀
）和正常雌鱼（xx
♀
）体内e2和11-kt水平相同。
34.上述实施例中12g/l试验组为优选实施例，本发明在翘嘴鳜孵化后20~25天、17-β雌二醇溶液浓度12~16g/l、投喂时间8~12天、投喂量5~7%的范围中选取任一数值进行人工诱导，也可实现高效诱导雄性翘嘴鳜性逆转，获得可产生卵子的伪雌鱼。
35.本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

技术特征：

1.一种人工诱导获得伪雌翘嘴鳜鱼的方法，其特征在于：在翘嘴鳜孵化后20~25天开始，向其投喂经雌性激素处理的麦鲮，连续投喂8~12天后，转为投喂正常饵料，养至第二年性成熟，然后从性成熟的翘嘴鳜中筛选得到伪雌翘嘴鳜鱼；所述雌性激素处理的麦鲮为：经过含有17-β雌二醇的饲料投喂的麦鲮。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有17-β雌二醇的饲料中，每千克饲料含12~16g 17-β雌二醇。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：每天两次向翘嘴鳜投喂经雌性激素处理的麦鲮，每次投喂量为其体重的5~7%。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在翘嘴鳜孵化后20~25天开始，每天于9：00和18：00分别向翘嘴鳜投喂经雌性激素处理的麦鲮，每次投喂0.5h，共投喂10天。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：培育翘嘴鳜的水体温度为28~32℃，溶氧量6.0~7.5mg/l，ph值7.5~8.5，总氨氮和亚硝酸盐含量分别<0.1mg/l和<0.05mg/l。6.根据权利要求2-5任一项所述的方法，其特征在于：所述经雌性激素处理的麦鲮的处理方法包括：（1）17-β雌二醇溶液的配制：在棕玻璃瓶将17-β雌二醇完全溶解于无水乙醇，得到浓度为12~16g/l的17-β雌二醇溶液；（2）按1l溶液：1kg饲料的比例，将17-β雌二醇溶液喷洒至麦鲮饲料上并搅拌均匀，随后置于阴凉处将酒精晾干；（3）将经17-β雌二醇处理的饲料投喂麦鲮，投喂饲料过程中少量多次，直至麦鲮摄食完所有的饲料，即可用于投喂翘嘴鳜。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：在投喂麦鲮前对其进行饥饿24h。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：对进行翘嘴鳜亲本选育及子代培育，挑选连续选育三代的性成熟雌雄鳜鱼进行交配，获得雌雄性别比为1：1的子代，绝大部分子代开口摄食后，投喂正常麦鲮培育至孵化后20~25天，然后开始投喂经雌性激素处理的麦鲮。

技术总结

本发明公开了一种人工诱导获得伪雌翘嘴鳜鱼的方法，其特征在于：在翘嘴鳜孵化后20~25天开始，向其投喂经17-β雌二醇处理的麦鲮，连续投喂8~12天后，转为投喂正常饵料，养至第二年性成熟，然后从性成熟的翘嘴鳜中筛选得到伪雌翘嘴鳜鱼。该方法通过在翘嘴鳜决定性别的关键时期，短时间内间接向其投喂17-β雌二醇（E2），实现高效人工诱导雄性翘嘴鳜性逆转，从而获得可产生卵子的伪雌鱼（XY