(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810269653.8
(22)申请日 2018.03.29
(71)申请人 齐鲁制药有限公司
地址 250100 山东省济南市高新区新泺大
街317号
(72)发明人 田振平 石鑫磊 韩荣刚 薛琛琛
彭海涛 匡德琦
(51)Int.Cl.
C07K 14/605(2006.01)
C07K 1/02(2006.01)
(54)发明名称
一种索玛鲁肽的新多肽片段及其制备方法
(57)摘要
种用于制备索玛鲁肽的带有保护基的多肽片段。
该新多肽片段在合成索玛鲁肽中减少片段的杂
质，
提高最终产品的纯度。权利要求书2页 说明书11页CN 110317258 A 2019.10.11
C N 110317258
A
1.一种多肽片段，该片段具有如下结构：
R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-R
其中，R1选自Fmoc、Boc、Dde或Cbz；R2选自H、Fmoc、Boc、Mmt或Mtt；R选自OH、F、Cl、Br、I、CN、-Osu。
2.根据权利要求1所述的多肽片段，其特征在于，所述多肽片段选自：
R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH
或R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl
或R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu
3.根据权利要求1所述的多肽片段，其特征在于，所述多肽片段选自Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH、Boc-His-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu、Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu (OtBu)-Gly-OH、Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl。
4.一种多肽片段R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将Cbz-Glu(OtBu)-OH和甘氨酸甲酯盐酸盐溶于四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺和活化助剂1-羟基苯并三氮唑，室温搅拌反应18小时；反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得Cbz-Glu(OtBu)-Gly-OMe；
(2)取Cbz-Glu(OtBu)-Gly-OMe溶于含少量HCl的二氯甲烷中，氮气排空后加入Pd/C催化剂，再通入氢气进行还原反应；反应结束，过滤除去催化剂，滤液直接进行下一步反应；
(3)向上一步滤液中加入Cbz-Aib-OH、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺室温搅拌24小时，反应结束，减压浓
缩除去二氯甲烷，将剩余油状物溶解于乙酸乙酯中，然后分别用10％的硫酸钾溶液、5％的碳酸钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸，柱层析后获得Cbz-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OMe；
(4)上述产物溶于含少量HCl的二氯甲烷中，氮气排空后加入Pd/C催化剂，再通入氢气进行还原反应；反应结束，过滤除去催化剂，滤液旋干；将残留物溶于四氢呋喃，然后加入1mol/L的NaOH溶液，冰浴下反应1小时，反应结束后用冰乙酸调节PH到中性，减压旋蒸，用甲苯减压蒸馏除水；
(5)将浓缩物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入R1-His(R2)-OH、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺(室温搅拌24小时，反应结束，减压浓缩除去二氯甲烷，将剩余油状物溶解于乙酸乙酯中，然后分别用10％的硫酸钾溶液、5％的碳酸钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸，柱层析后获得R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH多肽片段。
5.一种多肽片段R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu的制备方法，其采用液相缩合的方法获得，具体包括以下步骤： 将R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH和N-羟基丁二酰亚胺溶于四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应18小时；反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，经柱层析后获得R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu。
6.一种所述的多肽片段R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl的制备方法，其采用液相缩合的方法获得，具体包括以下步骤：
将式Ⅰ所示的化合物R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH溶于二氯甲烷中，加入适量N, N-二甲基甲酰胺，冰浴下加入氯化亚砜，搅拌十五分钟后撤掉冰浴升温至室温反应；反应结束，减压旋蒸蒸干二氯甲烷和氯化亚砜；经硅胶柱层析后得到产物R1-His(R2)-Aib-Glu (OtBu)-Gly-Cl片段。
一种索玛鲁肽的新多肽片段及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及多肽药物合成领域，具体涉及一种用于制备索玛鲁肽的带有保护基的多肽片段。该多肽片段在合成索玛鲁肽中减少缺失肽片段杂质和消旋杂质，提高最终产品的纯度。
技术背景
[0002]胰高血糖素样肽1(GLP-1)是人体胃肠道黏膜天然分泌的一种“肠促胰素”，可以与胰岛细胞上的受体结合并刺激胰岛素分泌，进而产生降低血糖的作用。GLP-1受体激动剂类降糖药物的优点在于低血糖事件的发生率明显低于胰岛素，而且可以减少食物摄取和延缓胃排空，有利于控制体重，可以保护胰岛β细胞功能。
[0003]索玛鲁肽(Sermaglutide)是一种新的长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，每周皮下注射一次，可使II型糖尿病患者血糖水平大幅改善，并且低血糖风险较低。于此同时，索玛鲁肽还能够通过降低食欲和减少食物摄入量，诱导减肥。此外，索玛鲁肽还能够显著降低II型糖尿病患者重大心血管事件风险。
[0004]索玛鲁肽是继利拉鲁肽(诺和诺德，2010/1/25)、阿必鲁肽(GSK，2014/4/15)、度拉鲁肽(礼来，2014/9/18)、艾塞那肽(AZ，2015/4/28)、和利西拉来(赛诺菲，2016/7/28)5个上市药物之后又一广受关注的GLP-1药物，并于2017年12月7日FDA批准了诺和诺德索玛鲁肽的上市申请。
[0005]索玛鲁肽的肽序结构如下：
[0006]
[0007]目前关于索玛鲁肽的合成方法主要是用固相法逐个氨基酸偶联获得主链序列，然后再在20位Lys的侧链上逐个氨基酸接入或者片段接入。而关于索玛鲁肽片段合成方法的文献报道较少。专利WO2016046753报道了利用片段[1-4]、[5-31]、[5-16]、[17-31]、[5-12]和[13-16]来合成索玛鲁肽的主链序列，专利WO2016046753并未报道片段[1-4]的合成方法，其它片段主要是在树脂上固相合成获得，然后再与其他片段进行偶联。固相合成带有保护基的多肽片段并不能降低固相多肽合成法天然存在的高成 本因素；获得的片段纯度低，不经过纯化直接与其他片段反应，带入产品的杂质也增多；用固相法逐个缩合氨基酸获得片段，每一次的缩合和脱保护工序繁琐，而且都会增加氨基酸消旋的可能，产生消旋杂质。
尤其是用固相多肽合成法来逐步偶联氨基酸合成索玛鲁肽，在引入大位阻的氨基酸Aib后，对后面的His的偶联带来极大的挑战，空间位阻导致偶联效率降低相伴而产生缺失His的片段杂质，同时偶联效率而产生的就是组氨酸的高消旋化。这些原因都会导致产品得纯度和收率的下降，甚至不能生产出合格的产品。
发明内容
[0008]鉴于现有的索玛鲁肽制备方法存在的上述不足，本发明的目的在于提供了一种用于制备索玛鲁肽的带有保护基的新多肽片段。
[0009]术语说明：
[0010]侧链保护基团：指与氨基酸的侧链(即氨基酸通式H2N-C(R)(H)-COOH中的R基)偶联的化学部分，其有助于防止侧链的一部分与多肽合成、加工等步骤中使用的化学物质反应。
[0011]缩合剂：能引起缩合反应的试剂，在多肽合成中，尤指能促进氨基与羧基偶联形成肽键的试剂。
[0012]活化助剂：在多肽缩合反应中，能够协助缩合剂更好的促进缩合反应的试剂，如：抑制缩合反应中消旋杂质的产生、催化加快反应速度等。
[0013]本发明第一方面提供一种用于制备索玛鲁肽的新多肽片段，该片段具有如下结构：
[0014]R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-R
[0015]其中，R1选自Fmoc、Boc、Dde或Cbz；R2选自H、Fmoc、Boc、Mmt或Mtt；R选自OH、F、Cl、Br、I、CN、-OSu。
[0016]优选地，上述多肽片段R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-R选自：
[0017]R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH
[0018]
[0019]或R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Cl
[0020]
[0021]或R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu
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