(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811300710.0
(22)申请日 2018.11.02
(71)申请人 华熙福瑞达生物医药有限公司
地址 250101 山东省济南市高新技术开发
区天辰大街678号
申请人 山东华熙海御生物医药有限公司
(72)发明人 郭文逸 张天萌 孙劭靖 郭学平
(74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所
37218
代理人 贾波
(51)Int.Cl.
C12P 19/04(2006.01)
C12N 1/14(2006.01)
C12R 1/645(2006.01)
(54)发明名称一种发酵生产银耳多糖的方法及所用的发酵培养基(57)摘要本发明公开了一种发酵生产银耳多糖的方法及所用的发酵培养基，该培养基由玉米蛋白粉、硫酸镁、磷酸氢二钾、葡萄糖等有效组分组成。本发明发酵培养基组分极其简单，氮源优选采用有机氮源玉米蛋白粉和无机氮源硝酸盐复配的方式提供，玉米蛋白粉为一种副产品，价格低廉，与现有技术中使用的蛋白胨、酵母粉等有机氮源相比，成本大大降低，仅为有机氮源成本的30～60%。采用本发明培养基发酵生产银耳多糖产量较高，能到12.8g/L以上，且生产周期缩短，这进一步降低了银耳多糖的单位生产成本， 在工业化生产中具有重要意义。权利要求书1页 说明书8页CN 109234334 A 2019.01.18
C N 109234334
A
1.一种银耳多糖发酵培养基，其特征是由以下有效组分组成：玉米蛋白粉3.0～10.0 g/L，硝酸盐0～
2.0 g/L，硫酸镁1.0～2.0 g/L，磷酸氢二钾1.0～2.0 g/L，葡萄糖 40～60 g/L，其中，玉米蛋白粉和硝酸盐的总量为5.0～10.0 g/L。
2.根据权利要求1所述的银耳多糖发酵培养基，其特征是由以下有效组分组成：玉米蛋白粉
3.0～
4.0 g/L，硝酸盐1.0～2.0 g/L，硫酸镁1.0～2.0 g/L，磷酸氢二钾1.0～2.0 g/ L，葡萄糖 40～60 g/L。
3.根据权利要求2所述的银耳多糖发酵培养基，其特征是由以下有效组分组成：玉米蛋白粉3.0 g/L，硝酸盐2.0 g/L，硫酸镁1.5 g/L，磷酸氢二钾1.5 g/L，葡萄糖 50 g/L。
4.根据权利要求1、2或3所述的银耳多糖发酵培养基，其特征是：pH为
5.0～
6.0。
5.根据权利要求1、2或3所述的银耳多糖发酵培养基，其特征是：所述玉米蛋白粉的蛋白含量大于等于60wt%。
6.一种发酵生产银耳多糖的方法，其特征是：包括将银耳种子液接入权利要求1-5中任一项所述的银耳多糖发酵培养基中，发酵培养生产银耳多糖的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是：发酵培养时，发酵条件为：转速800～1000 r/ min，通气量4～6 L/min，温度24～30℃，pH5.0～7.0。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征是：发酵培养时，观察发酵pH曲线，当发酵液pH上升时，流加葡萄糖至浓度为50～60 g/L，流加后再发酵至无残糖时结束发酵。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征是：发酵培养时，种子液的接入量为5～7wt%。
10.根据权利要求6或8所述的方法，其特征是：银耳种子液的培养方法为：将银耳菌种的孢子接入种子培养基中，在24～30℃、150-250r/min的条件下培养3～4 天，得到银耳种子液；种子培养基有效组分组成为：蛋白胨8.0～10.0 g/L，硫酸镁1.0～2.0 g/L，磷酸氢二
钾1.0
~2.0 g/L，葡萄糖15～25 g/L，V B1 10
~
15 mg/L，pH值为5.0～6.5。
权 利 要 求 书1/1页
CN 109234334 A
一种发酵生产银耳多糖的方法及所用的发酵培养基
技术领域
[0001]本发明涉及一种发酵生产银耳多糖所需的发酵培养基，还涉及使用该发酵培养基低成本、高产量发酵生产银耳多糖的方法，属于微生物发酵培养技术领域。
背景技术
[0002]银耳多糖具有补水保湿、抗氧化、抗血栓、抗肝炎、抗突变、抗肿瘤、提高免疫力、降血脂血糖等功效，被广泛应用于美容、医药、保健食品等领域。目前，银耳多糖主要由子实体提取和分生孢子发酵两种方法制备而成。其中，发酵法制备工艺简单、成本低、产量高，且多糖纯度高，具有很好的开发前景。
[0003]为获得更高产量的目标产物，一般都会进行发酵培养基、培养条件的优化，而发酵培养基的成本又直接对发酵产品的工业化生产产生重大影响。氮源是发酵培养基中的一种重要物质，来满足各种微生物生长的需求，蛋白胨和酵母粉为常用的有机氮源，其营养物质丰富，更利于菌体生长和发酵产物生成，但相比于无机氮源，其价格较贵，因此，寻一种低成本发酵培养基具有重要意义。
[0004] 专利CN201710986467.1中公开的发酵培养基的配方为（g/L）：土豆淀粉10，葡萄糖20，胰蛋
白胨10、酵母提取物5、硫酸镁0.2、磷酸氢二钾0.5、氢氧化钠 1，pH为6.5。此配方氮源用量较大，总量为15 g/L。专利CN201810421116 .0中公开的发酵培养基的制备方法为：称取麸皮100～200 g，加500 mL水，煮沸15～20 min，过滤得到滤液，加入蛋白胨5～7 g，葡萄糖10～15 g，可溶性淀粉5～10 g，磷酸二氢钾 4 g，硫酸镁 2 g，植物浸提液100～500 mL，以水补足1L，pH值为5.5～6.0。此配方制备复杂，不利于工业化生产，且蛋白胨用量较高，银耳多糖产量提高67.75%～99.81%。专利CN201210004097.4中公开的发酵培养基配方（g/L）为：葡萄糖30，蛋白胨8，硫酸镁2.5，YNB（无氨基酵母氮源）2，磷酸二氢钾 0.5，pH值6.0，5L罐发酵最终银耳多糖产量9.5g/L，该专利银耳多糖产量较高，但蛋白胨用量较大，成本较高。专利CN200910019462.7中公开的发酵培养基配方（g/L）为：葡萄糖 20，蛋白胨 2，酵母粉 2，硫酸镁 0.5，磷酸二氢钾 0.46，磷酸氢二钾 1，摇瓶发酵4.5天后，银耳多糖产量5.8 g/L，银耳多糖产量较低。文献《银耳菌液体发酵工艺优化及卵孢菌素鉴定》中公开的发酵培养基为：葡萄糖50 g/L，谷氨酸3 g/L和甘氨酸 3 g/L，磷酸二氢钾0.46 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，硫酸镁1 g/L，pH值为6.0，5L罐中孢外多糖产量5.94±0.27 g/L，其使用谷氨酸和甘氨酸作为氮源，成本较低，但是银耳多糖含量也较低。文献《平菇深层发酵技术及其多糖分离纯化研究》中公开的发酵培养基（g/L）为：葡萄糖 60, 硫酸铵 3，玉米浆 5，硫酸镁 1，磷酸二氢钾 1，平菇多糖产量为5.22 g/L（10L发酵罐），其使用了低成本的玉米浆和硫酸铵作为氮源，但是多糖产量较低。
发明内容
[0005]针对现有技术中存在的银耳多糖发酵培养基成本高以及银耳多糖产量不高的问题，本发明提供了一种银耳多糖发酵培养基，该培养基成分简单、价格低廉，银耳多糖产量
高。
[0006]本发明还提供了一种发酵生产银耳多糖的方法，该方法使用本发明特制培养基，降低了生产成本、缩短了发酵周期、提高了银耳多糖产量，便于工业化推广应用。
[0007]本发明具体技术方案如下：
一种银耳多糖发酵培养基，其由以下有效组分组成：玉米蛋白粉3.0～10.0 g/L，硝酸盐0～2.0 g/L，硫酸镁1.0～2.0 g/L，磷酸氢二钾1.0～2.0 g/L，葡萄糖 40～60 g/L，其中，玉米蛋白粉和硝酸盐的总量为5.0～10.0 g/L。该培养基为液态，各有效组分存在在水中，即各有效组分在水中的含量为：玉米蛋白粉3.0～10.0 g/L，硝酸盐0～2.0 g/L，硫酸镁1.0～2.0 g/L，磷酸氢二钾1.0～2.0 g/L，葡萄糖 40～60 g/L，其中，玉米蛋白粉和硝酸盐的总量为5.0～10.0 g/L。
[0008]进一步的，上述银耳多糖发酵培养基的pH为5.0～6.0。
[0009]进一步的，上述银耳多糖发酵培养基中，所述玉米蛋白粉的蛋白含量应大于等于60wt%，本发明玉米蛋白粉通过市购即可获得。玉米蛋白粉含有丰富的蛋白质，氨基酸组成均衡，且其为玉米淀粉生产
过程中的一种副产物，绿环保，价格低廉。
[0010]进一步的，所述硝酸盐可以是任意可用作培养基成分的水溶性硝酸盐，例如硝酸钠、硝酸钾等。
[0011]发酵培养基提供微生物生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机元素、生长因子等。而培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品的质量和产量都有重要的影响。本发明中，葡萄糖提供碳源，硝酸盐和玉米蛋白粉提供氮源，硫酸镁和磷酸氢二钾提供无机元素，玉米蛋白粉除作为氮源外，还可以提供一定量的生长因子。因此，本发明发酵培养基仅需5种有效成分即可满足银耳菌种的发酵需求。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。一般情况下，氮源的价格高于其它成分的价格，为培养基成本的主要限制因素，且有机氮高于无机氮，而本发明中，氮源总用量较低，且采用无机氮硝酸盐和有机氮玉米蛋白粉复配的方式提供氮源，更加降低了有机氮的用量，降低了氮源的成本，从而降低了培养基成本。硝酸盐和玉米蛋白粉均为常见氮源，价格低、易购买。发酵早期，微生物首先利用硝酸盐，随着发酵的进行，中期时，代谢酶系已形成，此时菌种开始利用有机氮，菌种开始利用玉米蛋白粉，其除含有丰富的氨基酸和小肽外，还含有其它无机盐和生长因子，营养物质更丰富，因此，在不同的发酵时期，菌种分别利用不同来源的氮源，从而缩短了发酵时间，也提高了银耳多糖的产量。[0012]优选的，发酵培养基由以下有效组分组成：玉米蛋白粉3.0～4.0 g/L，硝酸盐1.0～2.0 g/L，硫酸镁1.0～2.0 g/L，磷酸氢二钾1.0～2.0 g/L，葡萄糖 40～60 g/L。[0013]更优选的，发酵培养基由以下有效组分组成：玉米蛋白粉3.0 g/L，硝酸盐2.0 g/
L，硫酸镁1.5 g/L，磷酸氢二钾1.5 g/L，葡萄糖 50 g/L。
[0014]本发明还提供了一种发酵生产银耳多糖的方法，该方法包括将银耳种子液接入上述银耳多糖发酵培养基中、发酵培养生产银耳多糖的步骤。
[0015]进一步的，发酵培养时，发酵条件为：转速800～1000 r/min，通气量4～6 L/min，温度24～30℃，pH5.0～7.0。
[0016]进一步的，发酵培养时，观察发酵pH曲线，当发酵液pH上升时，流加葡萄糖至浓度为50～60 g/L，流加后再发酵至无残糖时结束发酵。
[0017]进一步的，发酵培养时，种子液的接入量为5～7wt%。
[0018]进一步的，所用的银耳种子液可以采用现有技术公开的方法进行，这对于本领域技术人员来说没有难度。在本发明具体实施方式中，可以采用以下方式制备银耳种子液：将银耳菌种的孢子接入种子培养基中，在24～30℃、150-250r/min的条件下培养3～4 天，得到银耳种子液；种子培养基为液态，水为基质，有效组分组成为：蛋白胨8.0～10.0 g/L，硫
酸镁1.0～2.0 g/L，磷酸氢二钾1.0
~2.0 g/L，葡萄糖15～25 g/L，V B1 （维生素B1）10
~
15
mg/L，pH值为5.0-6.5。
[0019]进一步的，种子培养基和发酵培养基均灭菌后使用。
[0020]本发明提供了一种银耳多糖发酵生产时所需的发酵培养基，该培养基组分极其简单，氮源优选采用有机氮源玉米蛋白粉和无机氮源硝酸盐复配的方式提供，玉米蛋白粉为一种副产品，价格低廉，与现有技术中使用的蛋白胨、酵母粉等有机氮源相比，成本大大降低，仅为有机氮源成本的30～60%。采用本发明培养基发酵生产银耳多糖产量较高，能到12.8 g/L以上，且生产周期缩短，这进一步降低了银耳多糖的单位生产成本，在工业化生产中具有重要意义。
具体实施方式
[0021]下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。
[0022]下述实施例和对比例中，所用各成分均从市场中购买得到，其中所用玉米蛋白粉含量大于60%，大豆蛋白粉中蛋白的含量大于50%。
[0023]下述实施例中，如无特别说明，所述银耳多糖含量均为孢外银耳多糖含量。[0024]培养基筛选
实施例1 发酵培养基氮源含量优化
（1）培养基配制：
种子培养基：蛋白胨 10 g/L，葡萄糖 20 g/L，磷酸氢二钾 1.5 g/L，硫酸镁 1.5 g/L 和V B1 15 mg/L，pH值为6.0。
[0025]发酵培养基：本实施例对四组玉米蛋白粉不同浓度的发酵培养基进行试验，各发酵培养基配方如下：
发酵培养基1：玉米蛋白粉 10 g/L，葡萄糖 50 g/L，磷酸氢二钾 1.5 g/L，硫酸镁 1.5 g/L，pH值为6.0；
发酵培养基2：玉米蛋白粉 7.5 g/L，葡萄糖 50 g/L，磷酸氢二钾 1.5 g/L，硫酸镁 1.5 g/L，pH值为6.0；
发酵培养基3：玉米蛋白粉 5.0 g/L，葡萄糖 50 g/L，磷酸氢二钾 1.5 g/L，硫酸镁 1.5 g/L，pH值为6.0；
发酵培养基4：玉米蛋白粉 2.5 g/L，葡萄糖 50 g/L，磷酸氢二钾 1.5 g/L，硫酸镁 1.5 g/L，pH值为6.0。
[0026]（2）发酵：
将银耳菌种的孢子接入装液量300 mL的种子培养基中，26℃下、200 r/min摇瓶发酵3
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