马来酸依那普利叶酸片联合阿托伐他汀钙片在制备高血压合并颈动脉硬化药物的应用

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种马来酸依那普利叶酸片联合阿托伐他汀钙片在制备高血压合并颈动脉硬化药物的应用。

背景技术：

2.高血压是临床常见的心血管疾病之一，严重威胁人类的健康和生命。高血压可以引起血管重构，是心脑血管病最主要的危险因素。其疾病因素多种多样，有遗传、环境、生活习惯等。hcy是蛋氨酸及半胱氨酸在机体内代谢过程中产生的一种含硫氨基酸，以基因及营养因素为主的多种原因均可导致血中hcy水平增高。依叶片是我国自主研发的兼有降低血压和hcy水平双重功效的固定配方制剂。马来酸依那普利叶酸片（依叶片）是临床上高血压的药物，叶酸为hcy转变为蛋氨酸提供甲基，又可以增加hcy代谢过程中酶的活性，被认为是高血压最有效的药物。他汀类药物是目前国内外流行的用于降低胆固醇, 预防心血管疾病的药物。他汀类药物降血脂作用机制是能竞争性抑制3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶a（hmg-coa）还原酶。阿托伐他汀片（立普妥）是他汀类药物的一种。
3.高血压是一种慢性逐渐发展的疾病，如长期得不到有效，最终可以合并心脑血管严重并发症导致死亡。血脂异常是高血压动脉粥样硬化的独立危险因素之一。近年来，随着人们生活水平的提高，饮食结构的不合理，高血压合并高血脂的患者越来越多。据临床资料显示，高血压患者患动脉粥样硬化较正常人患此病的高 3-4倍。
4.本发明通过蛋氨酸作用于细胞和动物建立自发性高血压模型，成功建立自发性高血压模型后给予依叶片和立普妥干预。为自发性高血压的防治提供新的理论依据，并为临床规范自发性高血压提供新的策略，因此提供了一种马来酸依那普利叶酸片联合阿托伐他汀钙片在制备高血压合并颈动脉硬化药物的应用。

技术实现要素：

5.本发明旨在解决临床迫切需要解决的问题和疾病的发病机理，根据蛋氨酸作用于动物建立自发性高血压模型，提供了马来酸依那普利叶酸片联合阿托伐他汀钙片在高血压合并颈动脉硬化上的作用。
6.为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：一种马来酸依那普利叶酸片联合阿托伐他汀钙片在制备高血压合并颈动脉硬化药物的应用，所述马来酸依那普利叶酸片与阿托伐他汀钙片的给药剂量之比为100:9。
7.优选的，所述高血压为h型高血压（高血压合并高同型半胱氨酸）。
8.本发明还提供了一种药物制剂，包括有效量的马来酸依那普利叶酸片和阿托伐他汀钙片，以及药学上可接受的载体或辅料。
9.优选的，所述药物制剂为口服制剂或注射制剂。
10.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
2305，中杉金桥中国北京，1/2000)；rabbit polyclonal anti-grp78 bip(100ul ab21685，abcam美国，1/1000）；mouse monoclonal anti-grp94（100ul ab2791，abcam美国，1/5000）；rabbit polyclonal anti-caspase-12(100ul ab62484，abcam美国，1/1000）；辣根酶标记山羊抗兔igg（h+l）(100ul zb-2301，中杉金桥中国北京，1/2000)；大鼠hcy试剂盒（一盒mm-0293r1，酶免中国江苏）；t-cho试剂盒（a111-1，南京建成中国江苏）；tg试剂盒（a110-1，南京建成中国江苏）；超高分辨率小动物彩多普勒超声实时影像系统(vevo
®
2100超高分辨率小动物彩多普勒超声实时影像系统，visualsonics inc.)；；荧光pcr仪[cfx connect
™
实时，伯乐生命医学产品（上海）有限公司美国]；蛋白垂直电泳仪（dyy-6c，北京市六一仪器厂中国北京）；超高灵敏度化学发光成像系统[chemidoctm xrs+，伯乐生命医学产品（上海）有限公司美国]；多功能酶标仪（s/n502000011，tecan美国）；荧光显微镜(ckx53，olympus日本)；无创尾动脉血压测量分析系统（zs-z，北京众实迪创科技发展有限公司中国北京）。
[0018]
二、实验方法本发明通过蛋氨酸喂养大鼠，采用依叶片和立普妥单独或联合喂养大鼠8周后，检测各组血压和颈动脉厚度，elisa检测各组同型半胱氨酸(hcy)的浓度，生化检测各组甘油三酯（tg）、总胆固醇（tc）、高密度脂蛋白胆固醇（hdl-c）的含量，he染观察各组颈动脉结构，荧光定量pcr和western blot检测各组葡萄糖调节蛋白94（grp94）、半胱氨酸门冬氨酸特异性蛋白激酶12（caspase-12）和葡萄糖调节蛋白78（grp78）表达；16s rdna高通量检测各组菌多样性及丰度。
[0019]
1、动物实验分组：将30只大鼠随机分为五个组，正常对照组（control）、蛋氨酸颗粒组（model）、蛋氨酸颗粒+依叶片组（efa）、蛋氨酸颗粒+立普妥组（lipitor）、蛋氨酸颗粒+依叶片+立普妥组（efa+lipitor），每组各6只。control组大鼠经标准饲料喂养同时给予双蒸水灌胃8周，剂量为1ml/200g；model组大鼠经2%蛋氨酸颗粒饲料喂养同时给予双蒸水灌胃8周，剂量为1ml/200g；efa组大鼠经2%蛋氨酸颗粒饲料喂养同时给予浓度为4mg/ml的依叶片溶液灌胃8周，剂量为1ml/200g；lipitor组大鼠经2%蛋氨酸颗粒饲料喂养同时给予为浓度为0.36mg/ml的立普妥溶液灌胃8周，剂量为1ml/200g；efa+lipitor组大鼠经2%蛋氨酸颗粒饲料喂养同时给予浓度为4mg/ml的依叶片溶液和浓度为0.36mg/ml的立普妥溶液灌胃8周，剂量均为1ml/200g。
[0020]
2、荧光定量pcr各组进行rna的提取，提取rna后根据逆转录试剂盒合成cdna，以cdna为模板，在荧光定量pcr仪上进行检测，以gapdh为内参，计算出各组测grp94、caspase-12和grp78表达情况。
[0021]
操作体系：rnase free dh20
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9.5ulcdna/dna
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1ul上游引物
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1ul下游引物
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12.5ul
反应程序，三步法：步骤温度时间预变性
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10min变性
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10s退火
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30s延伸
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72℃30s循环
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40次融解曲线分析温度时间95℃
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1min95℃
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15s引物如下：3、western blot取各组样本加入相应的裂解液，4℃裂解30 min，在10000 rpm/min离心10 min，小心吸取上清，即得总蛋白。利用bca试剂盒进行蛋白浓度测定。蛋白变性、上样、电泳1-2 h，湿法转膜30-50 min。4℃孵育一抗溶液过夜；室温孵育二抗1-2h。在膜上滴加ecl曝光液，曝光。用“quantity one”软件分析各抗体条带灰度值。
[0022]
4、血压测定打开无创血压测量仪开启预热，大鼠置于固定筒内露出尾部，将大鼠尾部通过加压套插入至接近尾根部，同时鼠尾穿过脉搏传感器，使鼠尾尾动脉刚好处于脉搏传感器的“脉搏信号传感片”上方，并调节鼠尾压迫片使传感片紧贴鼠尾下方的尾动脉，待大鼠脉搏稳定后进行血压测量。
[0023]
5、超声检测药物干预8周后，采用超高分辨率小动物彩多普勒超声实时影像系统，频率为15mhz，检测各组大鼠颈动脉厚度，每组3只。超声检测前先用脱毛膏脱去颈部毛发，打开超声检测仪，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠并将大鼠固定于平板操作台上，在脱毛部位及探头
涂上耦合剂，移动探头到颈动脉采集数据。
[0024]
6、elisa 检测分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl，然后再加待测样品 10μl（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。每孔加入酶标试剂 100μl，空白孔除外。用封板膜封板后置 37 ℃温育 60 min。将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 s后弃去，如此重复 5 次，拍干。每孔先加入显剂a 50μl，再加入显剂b 50μl，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显 15 min。每孔加终止液 50μl，终止反应。以空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的吸光度（od 值）。测定应在加终止液后 15 min以内进行。
[0025]
7、生化检测按照相应生化试剂盒进行检测。
[0026]
8、he染取出组织流水冲洗数小时，经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯ⅰ15min、ⅱ15min（至透明为止）。放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡ⅰ、石蜡ⅱ透蜡各50-60分钟。石蜡包埋，切片。将石蜡切片进行烤片，然后脱蜡，水化。将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染3min，盐酸乙醇分化液分化15s，稍水洗，返蓝液返蓝15s，流水冲洗，伊红染3min，流水冲洗，脱水，透明，封片，镜检。
[0027]
9、16srdna 高通量测序上机测序前，需要先对文库在agilent bioanalyzer上进行质检，采用agilent high sensitivity dna kit。合格的文库有且只有单一的峰，且无接头。之后，采用quant-itpicogreendsdna assay kit在promegaquantifluor荧光定量系统上对文库进行定量，合格的文库浓度应在2nm以上。将合格的各上机测序文库（index序列不可重复）梯度稀释后，根据所需测序量按相应比例混合，并经naoh变性为单链进行上机测序；使用miseq测序仪进行2
×
300bp的双端测序，相应试剂为miseq reagent kit v3 (600 cycles)。
[0028]
10、统计学分析所有数据均采用spss 19.0进行统计分析，经单因素方差分析显著性差异，以p＜0.05作为显著性差异。
[0029]
三、实验结果1、各组动物颈动脉厚度与血压结果如附图1所示，与control组相比，model组的颈动脉厚度与血压表达明显升高，差异具有统计学意义（*p＜0.05）；与model组相比，efa组、lipitor组和efa+lipitor组颈动脉厚度与血压明显下降，其中efa+lipitor组下降的更加明显，差异具有统计学意义（
#
p＜0.05）。
[0030]
2、各组动物血浆hcy和血清 tg、tc、hdl-c的含量如附图2所示，与control组相比，model组的hcy、tg、tc的含量明显升高，hdl-c的含量明显下降，差异具有统计学意义（*p＜0.05）；与model组相比，efa组、lipitor组和efa+lipitor组的细胞hcy、tg、tc的含量明显下降，hdl-c的含量明显升高，其中efa+lipitor组更加明显，差异具有统计学意义（
#
p＜0.05）。
[0031]
3、各组大鼠颈动脉组织he染结果如附图3所示，正常control组颈动脉管壁结构正常，未见泡沫细胞和粥样斑块形成；model组颈总动脉管腔狭窄，管壁内膜增厚，大量泡沫细胞和纤维细胞增生；efa组、lipitor组和efa+lipitor组颈动脉管壁趋于正常，未见泡沫细胞和粥样斑块形成。
[0032]
4、各组动物grp94、caspase-12和grp78表达结果如附图4所示，与control组相比，model组的grp94、caspase-12和grp78表达明显升高，差异具有统计学意义（*p＜0.05）；与model组相比，efa组、lipitor组和efa+lipitor组的grp94、caspase-12和grp78表达明显下降，差异具有统计学意义（
#
p＜0.05）。
[0033]
5、各组动物肠道菌多样性韦恩图分析如附图5所示，维恩图显示了各组大鼠肠道菌在研究中独特的和共享的分类单元。a为control组肠道菌分布情况；b为model组肠道菌分布情况；c为 efa组单一处理给予保护组；d为lipitor组单一处理给予保护组；e 为efa+lipitor组混合处理给予保护组。可知control组、model组、efa组、lipitor组和efa+lipitor组的唯一otus分别为735、436、669、1027和577个，这5组常见的otu数目为553个。这些结果表明，shr模型组大鼠肠道菌数量减少，但是通过单独或联合后肠道菌数量得到恢复。
[0034]
6、各组动物肠道菌分类组成分析如附图6、7所示，不同药物处理后对shr大鼠肠道菌分类组成产生了影响。所有实验组粪便样本中最丰富的5个细菌落的门进行分析，从门组成分析，大鼠粪便中厚壁菌门(firmicutes)最多，其次为拟杆菌门(bacteroidetes)，疣微菌门(verrucomicrobia），变形菌门(proteobacteria)和放线菌门(actinobacteria)。其中f/b比值是高血压患者肠道菌失调的标志，分析各组f/b比值可见，与正常control组相比，model组的f/b比值都明显上升，差异具有统计学意义（*p＜0.05）；与model组相比，efa组、lipitor组和efa+lipitor组的比值都明显下降，差异具有统计学意义（
#
p＜0.05）。由结果可知，经efa或lipitor单独或efa+lipitor组混合后能够调节菌分布使f/b比值得到一定程度的恢复。
[0035]
7、不同体的pcoa主坐标分析如附图8所示，采用加权unifrac分析计算不同组间粪便样本之间的距离。每个轴百分比描述了一维所占的变化量。通过在三维图中比较各组样品，可以观察到3个簇之间有明显的分离。其中正常control组与model组之间有显著的簇分离，而efa或lipitor单独后使这两组的肠道菌也发生了变化。结果efa+lipitor组恢复了与正常control组之间的菌种移位。
[0036]
最后应说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种马来酸依那普利叶酸片联合阿托伐他汀钙片在制备高血压合并颈动脉硬化药物的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述马来酸依那普利叶酸片与阿托伐他汀钙片的给药剂量之比为100:9。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述高血压为h型高血压。4.一种药物制剂，其特征在于：包括有效量的马来酸依那普利叶酸片和阿托伐他汀钙片，以及药学上可接受的载体或辅料。5.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于：所述药物制剂为口服制剂或注射制剂。