(19)中华人民共和国国家知识产权局
| (12)发明专利说明书 | |
| (10)申请公布号 CN 101067124 A (43)申请公布日 2007.11.07 |
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(21)申请号 CN200710093669.X
(22)申请日 2003.07.25
(71)申请人 味之素株式会社
地址 日本东京都中央区京桥一丁目15-1
(72)发明人 原诚一 横关健三 阿部巧 外内尚人 城岛恭子
(74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公司
代理人 刘玥
(51)Int.CI
C12N9/00
C12N15/52
C12N1/21
C12P21/02
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及不必通过复杂的合成方法即可容易地、廉价地和高产率地生产肽的新型酶。更具体地，本发明提供了催化由羧基成分和胺成分的肽合成反应的新型酶，产生该酶的微生物，和采用该酶或该微生物的廉价的二肽生产方法。本发明揭示了能从稳杆菌属新发现的细菌中有效合成肽的新型酶，且揭示了简易且廉价的生产二肽的方法。 | |
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法律状态
法律状态公告日 | 法律状态信息 | 法律状态 |
2023-08-25 | 专利权有效期届满IPC(主分类):C12N 9/00专利号:ZL200710093669X申请日:20030725授权公告日:20110727 | 专利权的终止 |
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权 利 要 求 说 明 书
1.编码选自(A)和(M)的蛋白质的DNA，其中所述蛋白质具有如下定义的氨基酸序列：
(A)由SEQ ID NO：6的23-616位氨基酸残基组成的氨基酸序列，或
(M)由SEQ ID NO：6组成的氨基酸序列。
2.一种包含根据权利要求1的DNA的重组DNA。
3.一种包含根据权利要求2的重组DNA的转化细胞。 4.一种生产肽生成酶的方法，包括：
在培养基中，在适于生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求3的转化细胞一段时期，和
在培养基和/或转化细胞中累积肽生成酶。
5.一种生产二肽的方法，包括：
在培养基中，在适于在培养物中生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求3的转化细胞一段时期，和
将培养物与羧基成分和胺成分混合，通过由所述DNA所编码的肽生成酶所促进的酶催化作用，来合成二肽。
6.根据权利要求5的生产二肽的方法，其中所述细胞是属于鞘氨醇杆菌属的具有由羧基成分和胺成分生成二肽的能力的微生物。
7.根据权利要求5或6的生产二肽的方法，其中所述细胞是从所述培养物中分离的。
8.根据权利要求5或6的生产二肽的方法，其中所述细胞是经处理的微生物细胞产物。
9.编码选自(B)和(N)的蛋白质的DNA，其中所述蛋白质具有如下定义的氨基酸序列：
(B)在SEQ ID NO：6的23-616位氨基酸残基中，置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的，且在50℃和pH 8下，具有SEQ ID NO：6的23-616位无突变的氨基酸残基所对应的蛋白质的至少50％的肽生成活性的氨基酸序列，或
(N)成熟蛋白质区，其具有在SEQ ID NO：6的氨基酸序列中，包括置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的的氨基酸序列，且其在50℃和pH 8下，具有无突变的SEQ ID NO：6所对应的蛋白质的至少50％的肽生成活性。
10.根据权利要求9的DNA，其中所述多个是2-50个氨基酸残基。
11.一种包含根据权利要求9的DNA的重组DNA。
12.一种包含根据权利要求11的重组DNA的转化细胞。
13.一种生产肽生成酶的方法，包括：
在培养基中，在适于生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求12的转化细胞一段时期，和
在培养基和/或转化细胞中累积肽生成酶。
14.一种生产二肽的方法，包括：
在培养基中，在适于在培养物中生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求12的转化细胞一段时期，和
将培养物与羧基成分和胺成分混合，通过由所述DNA所编码的肽生成酶所促进的酶催化作用，来合成二肽。
15.根据权利要求14的生产二肽的方法，其中所述细胞是属于鞘氨醇杆菌属的具有由羧基成分和胺成分生成二肽的能力的微生物。
16.根据权利要求14或15的生产二肽的方法，其中所述细胞是从所述培养物中分离的。
17.根据权利要求14或15的生产二肽的方法，其中所述细胞是经处理的微生物细胞产物。
18.选自(a)和(m)的DNA，其中所述DNA具有如下定义的碱基序列：
(a)由SEQ ID NO：5的127-1908位碱基组成的碱基序列，或
(m)由SEQ ID NO：5的61-1908位碱基组成的碱基序列。
19.一种包含根据权利要求18的DNA的重组DNA。
20.一种包含根据权利要求19的重组DNA的转化细胞。
21.一种生产肽生成酶的方法，包括：
在培养基中，在适于生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求20的转化细胞一段时期，和
在培养基和/或转化细胞中累积肽生成酶。
22.一种生产二肽的方法，包括：
在培养基中，在适于在培养物中生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求20的转化细胞一段时期，和
将培养物与羧基成分和胺成分混合，通过由所述DNA所编码的肽生成酶所促进的酶催化作用，来合成二肽。
23.根据权利要求22的生产二肽的方法，其中所述细胞是属于鞘氨醇杆菌属的具有由羧基成分和胺成分生成二肽的能力的微生物。
24.根据权利要求22或23的生产二肽的方法，其中所述细胞是从所述培养物中分离的.
25.根据权利要求22或23的生产二肽的方法，其中所述细胞是经处理的微生物细胞产物。
26.选自(b)和(n)的DNA，其中所述DNA具有如下定义的碱基序列：
(b)在严紧条件下，与具有与SEQ ID NO：5的127-1908位碱基的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交的，且编码在50℃和pH 8下，具有SEQ ID NO：5的127-1908位无突变的碱基所编码的蛋白质的至少50％的肽生成活性的蛋白质的碱基序列，或
(n)在严紧条件下，与具有与SEQ ID NO：5的61-1908位碱基的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交的，且编码在50℃和pH 8下，具有SEQ ID NO：5的61-1908位无突变的碱基所编码的蛋白质的至少50％的肽生成活性的蛋白质的碱基序列。
27.一种包含根据权利要求26的DNA的重组DNA。
28.一种包含根据权利要求27的重组DNA的转化细胞。
29.一种生产肽生成酶的方法，包括：
在培养基中，在适于生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求28的转化细胞一段时期，和
在培养基和/或转化细胞中累积肽生成酶。
30.制备二肽的方法，包括：
在培养基中，在适于在培养物中生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求28的转化细胞一段时期，和
将培养物与羧基成分和胺成分混合，通过由所述DNA所编码的肽生成酶所促进的酶催化作用，来合成二肽。
31.根据权利要求30的生产二肽的方法，其中所述细胞是属于鞘氨醇杆菌属的具有由羧基成分和胺成分生成二肽的能力的微生物。
32.根据权利要求30或31的生产二肽的方法，其中所述细胞是从所述培养物中分离的。
33.根据权利要求30或31的生产二肽的方法，其中所述细胞是经处理的微生物细胞产物。
34.根据权利要求26的DNA，其中严紧条件是在相当于1×SSC和0.1％SDS的盐浓度下，于60℃进行洗涤的条件。
35.一种包含根据权利要求34的DNA的重组DNA。
36.一种包含根据权利要求35的重组DNA的转化细胞。
37.一种生产肽生成酶的方法，包括：
在培养基中，在适于生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求36的转化细胞一段时期，和
在培养基和/或转化细胞中累积肽生成酶。
38.制备二肽的方法，包括：
在培养基中，在适于在培养物中生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求36的转化细胞一
段时期，和
将培养物与羧基成分和胺成分混合，通过由所述DNA所编码的肽生成酶所促进的酶催化，来合成二肽。
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