[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101353372A [43]公开日2009年1月28日
[21]申请号200810071520.6[22]申请日2008.08.04
[21]申请号200810071520.6
[71]申请人林峻
地址350000福建省福州市晋安区连江中路189
号连潘东小区5座602单元
[72]发明人林峻 [51]Int.CI.C07K 14/00 (2006.01)C12N 15/09 (2006.01)C12N 15/11 (2006.01)
C40B 10/00 (2006.01)
G06F 19/00 (2006.01)
权利要求书 3 页 说明书 16 页 附图 2 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明属于生命科学领域，具体涉及一种根据
级结构信息等等其它有用信息，分析其分子特性，
因序列突变，之后通过筛选，获得具有目的特性的
新型蛋白质分子的定向进化方法。本发明的定向进
化技术结合了理性过程和随机过程的优势。
200810071520.6权 利 要 求 书第1/3页 1.一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其主要流程是：通过使用X 射线衍射法、NMR法等等实验方法解析作为进化起点的蛋白质分子的空间结构。或者使用计算机技术，根据蛋白质分子的序列信息，模拟其空间三维结构。进而根据得到的三维结构信息，或者根据该蛋白质分子的其它信息(如序列信息、二级结构信息等等所有有用的信息)，分析其分子特性，理性选择目的突变位点，并进行随机重复递推式基因序列突变，之后通过筛选，获得具有目的特性的新型蛋白质分子。其主要特征是：结合了理性过程和随机过程的优势。 2.根据权利要求1所述的一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其特征是在获取蛋白质分子的空间三维结构时，既可以使用X射线衍射法、NMR法等等实验方法，也可以使用计算机模拟方法。
3.根据权利要求1所述的一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其特征是在获取蛋白质分子的基因和序列信息时，既可以使用基因工程学原理，用PCR法或者文库法等等方法，得到目的蛋白质分子的基因片段，然后再使用“酶切”、“连接”、“转化”等等实验技术，将目的基因片段连上载体，导入宿主菌并保存。之后对基因进行测序，获得基因的碱基序列，根据三联密码子，由基因序列转换得到氨基酸序列；也可以通过搜索Genbank、EMBL、DDBJ等等国际序列数据库，获得目的蛋白质分子的核酸序列和氨基酸序
列，使用全基因合成法，合成目的基因。
4.根据权利要求1所述的一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其特征是其中的“突变位点”定义为：既可以是蛋白质分子上的一个单氨基酸残基及其对应的D N A和R N A上的碱基位点，也可以是包含有多个氨基酸残基的序列区域以及它们所对应的D N A和R N A上的多个碱基组成的序列区域。“突变位点”的选择既可以根据蛋白质分子三维结构信息，也可以根据如序列信息、二级结构信息等等所有有用的信息。
5.根据权利要求1所述的一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其特征是其中的“随机重复递推式基因序列突变”中“随机”的主要过程为：在确定了突变位点之后，对编码蛋白质的DNA序列或RNA序列进行改造。对于待突变点，既可以将D N A序列或R N A序列中代表某一氨基酸的三联密码子更换为代表另一氨基酸的三联密码子，也可以更换为随机密码子，即：在之后的转录并翻译成蛋白质分子的过程中，在使用随机密码子的位置处，加入多肽链的氨基酸的种类是随机的。这样，就可以构建成一个随机序列文库，其特点在于：在理性选择的位点处产生了随机的序列信息。对序列上的特定位点进行改造(如更换密码子)的常用方法包括：重叠延伸P C R法和大引物P C R定点突变法、全基因合成法合成包含特定突变的全序列、限制性内切酶切除待突变区域后使用连接酶加入目的突变序列等等。对于“将其代表某一氨基酸的三联密码子更换为代表另一氨基酸的三联密码子”这一情况，可以直接将改造后的序列连上表达载体，转化宿主菌，表达出目的蛋白，并直接对目的蛋白的活性和理化特性进行检测，得知目的蛋白是否按照意愿产生正向进化。若未产生正向进化，则说明在突变位点替换的氨基酸种类不合适，此时返回该
步骤，在该位点替换其它种类的氨基酸。对于构建随机文库这种情况，可以将文库中的基因连接于表达载体，转化入宿主菌，构建待筛选克隆文库。可以使用培养皿平板法、多孔板法、摇瓶法等等方法培养宿主菌并诱导其表达，之后逐一检测表达产物的活性或者理化特性，选择能产生正向进化蛋白质分子的宿主菌，保存。此为第一轮定向进化。
6.根据权利要求1所述的一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其特征是其中的“随机重复递推式基因序列突变”中“重复递推式”的主要过程为：在第一轮定向进化完成后，以第一轮定向进化筛选到的结果(目的蛋白质)作为起点，重复之前的定向进化步骤，进行第二轮定向进化，将第二轮定向进化的结果(目的蛋白质)作为起点，重复之前的定向进化步骤，进行第三轮定向进化，依次类推，至第n轮定向进化(n为正
整数)。即迭代递推重复式定向进化。该方法可以累积正向进化。
7.根据权利要求1所述的一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其特征是在“重复递推式”定向进化的每一轮(包括最后一轮)，均可以对目的蛋白质及其基因使用错误倾向P C R(E r r o r-p r o n e P C R)或者D N A shuffling等等现有的定向进化技术，对其进行改造，进一步改善蛋白质分子特性。或者同时进行几组定向进化，每一组均对不同的突变位点进行突变，突变后，不立即进行筛选，而是混合各组的突变基因，使用DNA改组(DNA shuffling)等等技术，进行“洗牌”，此时，各组经过定向进化产生的突变基因的遗传信息在分子水平上产生了类似于“杂交”的效应，各个突变基因的遗传信息相互之间交叉混合，能够
扩大遗传信息的多样性，提高定向进化的效率。然后通过筛选，得到正向进化的目的基因，再以此得到的基因为起点，进入下一轮定向进化。之后的每一轮定向进化，都可以使用上述的“洗牌”方法，进行迭代递推重复式定向进化，并累积正向进化。
8.根据权利要求1所述的一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其特征是其中的“蛋白质”定义为：各种氨基酸通过脱水缩合作用形成肽链后产生的聚合物及其各种配基，或者各种氨基酸以其它方式形成的聚合物。蛋白质既可以是自然界动物、植物、微生物、病毒来源的天然蛋白质，也可以是实验室人工合成的或者修饰、改造过的蛋白质。蛋白质包括肽类物质。
9.通过使用权利要求1所述的一种新型的蛋白质分子定向进化方法，而获得的所有蛋白质分子及其氨基酸序列和碱基序列(包括D N A序列和RNA序列)。
200810071520.6说 明 书第1/16页
一种新型蛋白质分子定向进化方法
技术领域：
本发明属于生命科学领域，具体涉及一种根据蛋白质分子的空间三维结构或者如序列信息和二级结构信息等等所有有用的信息，分析其分子特性，理性选择目的突变位点，并进行随机重复递推式基因序列突
变，之后通过筛选，获得具有目的特性的新型蛋白质分子的定向进化方法。背景技术：
荷兰科学家格里特于1838年首次发现蛋白质，蛋白质是生物体内一种极为重要的高分子有机物，凡是有生命的物质离开蛋白质就无法生存。蛋白质的基本组成单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链。蛋白质是由一条或多条多肽链组成的，每一条多肽链有十几个至数百个不等的氨基酸残基，各种氨基酸残基按一定的顺序排列。蛋白质是生命的体现者，现代生物工程技术的发展，使得人类可以获得离体的、纯化的、并具有生物活性的蛋白质，可用于生物医药和生物催化等等领域。可是，生物体内天然存在的蛋白质，其特性往往不尽人意，将其提取出来，并在体外使用时常常具有很多缺点，比如活性低，对高温、低温、高p H、低p H、高压、辐射等等极端环境的耐受性差。因此需要对其进行人工的分子改造，使合成的蛋白质更符合人类的需要。由于每一种蛋白质都有自己独特的氨基酸排列顺序(一级结构)，所以只要改变其中关键的氨基酸序列就能改变蛋白质的性质。而氨基酸又是由核酸序列上的三联体密码子决定的，因此只要改变构成遗传密码的碱基序列就能达到改造蛋白质的目的。这一技术始于20世纪90年代，称为定向进化技术(D i r e c t e d e v o l u t i o n)，其中运用最为广泛的实际操作方法为错误倾向P C R (E r r o r-p r o n e P C R)和D N A改组(D N A s h u f f l i n g)。其核心思想是随机地改变编码蛋白质的基因序列，获得文库，然后通过大量的筛选，从文库中获得正向进化的目的基因。但是此类方法的随机性很大，其成败与否和效果优劣在于筛选量的大小和准确性。数十年前，人类已知蛋白质
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