(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810866445.6
(22)申请日 2018.08.01
(71)申请人 广东省农业科学院环境园艺研究所
地址 510650 广东省广州市天河区五山路
广东省农科院内
(72)发明人 杨凤玺 金建鹏 朱根发 郭阿瑾
(74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限
公司 44001
代理人 刘明星
(51)Int.Cl.
C12N 15/82(2006.01)
A01H 5/00(2018.01)
A01H 6/62(2018.01)
A01H 4/00(2006.01)
(54)发明名称一种兰花基因转化方法(57)摘要本发明公开了一种兰花基因转化方法，该方法以兰花的芽或茎段作为外植体进行原球茎诱导，直至原球茎的直径长至0.2～0.5cm；将得到的原球茎进行预培养后浸泡于OD600＝0.4～0.6的农杆菌溶液中侵染，再转移至共培养基中避光培养；将共培养后的原球茎多 余的农杆菌去除后，转移至增殖培养基上进行培养，得到抗性原球茎；将抗性原球茎转移至芽诱导培养基上进行培养，直至得到5～6cm高的墨绿小苗进行炼苗移栽。所述的兰花基因转化方法具有操作简便、转化周期短、转化效率高、成本较低的优点，尤其适合兰花体内基因功能验证。为获得抗病/抗逆/提前开花，改变花/花型和叶的竹叶兰以及
其他兰科植物奠定基础。权利要求书1页 说明书6页 附图4页CN 109136256 A 2019.01.04
C N 109136256
A
1.一种兰花基因转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原球茎诱导：以兰花的芽或茎作为外植体进行原球茎诱导，直至原球茎长至直径0.2～0.5cm；
(2)共培养：将步骤(1)得到的原球茎进行预培养，然后浸泡于OD600＝0.4～0.6的农杆菌溶液中侵染，侵染完成后将原球茎转移至共培养基中避光培养，所述的共培养基每升含有花宝一号3g、6-BA 2.0mg、NAA 0.2mg、AS 200μmol，余量为水；
(3)原球茎筛选：将步骤(2)共培养后的原球茎洗涤除菌，去除多余农杆菌后，转移至增殖培养基上进行培
养，得到抗性原球茎；所述的增殖培养基每升含有花宝一号3g、6-BA 3.0mg、NAA 0.3mg、潮霉素5mg，头孢霉素500mg，余量为水；
(4)将步骤(3)得到的抗性原球茎转移至芽诱导培养基上进行培养，直至得到5～6cm高的小苗，然后进行炼苗移栽，所述的芽诱导培养基每升含有花宝一号3g、NAA 0.5mg、潮霉素5mg，头孢霉素500mg，余量为水。
2.根据权利要求1所述的兰花基因转化方法，其特征在于，所述的以兰花的芽或茎为外植体进行原球茎诱导具体为：将兰花的芽或茎接种于培养基中，避光培养，直至在芽切口处或茎节处可以看到浅绿的小原球茎，然后转移到正常光周期条件下培养，直至原球茎的直径长至0.2～0.5cm，所述的培养基每升含有花宝一号3g、NAA 0.2mg、6-BA 0.2mg，余量为水。
3.根据权利要求1所述的兰花基因转化方法，其特征在于，所述步骤(2)的预培养的时间为1天，预培养的条件为：光强20～40μmo1·m -2·s -1，光周期16h/d，环境温度为24±1℃，相对湿度50～60％，预培养基每升含有花宝一号3g、NAA 0.2mg、6-BA 2mg，余量为水。
4.根据权利要求1所述的兰花基因转化方法，其特征在于，所述步骤(2)将原球茎转移至共培养基中避光培养，其条件为：在23～25℃培养2天。
5.根据权利要求1所述的兰花基因转化方法，其特征在于，所述的将步骤(2)共培养后的原球茎洗涤除菌是将原球茎依次用含0.05％m/v吐温的灭菌水清洗一次，用无菌水清洗三次，用含500mg/L头孢霉素的无菌水清洗三次，并在最后一次清洗过程中漩涡震荡30分钟，去除多余农杆菌。
6.根据权利要求1所述的兰花基因转化方法，其特征在于，所述步骤(3)的转移至增殖培养基上进行培养，其培养条件为：在23～25℃、8h黑暗16h光照下培养2个月。
7.根据权利要求1所述的兰花基因转化方法，其特征在于，所述步骤(4)的抗性原球茎转移至芽诱导培养基上进行培养，其培养条件为：在23～25℃、8h黑暗16h光照下培养3个月。
8.根据权利要求1所述的兰花基因转化方法，其特征在于，所述的浸泡于OD600＝0.4～0.6的农杆菌溶液中侵染，其侵染时间为20～30min。
权 利 要 求 书1/1页CN 109136256 A
一种兰花基因转化方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物工程领域中进行基因转化的方法，特别涉及一种兰花基因转化方法。
背景技术
[0002]兰科植物(俗称兰花)是单子叶植物第一大科，有801属近3000种。多数兰花种类具有很高的观赏和药用价值，因此兰花在花卉产业中占有举足轻重的地位。目前全球兰花年销售额已超70亿美元，成为重要的新型产业。而追求新奇特是花卉产业最大的特，也是推动产业发展的重要因素。然而多数兰花品种生长缓慢，种子成熟所需时间较长，采用传统杂交育种方法周期长，且子代性状难以预期，需要投入较高成本。与传统育种方法相比，转基因技术优势明显：(1)能突破远缘杂交瓶颈，实现物种间基因的交流，为兰花品种改良提供了新的可能；(2)能定向改变生物性状，育种更具预测性；(3)缩短育种时间。
[0003]随着现代分子生物学技术迅速发展，近几年兰花转基因研究进展很快，主要在蝴蝶兰、石斛兰、蕙兰、文心兰等兰花中建立了遗传转化方法包括基因法、农杆菌转化法、花粉管通道法、子房注射法等。其中，农杆菌介导法具有可行性强，操作简单，成本低，重复性好等特点，但还存在转化周期过长，转化效率低等不足，目前报道的兰花转基因方法从遗传转化到获得转基因成苗需要仍2-3年时间。因此，缺乏高效快速的兰花遗传转化体系仍然是兰花分子生物学研究基因功能，以及分子育种的关键制约因素。
发明内容
[0004]本发明的目的是提供一种高效，快速，简便的使用农杆菌介导的兰花基因转化方法，可用于体内
验证兰花基因功能，以及目标性状的定向改良。
[0005]本发明的兰花基因转化方法，包括以下步骤：
[0006](1)原球茎诱导：以兰花的芽或茎作为外植体进行原球茎诱导，直至原球茎长至直径0.2～0.5cm；
[0007](2)共培养：将步骤(1)得到的原球茎进行预培养，然后浸泡于OD600＝0.4～0.6的农杆菌溶液中侵染，侵染完成后将原球茎转移至共培养基中避光培养，所述的共培养基每升含有花宝一号3g、6-BA 2.0mg、NAA 0.2mg、AS 200μmol，余量为水；
[0008](3)原球茎筛选：将步骤(2)共培养后的原球茎洗涤脱菌，去除多余农杆菌后，转移至增殖培养基上进行培养，得到抗性原球茎；所述的增殖培养基每升含有花宝一号3g、6-BA 3.0mg、NAA 0.3mg、潮霉素5mg，头孢霉素500mg，余量为水；
[0009](4)将步骤(3)得到的抗性原球茎转移至芽诱导培养基上进行培养，直至得到5～6cm高的小苗，然后进行炼苗移栽，所述的芽诱导培养基每升含有花宝一号3g、NAA 0.5mg、潮霉素5mg，头孢霉素500mg，余量为水。
[0010]优选，所述的以兰花的芽或茎为外植体进行原球茎诱导具体为：将兰花的芽或茎接种于培养基中，避光培养，直至在芽切口处或茎节处可以看到浅绿的小原球茎，然后转
移到正常光周期条件下培养，直至原球茎的直径长至0.2～0.5cm，所述的培养基每升含有花宝一号5g、NAA 0.2mg、6-BA 0.2mg，余量为水。
[0011]优选，所述步骤(2)的预培养的时间为1天，预培养的条件为：光强20-40μmo1·m -2·s-1，光周期16h/d，环境温度为24±1℃，相对湿度50～60％，在步骤(1)得到的原球茎上划一道伤口，再接种于预培养培养基，光下培养1天，所述的预培养基每升含有花宝一号3g、NAA 0.2mg、6-BA 2mg，余量为水。
[0012]优选，所述步骤(2)将原球茎转移至共培养基中避光培养，其条件为：在23～25℃培养2天。
[0013]优选，所述的将步骤(2)共培养后的原球茎洗涤除菌是将原球茎依次用含0.05％m/v吐温的灭菌水清洗一次，用无菌水清洗三次，用含500mg/L头孢霉素的无菌水清洗三次，并在最后一次清洗过程中漩涡震荡30分钟，去除多余农杆菌。
[0014]优选，所述步骤(3)的转移至增殖培养基上进行培养，其培养条件为：在23～25℃、8h黑暗16h光照下培养2个月。
[0015]优选，所述步骤(4)的抗性原球茎转移至芽诱导培养基上进行培养，其培养条件为：在23～25℃、8h黑暗16h光照下培养3个月。
[0016]优选，所述的浸泡于OD600＝0.4～0.6的农杆菌溶液中侵染，其侵染时间为20～30min。
[0017]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0018](1)本发明提供的兰花基因转化方法在农杆菌侵染后利用原球茎直接诱导产生新的原球茎，随后诱导出芽到成苗移栽，整个过程加入抗生素筛选，获得了高阳性率的转基因株系，同时省略了再生和壮苗生根过程，最大程度节省了转化周期和成分，具有操作简便、转化周期短、转化效率高、成本较低的优点，尤其适合兰花体内基因功能验证。
[0019](2)本发明解决竹叶兰基因遗传转化问题，最直接的为获得抗病/抗逆/提前开花，改变花/花型和叶的竹叶兰以及其他兰科植物奠定基础。
附图说明
[0020]图1为不同预培养时间对转化效率的影响。
[0021]图2为不同乙酰丁香酮(AS)浓度对转化效率的影响。
[0022]图3为不同农杆菌浓度对转化效率的影响。
[0023]图4为不同侵染时间对转化效率的影响。
[0024]图5为不同共培养时间对转化效率的影响。
[0025]图6为PCR检测抗性苗结果。其中，line1-8为：抗性植株，WT为未经转化植株。[0026]图7为竹叶兰遗传转化及抗性植株的再生。a，播种；b，萌发原球茎；c，0.5cm大小切块原球茎；d，农杆菌菌液；e，共培养原球茎；f，筛选抗性芽；g，抗性芽GFP检测；h，与g相同；i，抗性苗生长。
具体实施方式
[0027]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0028]下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术
人员所熟知的常规手段。
[0029]实施例1竹叶兰增殖快繁体系的建立
[0030](1)兰花外植体选择
[0031]组织培养实验中，外植体的选择十分重要，不同的植物选择的外植体也不相同。实验结果表明，以竹叶兰的叶片或根为外植体，根或叶片容易褐化，不能诱导出原球茎，而茎、芽在适宜的培养基中均可成功诱导出原球茎，且芽的诱导效果好(表1)。将芽或茎段接种于培养基中，暗处理30天后，在芽切口处和茎节处可以看到浅绿小原球茎。然后转移到正常光周期条件下培养30天后，原球茎变绿，且体积
变大。由茎诱导出的原球茎比芽诱导出的体积大，约0.3～0.5cm，但诱导率低；添加植物激素能显著提高原球茎的诱导率。当激素浓度组合为NAA 0.2mg/L+6-BA 0.2mg/L(B6)(即每升培养基含有花宝一号3g、NAA0.2mg、6BA 0.2mg，余量为水)时，芽的诱导率最高，达到56％，而茎的诱导率仅为10％(表1)。因此，芽诱导原球茎的效果最好，是一种较好的原球茎诱导材料。
[0032]表1 激素对芽、茎诱导原球茎的影响
[0033]
[0034](2)不同植物激素对原球茎增殖的影响
[0035]在探究兰花遗传转化时，需要大量的原球茎受体材料，因此在建立再生体系过程中，原球茎增殖是关键的一步。将竹叶兰的原球茎切成0.5cm大小并接种到含不同激素浓度的培养基中，通过观察1个月后的增殖情况，如表2所示，不同的NAA、6-BA浓度对原球茎增殖有显著影响。当NAA浓度在0.2～0.4mg/L之间时，原球茎增殖倍数随着NAA浓度的升高而增加；当NAA为0.4mg/L时，增殖倍数高达15.21，而当NAA为0.5mg/l时，增殖倍数降低。同时，原
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