一种黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及微凝胶复合物技术领域，尤其涉及一种黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物及其制备方法和应用。

背景技术：

2.血脂异常是临床常见的代谢性疾病之一，是心血管疾病发生的高危因素，血液中总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)增高，而高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)降低。目前临床上常使用的降血脂药物主要是他汀类和贝特类，副作用较严重，长时间服用对人体损害较大。虽然目前针对降血脂、降血糖已有大量的专利或论文，但是大多针对已有的化学药物单方、复方或者单一活性成分，鲜有将一种小分子天然活性因子与一种大分子植物多糖进行协同复配的研究报道。

技术实现要素：

3.为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物及其制备方法和应用。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物的制备方法，包括如下步骤：
6.(1)将大豆卵磷脂、胆固醇与有机溶剂混合，得混合液a；
7.(2)将荷叶碱与有机溶剂混合，得混合液b；
8.(3)将所述混合液a与所述混合液b混合，搅拌0.8～1.2h后进行减压旋蒸，得薄膜；
9.(4)将所述薄膜与磷酸盐缓冲溶液混合进行水浴加热，得混合液c；
10.(5)对所述混合液c进行超声匀质，得荷叶碱-脂质体混悬液；
11.(6)将所述荷叶碱-脂质体混悬液与黑茶多糖水溶液混合，搅拌1.5～2.5h后加入原花青素水溶液，继续搅拌2～4h，得黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物。
12.优选的，步骤(1)中所述大豆卵磷脂、胆固醇与有机溶剂的混合比例为8～12mg:1mg:10～20ml，所述有机溶剂包括氯仿，所述氯仿的浓度为60～100vt％。
13.优选的，步骤(2)中所述荷叶碱与有机溶剂的混合比例为1mg:5～10ml，所述有机溶剂包括氯仿，所述氯仿的浓度为60～100vt％。
14.优选的，步骤(3)中所述混合液a与所述混合液b的混合体积比为1:1～3；
15.所述减压旋蒸的温度为28～32℃，所述减压旋蒸的转速为50～200r/min；
16.所述薄膜的厚度为0.2～0.8mm。
17.优选的，步骤(4)中所述薄膜与磷酸盐缓冲溶液的混合比例为400～600mg:35～45ml；
18.所述磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度为0.04～0.06m，所述磷酸盐缓冲溶液的ph值为7～7.5；
19.所述水浴加热的温度为40～60℃，所述水浴加热的时间为10～30min。
20.优选的，步骤(5)中所述超声匀质的次数为2～4次，每次超声匀质的时间为2～4min；
21.所述超声匀质的功率为300～500w；
22.所述超声匀质在冰浴条件下进行，所述冰浴的温度为0～4℃。
23.优选的，步骤(6)中所述荷叶碱-脂质体混悬液与黑茶多糖水溶液、原花青素水溶液的体积比为3～5:2～5:2～5；
24.所述黑茶多糖水溶液的浓度为8～12mg/ml，所述黑茶多糖水溶液中黑茶多糖的来源包括乌牛早茶；
25.所述原花青素水溶液的浓度为8～12mg/ml，所述原花青素水溶液中原花青素的来源包括废弃物葡萄籽或杨梅叶，所述原花青素水溶液中原花青素的平均聚合度为6～10.5。
26.本发明还提供了上述制备方法制备得到的黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物。
27.本发明还提供了上述黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物在制备降血脂的产品中的应用。
28.优选的，所述产品包括药物或保健食品。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
30.1、本发明选取的两种不同的天然功能因子荷叶碱和乌牛早加工后提取的黑茶多糖，可针对不同的作用靶点，起到协同增效的作用。
31.2、本发明将废弃物葡萄籽、杨梅叶等重新利用，提取其中的原花青素，与天然植物多糖进行二次开发，制备成稳定的微凝胶，以达到包封天然活性因子的目的。
32.3、本发明采用了薄膜蒸发-超声均质-离子交联法，先将荷叶碱包封在脂质体内，得到均一稳定的带正电荷的荷叶碱-脂质体溶液，再通过离子交联法将制备好的荷叶碱-脂质体与黑茶多糖/原花青素微凝胶复合，不仅对荷叶碱起到双重保护和缓释作用，还对荷叶碱起到靶向递送和特异性释放的作用。
33.4、本发明方法使得脂溶性功能因子在水溶液中稳定分散，不易于分层或沉淀，且使得本发明产品包封率高。
具体实施方式
34.本发明提供了一种黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物的制备方法，包括如下步骤：
35.(1)将大豆卵磷脂、胆固醇与有机溶剂混合，得混合液a；
36.(2)将荷叶碱与有机溶剂混合，得混合液b；
37.(3)将所述混合液a与所述混合液b混合，搅拌0.8～1.2h后进行减压旋蒸，得薄膜；
38.(4)将所述薄膜与磷酸盐缓冲溶液混合进行水浴加热，得混合液c；
39.(5)对所述混合液c进行超声匀质，得荷叶碱-脂质体混悬液；
40.(6)将所述荷叶碱-脂质体混悬液与黑茶多糖水溶液混合，搅拌1.5～2.5h后加入原花青素水溶液，继续搅拌2～4h，得黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物。
41.在本发明中，步骤(1)中所述大豆卵磷脂、胆固醇与有机溶剂的混合比例优选为8～12mg:1mg:10～20ml，进一步优选为9～11mg:1mg:12～18ml，更进一步优选为10mg:1mg:15ml；所述有机溶剂优选包括氯仿，所述氯仿的浓度优选为60～100vt％，进一步优选为70～90vt％，更进一步优选为80vt％。
42.在本发明中，步骤(2)中所述荷叶碱与有机溶剂的混合比例优选为1mg:5～10ml，进一步优选为1mg:6～8ml，更进一步优选为1mg:7ml；所述有机溶剂优选包括氯仿，所述氯仿的浓度优选为60～100vt％，进一步优选为70～90vt％，更进一步优选为80vt％。
43.在本发明中，步骤(3)中所述将所述混合液a与所述混合液b混合，搅拌0.8～1.2h后进行减压旋蒸，得薄膜，进一步优选为将所述混合液a与所述混合液b混合，搅拌1h后进行减压旋蒸，得薄膜。
44.在本发明中，步骤(3)中所述混合液a与所述混合液b的混合体积比优选为1:1～3，进一步优选为1:2。
45.在本发明中，步骤(3)中所述减压旋蒸的温度优选为28～32℃，进一步优选为29～31℃，更进一步优选为30℃；所述减压旋蒸的转速优选为50～200r/min，进一步优选为80～120r/min，更进一步优选为100r/min。
46.在本发明中，步骤(3)中所述薄膜的厚度优选为0.2～0.8mm，进一步优选为0.4～0.6mm，更进一步优选为0.5mm。
47.在本发明中，步骤(4)中所述薄膜与磷酸盐缓冲溶液的混合比例优选为400～600mg:35～45ml，进一步优选为450～550mg:38～42ml，更进一步优选为500mg:40ml。
48.在本发明中，步骤(4)中所述磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度优选为0.04～0.06m，进一步优选为0.05m；所述磷酸盐缓冲溶液的ph值优选为7～7.5，进一步优选为7.4。
49.在本发明中，步骤(4)中所述水浴加热的温度优选为40～60℃，进一步优选为45～55℃，更进一步优选为50℃；所述水浴加热的时间优选为10～30min，进一步优选为15～25min，更进一步优选为20min。
50.在本发明中，步骤(5)中所述超声匀质的次数为2～4次，进一步优选为3次；每次超声匀质的时间优选为2～4min，进一步优选为3min。
51.在本发明中，步骤(5)中所述超声匀质的功率优选为300～500w，进一步优选为350～450w，更进一步优选为400w。
52.在本发明中，步骤(5)中所述超声匀质优选在冰浴条件下进行，所述冰浴的温度优选为0～4℃，进一步优选为1～3℃，更进一步优选为2℃。
53.在本发明中，步骤(6)中所述将所述荷叶碱-脂质体混悬液与黑茶多糖水溶液混合，搅拌1.5～2.5h后加入原花青素水溶液，继续搅拌2～4h，得黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物，进一步优选为将所述荷叶碱-脂质体混悬液与黑茶多糖水溶液混合，搅拌2h后加入原花青素水溶液，继续搅拌3h，得黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物。
54.在本发明中，步骤(6)中所述荷叶碱-脂质体混悬液与黑茶多糖水溶液、原花青素水溶液的体积比优选为3～5:2～5:2～5，进一步优选为4:3:3。
55.在本发明中，步骤(6)中所述黑茶多糖水溶液的浓度优选为8～12mg/ml，进一步优选为9～11mg/ml，更进一步优选为10mg/ml；所述黑茶多糖水溶液中黑茶多糖的来源优选包括乌牛早茶。
56.在本发明中，步骤(6)中所述原花青素水溶液的浓度优选为8～12mg/ml，进一步优选为9～11mg/ml，更进一步优选为10mg/ml；所述原花青素水溶液中原花青素的来源优选包括废弃物葡萄籽或杨梅叶，所述原花青素水溶液中原花青素的平均聚合度优选为6～10.5，进一步优选为8～9，更进一步优选为8.5。
荷叶碱微凝胶复合物。
76.实施例3
77.(1)将大豆卵磷脂600mg、胆固醇50mg用1000ml易挥发的有机溶剂氯仿(80vt％)充分溶解于圆底烧瓶中，磁力搅拌器搅拌均匀，得混合液a。然后，将荷叶碱80mg也充分溶解于800ml易挥发的有机溶仿(80vt％)中，得混合液b；然后将所述混合液a与所述混合液b按照1:3的体积比混合，转入上述圆底烧瓶继续搅拌1h。
78.(2)将步骤(1)所得溶液于30℃、200r/min的条件下进行减压旋蒸，蒸干有机溶剂，至圆底烧瓶内剩一层厚0.8mm的薄膜。
79.(3)在上述只剩薄膜的圆底烧瓶中加入0.05m、ph7.4的磷酸盐缓冲溶液40ml，50℃水浴20min，得混合液；
80.(4)将所述混合液于冰浴中用功率为400w的超声波机常压均质3min/次，连续均质3次，得到半透明的荷叶碱-脂质体混悬液；
81.(5)将300mg黑茶多糖用超纯水30ml充分溶解于圆底烧瓶中，与上述荷叶碱-脂质体混悬液按照4:3的体积比混合，磁力搅拌2h至混合完全；
82.(6)将300mg杨梅叶原花青素(平均聚合度为10.5)用30ml超纯水充分溶解后，按照与黑茶多糖水溶液相同的体积加入步骤(5)中的圆底烧瓶中，继续磁力搅拌4h，得黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物。
83.对比例1
84.除将步骤(4)中的超声波功率由400w改为100w之外，其余步骤均与实施例1保持一致。
85.对比例2
86.除将步骤(5)中的磁力搅拌2h改为磁力搅拌1h之外，其余步骤均与实施例1保持一致。
87.实验例1
88.以荷叶碱为检测指标，对实施例1～3、对比例1～2所得的黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物进行荷叶碱包封率的差异性检测。荷叶碱标准品(纯度98％以上，购买自上海源叶生物科技有限公司)，高效液相谱系统(购买自日本岛津shimadzu20at)，谱柱为kromasil谱柱odsc18column(5μm，250mm
×
4.6mm)，保护柱为agilentodsc18column(5μm，12.5mm
×
4.6mm)。流动相为乙腈:0.1％三乙胺水溶液＝55:45；柱温30℃，波长270nm；流速为1ml
·
min-1
；进样量为20μl。得到的标准曲线为：y＝24854x-12474(r＝0.9996)，线性范围是0.1～50μg/ml。
89.将购买的透析管分别裁剪成一定长度的透析袋，在使用前要对透析袋进行预处理，将透析袋置于一定量2％的碳酸氢钠水溶液中煮沸15min，取出透析袋后再置于蒸馏水中彻底漂洗干净。然后再将透析袋置于1m浓度edta溶液中煮沸5min，然后再用蒸馏水漂洗干净后用于微凝胶溶液透析。
90.将上述处理后的透析袋两端扎紧，并向其中加入精密量取包封荷叶碱的微凝胶溶液，在加入透析袋之前，用1％冰醋酸对微凝胶进行了处理，并采用hplc方法准确测定其中荷叶碱含量(w1)。然后精密量取包封荷叶碱的微凝胶溶液放入透析袋中，将整个透析袋置于100ml的pbs溶液中，连续透析48h，吸取透析液进行hplc检测，并计算透析液中游离荷叶
碱含量(w2)，根据公式＝(w1-w2)/w1*100％计算出微凝胶中荷叶碱包封率。结果如表1所示。
91.表1不同处理对荷叶碱包封率的影响
92.处理荷叶碱包封率(％)实施例195.51实施例284.32实施例385.47对比例178.61对比例282.75
93.实验例2
94.将实施例1～3、对比例1～2所得的黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物按照1：4比例(体积比)分别置于正常人胃模拟液和肠模拟液的透析袋中，然后将透析袋置于恒温磷酸盐缓冲液中并振荡，设置摇床转速120r/min，温度37℃。微凝胶于胃肠模拟液中振荡后10、30、45、60、90和120min分别取出微量混合液体，采用乙酸乙酯萃取后，根据实验例1中荷叶碱hplc的检测条件，分别检测胃模拟液、肠模拟液中荷叶碱释放量变化，并求出荷叶碱在胃模拟液和肠模拟液中释放速率常数(k)，从而得出实施例1～3、对比例1～2所得的黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物在胃肠道中靶向释放规律。结果如表2所示。
95.表2不同处理所得黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物在胃肠模拟液中的释放速率常数k(min-1
)
96.处理胃模拟液中的释放速率常数k肠模拟液中的释放速率常数k实施例10.00510.0162实施例20.00690.0108实施例30.00580.0155对比例10.00870.0072对比例20.00960.0084
97.实验例3
98.将大鼠18只随机分为3组，分别设为空白对照组(nc)、高脂模型组(hfd)和不同微凝胶干预组，实验室适应性养殖1周后，除空白对照组继续给予基础饲料外，其余5组给予高脂饲料，高脂饲料配方为78.8％基础饲料、胆固醇1％、猪油10％、蛋黄粉10％以及胆酸盐0.2％。动物房温度为23
±
2℃，相对湿度为50％，自由饮水与进食，每周称量体重变化，适当调整给药量。实验动物连续灌胃，乙醚麻醉后，眼脉络丛静脉采血，分离血清，采用相应试剂盒分别检测不同时间点血清脂质tc、tg、ldl-c和hdl-c成分变化。结果如表3所示。
99.表3不同处理组的血脂参数水平
[0100][0101]
由实验例1～3可知，本发明制备得到的黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物不仅包封率高，有很好的缓释和靶向递送的作用，同时还具有降血脂的功效。
[0102]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将大豆卵磷脂、胆固醇与有机溶剂混合，得混合液a；(2)将荷叶碱与有机溶剂混合，得混合液b；(3)将所述混合液a与所述混合液b混合，搅拌0.8～1.2h后进行减压旋蒸，得薄膜；(4)将所述薄膜与磷酸盐缓冲溶液混合进行水浴加热，得混合液c；(5)对所述混合液c进行超声匀质，得荷叶碱-脂质体混悬液；(6)将所述荷叶碱-脂质体混悬液与黑茶多糖水溶液混合，搅拌1.5～2.5h后加入原花青素水溶液，继续搅拌2～4h，得黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物。2.根据权利要求1所述的一种黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述大豆卵磷脂、胆固醇与有机溶剂的混合比例为8～12mg:1mg:10～20ml，所述有机溶剂包括氯仿，所述氯仿的浓度为60～100vt％。3.根据权利要求1或2所述的一种黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述荷叶碱与有机溶剂的混合比例为1mg:5～10ml，所述有机溶剂包括氯仿，所述氯仿的浓度为60～100vt％。4.根据权利要求3所述的一种黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述混合液a与所述混合液b的混合体积比为1:1～3；所述减压旋蒸的温度为28～32℃，所述减压旋蒸的转速为50～200r/min；所述薄膜的厚度为0.2～0.8mm。5.根据权利要求4所述的一种黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述薄膜与磷酸盐缓冲溶液的混合比例为400～600mg:35～45ml；所述磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度为0.04～0.06m，所述磷酸盐缓冲溶液的ph值为7～7.5；所述水浴加热的温度为40～60℃，所述水浴加热的时间为10～30min。6.根据权利要求5所述的一种黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述超声匀质的次数为2～4次，每次超声匀质的时间为2～4min；所述超声匀质的功率为300～500w；所述超声匀质在冰浴条件下进行，所述冰浴的温度为0～4℃。7.根据权利要求6所述的一种黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述荷叶碱-脂质体混悬液与黑茶多糖水溶液、原花青素水溶液的体积比为3～5:2～5:2～5；所述黑茶多糖水溶液的浓度为8～12mg/ml，所述黑茶多糖水溶液中黑茶多糖的来源包括乌牛早茶；所述原花青素水溶液的浓度为8～12mg/ml，所述原花青素水溶液中原花青素的来源包括废弃物葡萄籽或杨梅叶，所述原花青素水溶液中原花青素的平均聚合度为6～10.5。8.权利要求1～7任意一项所述制备方法制备得到的黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物。9.权利要求8所述的黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物在制备降血脂的产品中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物或保健食品。

技术总结

本发明属于微凝胶复合物技术领域，本发明提供了一种黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物及其制备方法和应用。本发明先将荷叶碱包封在脂质体内，再将制备好的荷叶碱-脂质体与黑茶多糖/原花青素微凝胶复合，不仅对荷叶碱起到双重保护和缓释作用，还对荷叶碱起到靶向递送和特异性释放的作用。经实验验证，本发明制备得到的黑茶多糖-荷叶碱微凝胶复合物具有良好的降血脂功能。脂功能。