[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101628119A [43]公开日2010年1月20日
[21]申请号200910163045.X [22]申请日2009.08.21
[21]申请号200910163045.X
[71]申请人北京新华联协和药业有限责任公司
地址100005北京市东城区东单北大街69号协和
明日大厦819室
[72]发明人牛占坡 王宁 乔秉善 李冬凌 汤承祁
任雅丽 裴潇竹 张红玉 单金鹏 王玉玲
[51]Int.CI.A61K 49/00 (2006.01)G01N 21/31 (2006.01)G01N 27/447 (2006.01)
G01N 33/577 (2006.01)
G01N 21/64 (2006.01)
权利要求书 3 页 说明书 10 页 附图 2 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明提供了一种由户尘螨(Dermatophagoide
s pterronyssinus简称Der p)引起的速发型过敏性 疾病的变应原诊断试剂的制备方法，该变应原诊断
试剂为户尘螨(Der p)变应原点刺液。本发明还提
供了该变应原诊断试剂的原材料即户尘螨纯螨体变
应原的制备方法、该变应原诊断试剂效价的评定方
法以及用于特异性诊断过敏性病症的用途。本发明
的变应原诊断试剂利用致敏原理达到测定患者是否
对某种物质过敏而引发疾病的目的。本发明的户尘
备的点刺液活性强，大大降低了过敏患者皮试的风
险性，提高了临床医疗的安全性。
200910163045.X权 利 要 求 书第1/3页 1、一种诊断户尘螨过敏性疾病的诊断试剂，该诊断试剂是由户尘螨纯螨体变应原制备而得的。
2、根据权利要求1所述的诊断试剂，其特征在于，其中所述的户尘螨纯螨体变应原是将起居室或房舍灰尘中收集到的户尘螨培养后，通过纯化得到的95％以上的纯螨体。
3、根据权利要求1所述的诊断试剂，其特征在于，其中所述的诊断试剂是把户尘螨纯螨体变应原通过提取、加甘油的方法而获得。
4、根据权利要求1所述的诊断试剂，该诊断试剂还含有其它药学上可接受载体。
5、根据权利要求1-4中任一所述的诊断试剂，其特征在于该诊断试剂是点刺液、皮下注射剂、片剂、胶囊、气雾剂、鼻腔剂、贴剂、滴丸剂或喷雾剂等。
6、根据权利要求5所述的诊断试剂，该诊断试剂是户尘螨纯螨体变应原通过提取后得到的户尘螨纯螨体变应原制剂。
7、户尘螨纯螨体变应原原材料的制备方法，采用下述步骤制备： 1)螨种收集：广泛收集起居室床上、枕头、被褥、沙发、地毯等中的以及房舍灰尘。
2)分离鉴定：把收集到的粉尘过2号分样筛，筛除杂质，再过4号分样筛，将剩余粉尘平铺于培养皿中，用盖玻片抚平表面，避光置于阴凉潮湿的地点2～4小时，每半小时观察一次。发现粉尘中有尘螨活动产生的凸起，即用接种针挑起少许凸起处粉尘，制片，对尘螨进行形态学鉴定，确认粉尘中尘螨种类后，
于显微镜下将户尘螨分离出来，用于菌种培养。
3)菌种培养：取250ml无菌细胞培养瓶，每个培养瓶以无菌操作接入4药匙(约3～7克)培养基，培养基为：蛋白粉23.7％、复合维生素0.2％、矿物质4.7％，其余为全麦粉，经过钴60照射灭菌处理。然后接入半药匙(约0.2～0.6克)上述已分离鉴定好的户尘螨，置于温度25℃，湿度75％～80％，避光条件下培养，至户尘螨达到50％左右作为工作螨种。户尘螨工作螨种于25℃、75％～80％条件下避光保存，每3～
4个月传代一次；或者挑取取户尘螨占培养基总量的50％以上的培养瓶留作螨种，将培养瓶置于2～8℃、30％～60％湿度条件下保存，每月传代一次。
4)接种：取250m l无菌细胞培养瓶，每个培养瓶以无菌操作接入4药匙(约3～7克)培养基，培养基为：蛋白粉23.7％、复合维生素0.2％、矿物质4.7％，其余为全麦粉，经过钴60照射灭菌处理。然后接入半药匙(约0.2～0.6克)上述给培养好的户尘螨螨种。
5)培养：将接种好的培养瓶置于温度25℃，湿度75％～80％，避光条件下培养，培养6～8周。
6)收获：将培养瓶内的户尘螨与培养基的混合物倒入准备好的三角烧瓶中，向瓶内加入2～3倍混合物体积的95％乙醇，使混合物被完全浸没。静置，期间手动振摇1～3次，每次2～4分钟。30～50分钟后用纱布将混合物与溶剂分离，混合物在阴凉干燥处风干24～36小时。
7)纯化：将户尘螨原材料根据螨与饲料的物理性质不同、比重不同而逐层分离纯化。重复4～5次此项操作，镜检户尘螨含量可达95％以上。
8)保存：2～8℃密封避光保存。
8、户尘螨变应原点刺液的制备方法，采用下述步骤制备： 1)提取：户尘螨纯螨变应原原材料与磷酸盐缓冲提取液(氯化钠8.0～11.0g、磷酸二氢钾0.6～0.8g、磷酸氢二钠12.0～16.0g、苯酚6.0～9.0g，加注射用水至1000m l)按1～1.5∶100(W/V)的比例混合，在温度2～8℃的条件下，连续振荡提取24小时。
2)粗滤：采用滤纸去渣。
3)除菌过滤：0.22μm膜超滤膜正压过滤或错流除菌过滤。最佳方案为0.22μm膜+0.45μm纸板错流除菌过滤，得到变应原浸提液。
4)把上述得到的变应原浸提液与等体积甘油无菌条件下混合，得到户尘螨点刺液。
9、户尘螨变应原点刺液效价分析是采用Bradford法测总蛋白含量，SDS-PAGE电泳、银染法测定主要致敏蛋白成分、双夹心单克隆抗体法测主要致敏蛋白D e r p1的活性浓度、U n i C A P法测总生物活性。
10、户尘螨变应原点刺液在诊断由户尘螨过敏引起的过敏性疾病中的应用。
200910163045.X说 明 书第1/10页
户尘螨变应原诊断试剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过致敏法来诊断户尘螨过敏性疾病的变应原诊断试剂及其制备方法。
背景技术
过敏性疾病是当今世界上最常见、最顽固的疾患之一，涉及临床各科。速发型过敏反应是一种常见的过敏反应，主要为呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过敏反应以及过敏性休克。病症主要表现为过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性肠胃炎以及湿疹、荨麻疹等过敏性皮肤病。
变态反应性疾病被世界卫生组织(WHO)认为是当前世界性的重大卫生学问题，世界各国变态反应性疾病的总发病率约为10～20％，包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎及过敏性眼结膜炎等，是临床常见病、多发病。当前，变态反应疾病日趋严重，引起过敏的主要变应原有尘螨、花粉、屋尘、霉菌、羽毛等，而尘螨是世界性分布最强烈的变应原之一。它主要引起过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等；尘螨性哮喘的发病被认为是速发型变态反应代表疾病。
目前对户尘螨的培养，国内外都有研究。国外已经有建立起户尘螨培养体系的报道，而ALLERGON公司也专门培养并且出售螨系列的原材料。但是培养基的选择是一个很重要的问题，有酵母粉、鱼粉、肝粉、人皮屑、猪肉、动物饲料等其中若干种混合使用，培养周期至少三个月，而且饲料成分里含有的动物蛋白或其他本身能够引起人的二次过敏，潜在的危险性很高。所以虽然有多家单位能够大量培养户尘螨，但是真正的不含其它动物蛋白的户尘螨变应原显有报道。
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