(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011399517.4
(22)申请日 2020.12.03
(71)申请人 中国人民解放军陆军军医大学第一
附属医院
地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正街
30号
(72)发明人 詹日兴 赵小红 罗高兴 郭熠城
(74)专利代理机构 重庆华科专利事务所 50123
代理人 康海燕
(51)Int.Cl.
A61L 27/36(2006.01)
A61L 27/38(2006.01)
A61L 27/60(2006.01)
A61L 15/40(2006.01)
A61L 15/46(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种人工微粒皮的制备方法，
备；S2，表皮干细胞分离培养；S3，脱细胞真皮基
质微粒与表皮干细胞的结合；S31，将S1制得的脱
细胞真皮基质微粒在温度为4～8℃的条件下、采
用Ⅳ型胶原溶液浸泡包被，复温至室温，得到脱
细胞真皮基质微粒悬浮液；S32，将脱细胞真皮基
质微粒悬浮液滴加到细胞培养板中，采用K ‑SFM
或Epilife培养液重悬细胞培养板中的脱细胞真
皮基质微粒；S33，取S2中培养对数期的表皮干细
胞消化、收集，调整浓度为0.2～0.5×106个细
胞/ml，加入到细胞培养板中，培养制得人工微粒
皮。其能够实现真皮基质与表皮干细胞的融合，
制得的人工微粒皮具有快速促进创面愈合、提高
创面愈合质量的作用。权利要求书2页 说明书8页 附图13页CN 112472870 A 2021.03.12
C N 112472870
A
1.一种人工微粒皮的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
S1，脱细胞真皮基质微粒的制备；
S11，取动物离体皮肤消化、分离，去表皮组织保留真皮组织；
S12，将真皮组织粉碎为微粒并加入EDTA‑胰蛋白酶溶液，进行震荡脱细胞处理，得到脱细胞真皮基质微粒；
S2，表皮干细胞分离培养；
S21，取术后皮肤消化、分离，去真皮组织保留表皮组织；
S22，将表皮组织粉碎、消化、过滤、离心，收集细胞；
S23，以K‑SFM或Epilife培养液调整细胞浓度为(1～2)×106个细胞/25cm2，接种于采用Ⅳ型胶原包被处理的培养瓶中，常规培养至60～70％细胞融合，采用胰蛋白酶消化后传代培养，得到表皮干细胞；
S3，脱细胞真皮基质微粒与表皮干细胞的结合；
S31，将S1制得的脱细胞真皮基质微粒在温度为4～8℃的条件下、采用Ⅳ型胶原溶液浸泡包被12～18h，复温至室温，得到浓度为0.01～0.05g/ml的脱细胞真皮基质微粒悬浮液；
S32，将脱细胞真皮基质微粒悬浮液滴加到细胞培养板中，采用K‑SFM或Epilife培养液重悬细胞培养板中的脱细胞真皮基质微粒；
S33，取S2中培养对数期的表皮干细胞消化、收集，调整浓度为0.2～0.5×106个细胞/ ml，加入到细胞培养板中，培养制得人工微粒皮。
2.根据权利要求1所述的人工微粒皮的制备方法，其特征在于，所述S11中的消化和分离具体为：将动物离体皮肤经70～75％乙醇浸泡后用PBS溶液清洗，刮除多余的体毛及皮下附带的脂肪组织；然后用0.2～0.5中性蛋白酶在温度为4～8℃的条件下消化处理12～18h，分离得到表皮组织和真皮组织。
3.根据权利要求1或2所述的人工微粒皮的制备方法，其特征在于：所述S12的EDTA‑胰蛋白酶溶液中EDTA的浓度为0.01～0.03，胰蛋白酶的浓度0.25～0.5％。
4.根据权利要求1或2所述的人工微粒皮的制备方法，其特征在于，所述S12的震荡脱细胞处理具体为：将带有真皮组织微粒的EDTA‑胰蛋白酶溶液置于恒温震荡仪中，在转速为80～100rpm的条件下震荡18～24h，然后用PBS溶液洗涤两次，超声震荡30min后用PBS溶液漂洗18～24h，震荡和漂洗过程中均每隔4～6h换液一次。
5.根据权利要求1或2所述的人工微粒皮的制备方法，其特征在于，所述S22的粉碎、消化、过滤、离心具体为：将表皮组织剪碎，在温度为37℃的条件下用浓度为0.25～0.5％(W/ V)的胰蛋白酶溶液消化10～15min，采用RPMI1640培养基终止消化，再用200目筛网过滤，然后在转速为800～1000rpm的条件下离心4～8min。
6.根据权利要求1或2所述的人工微粒皮的制备方法，其特征在于，所述S23具体为：以K‑SFM或Epilife培养液调整细胞浓度为(1～2)×106个细胞/25cm2，接种于采用Ⅳ型胶原包被处理的培养瓶中，常规培养10～15min，吸弃未贴壁细胞；再采用PBS溶液轻洗两次，更换新的K‑SFM或Epilife培养液进行常规培养，次日换液，然后每隔三天换液一次；使用倒置相差显微镜观察到60～70％细胞融合时，采用浓度为2.5～5g/L的胰蛋白酶溶液消化3～8min，收集细胞且将收集的细胞均分四份传代培养。
7.根据权利要求1或2所述的人工微粒皮的制备方法，其特征在于：所述S1中的动物离
体皮肤为人、猪、兔、牛、羊或鼠的皮肤。
8.权利要求1～7任一项所述制备方法的制得的人工微粒皮在烧伤创面修复中的应用。
一种人工微粒皮的制备方法及应用
技术领域
[0001]本发明涉及组织工程生物材料领域，具体涉及人工微粒皮的制备方法及应用。
背景技术
[0002]重度烧伤创面修复一直是烧伤医学研究的难点，皮源匮乏是其根本问题。目前使用的微粒皮移植、MEEK微型皮片移植及自异体皮镶嵌移植等技术临床应用可达到1：14(取皮面积1％，可扩增覆盖14％创面)创面封闭的需要。但这种传统“拆东墙补西墙”的策略需要牺牲大量正常皮肤，以及重度烧伤往往需要进行多次手术封闭创面，重症监护时间长，生命风险高。此外，已有采用皮肤层纤维细胞、脐带间充质干细胞、多能干细胞和脱细胞真皮基质混合培养后修复创面的研究，但这些研究结果都没有解决临床特重症烧伤患者应用的需求。为此，避免牺牲正常皮肤同时提供足够皮源的创面封闭方式是现代烧伤医学的研究重点。
[0003]CN111407929A公开了一种新型人工皮肤及其制备方法。该新型人工皮肤制备方法具体如下：取新鲜动物离体皮肤，通过氢氧化钠、DNA酶、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠、过氧乙酸、PBS等一系列处理后获得脱细胞真皮基质，超声混合将氧化石墨烯与脱细胞真皮基质溶液混匀，再通过富集处理后得到一种新型人工皮肤。其在修复创面的过程中只能起到生物敷料的作用，不具有形成完整皮肤结构的功能。
发明内容
[0004]本发明的目的是提供一种人工微粒皮的制备方法及应用，其能够实现真皮基质与表皮干细胞的融合，制得的人工微粒皮具有快速促进创面愈合、提高创面愈合质量的作用。[0005]本发明所述的人工微粒皮的制备方法，其包括如下步骤：
[0006]S1，脱细胞真皮基质微粒的制备；
[0007]S11，取动物离体皮肤消化、分离，去表皮组织保留真皮组织；
[0008]S12，将真皮组织粉碎为微粒并加入EDTA‑胰蛋白酶溶液，进行震荡脱细胞处理，得到脱细胞真皮基质微粒；
[0009]S2，表皮干细胞分离培养；
[0010]S21，取术后皮肤消化、分离，去真皮组织保留表皮组织；
[0011]S22，将表皮组织粉碎、消化、过滤、离心，收集细胞；
[0012]S23，以K‑SFM或Epilife培养液调整细胞浓度为(1～2)×106个细胞/25cm2，接种于采用Ⅳ型胶原包被处理的培养瓶中，常规培养至60～70％细胞融合，采用胰蛋白酶消化后传代培养，得到表皮干细胞；
[0013]S3，脱细胞真皮基质微粒与表皮干细胞的结合；
[0014]S31，将S1制得的脱细胞真皮基质微粒在温度为4～8℃的条件下、采用Ⅳ型胶原溶液浸泡包被12～18h，复温至室温，得到浓度为0.01～0.05g/ml的脱细胞真皮基质微粒悬浮液；
[0015]S32，将脱细胞真皮基质微粒悬浮液滴加到细胞培养板中，采用K‑SFM或Epilife培养液重悬细胞培养板中的脱细胞真皮基质微粒；
[0016]S33，取S2中培养对数期的表皮干细胞消化、收集，调整浓度为0.2～0.5×106个细
的条件下培养制得人工微粒皮。
胞/ml，加入到细胞培养板中，在温度为37℃、5％的CO
2
[0017]进一步，所述S11中的消化和分离具体为：将动物离体皮肤经70～75％乙醇浸泡后用PBS溶液清洗，刮除多余的体毛及皮下附带的脂肪组织；然后用0.2～0.5中性蛋白酶在温度为4～8℃的条件下消化处理12～18h，分离得到表皮组织和真皮组织。
[0018]进一步，所述S12的EDTA‑胰蛋白酶溶液中EDTA的浓度为0.01～0.03，胰蛋白酶的浓度0.25～0.5％。
[0019]进一步，所述S12的震荡脱细胞处理具体为：将带有真皮组织微粒的EDTA‑胰蛋白酶溶液置于恒温震荡仪中，在转速为80～100rpm的条件下震荡18～24h，然后用PBS溶液洗涤两次，超声震荡30min后用PBS溶液漂洗18～24h，震荡和漂洗过程中均每隔4～6h换液一次。
[0020]进一步，所述S22的粉碎、消化、过滤、离心具体为：将表皮组织剪碎，在温度为37℃的条件下用浓度为0.25～0.5％(W/V)的胰蛋白酶溶液消化10～15min，采用RPMI1640培养基终止消化，再用200目筛网过滤，然后在转速为800～1000rpm的条件下离心4～8min。[0021]进一步，所述S23具体为：以K‑SFM或Epilife培养液调整细胞浓度为(1～2)×106个细胞/25cm2，接种于采用Ⅳ型胶原包被处理的培养瓶中，常规培养10～15min，吸弃未贴壁细胞；再采用PBS溶液轻洗两次，更换新的K‑SFM或Epilife培养液进行常规培养，次日换液，然后每隔三天换液一次；使用倒置相差显微镜观察到60～70％细胞融合
时，采用浓度为2.5～5g/L的胰蛋白酶溶液消化3～8min，收集细胞且将收集的细胞均分四份传代培养。[0022]进一步，所述S1中的动物离体皮肤为人、猪、兔、牛、羊或鼠的皮肤。
[0023]上述制备方法的制得的人工微粒皮在烧伤创面修复中的应用。
[0024]本发明与现有技术相比具有如下有益效果。
[0025]1、本发明通过先粉碎再脱细胞的方式去除皮肤组织中的免疫原性物质，既能完整的保留皮肤组织细胞外基质成分，又能达到优良的脱细胞效果，且在脱细胞过程中使用的都是性质较温和的试剂，最大程度的保留了皮肤细胞外基质的活性成分。同时简化了脱细胞真皮基质处理方法，制得的脱细胞真皮基质通过红外技术分析确定其胶原结构完好，能够更好的适合于细胞贴附和存活。在脱细胞真皮基质上培养了表皮干细胞，形成的人工微粒皮不仅具有生物敷料作用，而且能够将移植的表皮干细胞依托脱细胞真皮基质增殖、分化形成皮肤完整结构。
[0026]2、本发明实现了真皮基质与表皮干细胞的融合，制得的人工微粒皮具有快速促进创面愈合、恢复表皮复层结构、提高创面愈合质量、重建皮肤真皮组织结构的作用。同时为解决创面细胞，提高细胞存活率提供了一种新方法，该方法是一种快速、有效封闭严重烧伤创面的一种新方式，有望解决临床重症烧伤患者皮源短缺。
附图说明
[0027]图1是本发明实施例一猪皮组织的宏观形貌示意图；
[0028]图2是本发明实施例一制得的ADM宏观形貌示意图；
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