(10)申请公布号 (43)申请公布日 2010.06.23*CN101748154A*
(21)申请号 200810229976.0
(22)申请日 2008.12.19
C12P 3/00(2006.01)
C12N 1/12(2006.01)
C12R 1/89(2006.01)
(71)申请人中国科学院大连化学物理研究所
地址116023 辽宁省大连市中山路457号
(72)发明人张卫 郑阳 陈兆安 陆洪斌
彦飞 傅赟彬
(74)专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限
公司 21002
代理人马驰 周秀梅
(54)发明名称
制氢方法
(57)摘要
应器，将微藻高密度培养和光照产氢进行了整合，
形成一体化产氢体系。通常微藻培养和光合产氢
两段工艺在时空上是分开的，培养的低密度藻细
胞需经浓缩再光照产氢，因此要分别在两个光生
藻接种于反应器中，利用富加二氧化碳的培养方
式，经短期培养即可达到产氢所需的生物量，然后
的氢气可被整合于反应器之上的燃料电池转化为
电能，并可通过电流的变化，对产氢状况进行实时
监测。本发明首次将微藻培养和产氢两段工艺相
结合，并利用燃料电池将氢转化为电能，为规模化
微藻产氢提供了可靠的技术支持。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 5 页CN 101748154 A
C N 101748154 A
1.一种亚心形扁藻高密度培养与产氢一体化的制氢方法，其特征在于：
以具有光解海水产氢功能的单细胞海洋绿藻-亚心形扁藻为产氢材料，在平板光生物反应器上外接碱性氢氧燃料电池持续耗氢系统来维持体系内较低氢分压，通过燃料电池的持续耗氢以保持光反应器体系内较低氢分压，消除产物抑制，提高产氢量；进而实现将海洋微藻高密度培养、光解水产氢相结合的实用化的平板光生物反应系统。
2.按照权利要求1所述的的制氢方法，其特征在于：具体操作过程为，
1)扁藻接种：于平板光生物反应器中投加康维方培养基，接种处于指数生长期的扁藻，扁藻的接种密度为0.5-1×106cell/mL；
2)扁藻培养：接种后的扁藻先在培养温度为22-30℃，光强为80-150μE/m2.s-1，光暗比为12-14∶10-12的培养条件下适应一天，接着通入2-5％V/V浓度的二氧化碳和空气的混合气，通气量为0.2-1vvm；
3)当平板反应器中的藻密度达到6-10×106cell/mL时，即进行产氢；产氢时，将反应器密封，再通入氮气吹扫10-20分钟，以达到厌氧状态；接着使反应器避光4-12小时进行暗诱导，使扁藻氢酶充分表达；
4)暗诱导后，加入终浓度为7.5～15μM解偶联剂CCCP到藻液中，并利用NaOH和HCl 将藻液pH值调至7-8；注入解偶联剂20-30分钟后，再施加100-150μE/m2.s-1的光照于平板反应器之上，进行连续光照产氢；
5)光反应器内藻液产生的氢气通过管路导入碱性氢氧燃料电池的氢电极，通过燃料电池的持续耗氢以保持光反应器体系内较低氢分压，消除产物抑制，提高产氢量；系统产生的氢气被燃料电池所消耗，电流变化可由监测系统进行记录。
3.按照权利要求2所述的的制氢方法，其特征在于：在步骤4)产氢过程中，光反应器内藻液上方的气体循环由一台微型真空泵来完成，真空泵将藻液上方的气体鼓入藻液内，以确保产氢时，系统的厌氧环境。
4.按照权利要求2所述的的制氢方法，其特征在于：步骤2)培养阶段和步骤4)产氢阶段所需光强，由5-10只荧光灯提供，照光方式为单侧光照；光强的具体数值由辐照计测量；通过调整光源与反应器的距离来达到所需的光照强度。
一种亚心形扁藻高密度培养与产氢一体化的制氢方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种利用海洋微藻产氢的新方法。即：高密度培养和产氢一体化的新工艺。
技术背景
[0002] 随着近年来对绿藻制氢的深入研究，人们相继发现了很多种具有明显产氢能力的绿藻，如：Scenedesmus obliquus，Chlamydomonas reinhardtii，Platymonas subcordiformis等。与此同时，产氢工艺的研究也取得了很多卓有成效的进展。如：Zhang 等发现淡水莱茵衣藻在缺硫连续光照条件下，由于硫元素的缺乏，使半胱氨酸合成受阻，进而导致PS II上的D1蛋白无法及时修复，降低PS II的光化学活性及产氧量。当体系中的产氧速率和呼吸耗氧速率相等时，就造成了一个厌氧的环境，使衣藻的氢酶得以表达，实现连续产氢。管英富等利用解偶联剂CCCP对暗诱导后的海洋亚心形扁藻进行处理，发现CCCP 可以起到与淡水绿藻缺硫调控相同的效果，降低PS II的光化学活性及产氧量而不影响呼吸耗氧速率，从而形成厌氧环境，使扁藻氢酶表达，实现连续光照产氢。同时CCCP能够打开类囊体膜上的质子通道，从而使质子大量渗出，为氢酶提供充足的底物，进一步促进产氢。这些从机理水平上提出的产氢新工艺，为绿藻产氢的工业化应用提供了可能。
[0003] 目前的产氢工艺大都是将微藻培养于摇瓶中，然后于对数生长期收集后，再用于光照产氢。由于摇瓶培养所获得的藻细胞密度低，无法达到产氢要求的最优密度，因此在产氢前需要离心浓缩来达到产
氢要求的生物量。该产氢工艺流程复杂，离心浓缩需要消耗额外能量，并且对微藻细胞会产生一定的破坏作用进而降低产氢能力。而利用整合了燃料电池的平板式光生物反应器，进行高密度培养和产氢过程相结合的工艺技术未见报道。
发明内容
[0004] 本发明研究了一种将微藻高密度培养阶段和光照产氢阶段有机结合的新型产氢工艺。目的是简化现有产氢工艺，为规模化产氢提供技术支持。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] 以一种具有光解海水产氢功能的海洋绿藻-亚心形扁藻(Platymonassubcordiformis)为产氢对象，在整合了碱性燃料电池的平板式光生物反应器中，通过富加二氧化碳的方法，在短期内实现扁藻生物量大量积累，进而达到产氢所需的藻密度，此阶段为高密度培养阶段。然后通过气阀调节，使反应器处于密闭状态，并通入氮气使反应器内处于厌氧状态。此状态下的藻液经过4小时的暗诱导后，即可进行连续光照产氢。此阶段即为光照产氢阶段。系统中产生的氢气可被碱性燃料电池所利用转化为电能，同时，氢气的消耗使反应系统中的氢分压较低，可减轻氢气的反馈抑制作用。由于电路中电子数量与氢原子数具有一一对应的关系，因此，通过测量电池外电路电流变化就可计算出体系内氢浓度的变化，进而对整个产氢过程实现实时监控。本发明缩短了微藻培养时间，简化了现有的产氢工艺，实现了微藻培养
和光照产氢的一体化。
[0007] 本实验所建立的一体化光生物反应器系统如图1所示，在微藻的培养阶段，转换阀D为开放态，通过泵C向反应器中泵入空气、CO
2
混合气，为藻提供碳源的同时还能够起到
搅动藻液的作用；在制氢阶段开放B，以N
2
吹扫10分钟，除去反应器中的氧，此时D仍为开放态。接着，关闭B、D，使反应器处于密闭状态。并继续由泵C进行体系内气体的自循环。系统产生的氢气被燃料电池E所消耗，E的电流变化可由监测系统G进行记录。
[0008] 一种亚心形扁藻高密度培养与产氢一体化的制氢方法，以具有光解海水产氢功能的单细胞海洋绿藻-亚心形扁藻为产氢材料，在平板光生物反应器上外接碱性氢氧燃料电池持续耗氢系统来维持体系内较低氢分压，通过燃料电池的持续耗氢以保持光反应器体系内较低氢分压，消除产物抑制，提高产氢量；进而实现将海洋微藻高密度培养、光解水产氢相结合的实用化的平板光生物反应系统。
[0009] 具体操作过程为，
[0010] 1)扁藻接种：于平板光生物反应器中投加康维方培养基，接种处于指数生长期的扁藻，扁藻的接种密度为0.5-1×106cell/mL；
[0011] 2)扁藻培养：接种后的扁藻先在培养温度为22-30℃，光强为80-150μE/m2.s-1，光暗比为12-14∶10-12的培养条件下适应一天，接着通入2-5％V/V浓度的二氧化碳和空气的混合气，通气量为0.2-1vvm；
[0012] 3)当平板反应器中的藻密度达到6-10×106cell/mL时，即进行产氢；产氢时，将反应器密封，再通入氮气吹扫10-20分钟，以达到厌氧状态；接着使反应器避光4-12小时进行暗诱导，使扁藻氢酶充分表达；
[0013] 4)暗诱导后，加入终浓度为7.5～15μM解偶联剂CCCP到藻液中，并利用NaOH和HCl将藻液pH值调至7-8；注入解偶联剂20-30分钟后，再施加100-150μE/m2.s-1的光照于平板反应器之上，进行连续光照产氢；
[0014] 产氢过程中，光反应器内藻液上方的气体循环由一台微型真空泵来完成，真空泵将藻液上方的气体鼓入藻液内，以确保产氢时，系统的厌氧环境。
[0015] 步骤2)培养阶段和步骤4)产氢阶段所需光强，由5-10只荧光灯提供，照光方式为单侧光照；光强的具体数值由辐照计测量；通过调整光源与反应器的距离来达到所需的光照强度。
[0016] 5)光反应器内藻液产生的氢气通过管路导入碱性氢氧燃料电池的氢电极，通过燃料电池的持续耗氢以保持光反应器体系内较低氢分压，消除产物抑制，提高产氢量；系统产生的氢气被燃料电池所消耗，电流变化可由监测系统进行记录。
[0017] 6)体外氢酶活性的测定在厌氧环境中进行。以50mmol磷酸缓冲液(pH6.8)作为
缓冲液，以被连二亚硫酸钠(Na
2S
2
O
4
)还原的甲基紫精(Methylviologen，MV)作为电子供
体。反应系统包括终浓度为10mM的MV和100mM的连二亚硫酸钠及500μl藻液。在37℃水浴中振荡孵育20min后，用气相谱检测氢气组分含量。按下式计算体外氢酶活性：
[0018]
[0019] 7)由光照反应器中取10μL藻液，注入Water PAM叶绿素荧光仪的测量杯中，再加入3mL无菌海水培养基，混合后进行测量。通过ΔF/Fm’及Yeild等叶绿素荧光参数的变化，反映藻细胞PS II的光化学活性变化。
[0020] 8)由燃料电池监测的所有数据点以时间为横坐标作图，得到电流、氢酶活性和PS II活性随时间变化的关系曲线。由电流变化曲线依据电子数和消耗的氢原子数的一一对应关系积分计算产氢量，并参照氢酶活性和PS II活性随时间变化的关系曲线研究产氢机理。[0021] 本发明与现有技术相比具有如下优点：
[0022] 1.大大简化了现有的微藻产氢工艺，将高密度培养阶段和光照产氢阶段相结合，省去了以往的制氢前离心浓缩步骤。节省了产氢运行成本，降低产氢过程中人力的投入。[0023] 2.可真正实现循环
产氢。在一次接种后，经培养阶段和产氢阶段后，可将反应器中的藻液放出，只留少量的藻液作为接种物。然后添加新鲜培养基，进入下一个培养阶段，待藻密度达到产氢要求后，即可进行光照产氢。如此即可实现产氢过程的循环。
[0024] 3.在每个产氢循环当中放出的藻液，可被进一步的深入利用。如：提取油脂，发酵生产乙醇等。如能规模化生产，每个循环中会积累数量可观的藻类生物质。从而实现培养藻类生物质和生产氢气的双重目的。
[0025] 4.由于培养、产氢一体化反应器采用平板式设计，比起现有的圆柱形搅拌反应器，可大大提高光能利用效率。理论上讲，可在更高的藻密度条件下，光照产氢。
[0026] 5.采用气体鼓泡式搅拌方式，在搅动藻液的同时，还能促进气体的交换。省去了实验室中常用的磁力搅拌方式。另外，在产氢阶段通过卫星循环泵，可实现密闭反应器中气体的自循环，使产生的氢气能够迅速的实现液相到气相的转换，有利于燃料电池消耗氢气产生电流。并能够进一步减轻氢气对产氢过程的反馈抑制作用。
[0027] 总之，本发明大大简化了扁藻光解水产氢过程，减少产氢过程中的人力投入，为循环式微藻产氢提供了技术支持。
附图说明
[0028] 图1为本发明中使用的高密度培养和光照产氢一体化反应器简图；
[0029] 其中：A：二氧化碳气瓶；B：氮气瓶；C：微型真空循环泵；D：气路转换阀；E：碱性燃料电池；F：辐照计；G：燃料电池在线监测系统；H：板式光生物反应器；I：气体分散装置；
[0030] 图2为不同二氧化碳培养条件下扁藻生长动力学曲线(藻密度变化)；[0031] 图3为不同二氧化碳培养条件下扁藻生长动力学曲线(干重变化)；
[0032] 图4不同二氧化碳培养条件下叶绿素荧光产率；
[0033] 图5不同二氧化碳培养条件下叶绿素荧光诱导曲线；
[0034] 图6产氢阶段叶绿素荧光诱导曲线；
[0035] 图7产氢阶段藻细胞叶绿素荧光产率变化；
[0036] 图8产氢阶段中偶联燃料电池的产氢动力学曲线；
[0037] 图9产氢阶段中氢酶活性及氧浓度的变化。
具体实施方式
[0038] 下面通过具体实例对本发明进行进一步说明：本发明使用解偶联剂CCCP胁迫调控扁藻产氢，使用碱性燃料电池外接30欧姆电阻持续耗氢发电，监测并记录电阻两端电压计算得到电流，对电流曲线积分计算获得通过电路的电量值，由电子数与耗氢原子的一一
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