(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610521733.9
(22)申请日 2016.06.28
(71)申请人 林海燕
地址 264504 山东省乳山市银滩览山亲水
居14号楼
(72)发明人 林海燕
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
(54)发明名称一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法(57)摘要本发明提供了一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法，该技术方案利用HPLC法对乙肝病毒核心抗原执行检测，并对检测器、谱条件进行了优化，使检测精度显著提升，在无需添加开壳剂的条件下直接取血清即可检出痕量的HBcAg。由于ELSD检测器在检测过程中流动相和溶剂会完全蒸发，因此所得谱图无溶剂峰，且梯度洗脱无折光视差效应、不会出现基线漂移，明显简化了后续的定量分析。而C8柱的保留时间较短、分离效果好，从而缩短了检测时间。此外，由于该检测条件温和，因此不会导致蛋白、核酸等成分的变性失活，有效保证了检测准确性。本发明以创新性的技术改进实现了优越的技术效果，同时灵敏度较高、操作简便，检测后利用内标法即可实 现准确定量。权利要求书1页 说明书4页 附图1页CN 106248812 A 2016.12.21
C N 106248812
A
1.一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法，该方法属于HPLC法，其特征在于该方法利用C8谱柱进行分离，并利用ELSD检测器进行检测；其谱条件如下：流动相由pH8.5、浓度0.12mol/L的乙酸铵溶液与乙腈组成，其中乙腈占流动相总量的50～70％(v/v)；流速为0.5～0.9mL/min；柱温为25～35℃。
2.根据权利要求1所述的一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法，其特征在于乙腈占流动相总量的60％(v/v)。
3.根据权利要求1所述的一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法，其特征在于所述流速为0.7mL/min。
4.根据权利要求1所述的一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法，其特征在于所述柱温为32℃。
5.根据权利要求1所述的一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法，其特征在于具有以下操作条件：ELSD检测器的飘移管温度55℃，气体流速22psi，进样量17μL。
6.根据权利要求1所述的一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法，其特征在于所述C8谱柱的长度为150mm。
7.根据权利要求6所述的一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法，其特征在于所述C8谱柱满足以下条件：内径4.3mm，填料平均粒径4μm。
8.根据权利要求1所述的一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法，其特征在于检测后利用内标法对乙肝病毒核心抗原进行定量。
权 利 要 求 书1/1页CN 106248812 A
一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及医疗卫生技术领域，具体涉及一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法。
背景技术
[0002]乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)感染所引起的一种慢性传染病，初期症状隐蔽，病程较长其具有较强的传染性，对患者健康影响严重，甚至可能危及生命。我国是乙肝高发国家，乙肝表面抗原携带率约占总人口的7～8％，因此针对乙肝的预防、、检测等技术至关重要。
[0003]目前临床上对乙肝病毒的检测主要通过表面抗原(HBsAg)、表面抗体(抗-HBs)、e 抗原(HBeAg)、e抗体(抗-HBe)以及核心抗体(抗-HBc)五项指标(即乙肝两对半)进行评价。上述五种物质的存在与乙肝病毒的感染进程有着较为稳定的对应关系，且由于存在于血清中、易于检测，因此广泛应用于临床检验。然而需要明确的是，上述五项物质仅是体内存在乙型肝炎病毒的间接标志，而未纳入上述五项指标的乙肝病毒核心抗原(HBcAg)，作为乙肝病毒存在的直接标志能够更准确的反应HBV的存在及其复制程度，较其他免疫学指标灵敏性、特异性更好。
[0004]乙肝病毒核心抗原由183个或185个氨基酸组成，高度磷酸化，是乙肝病毒核心颗粒的唯一结构蛋
白。由于它存在于Dane颗粒核心结构表面，被表面抗原覆盖，故不易在血液中检出。核心抗原具有强免疫原性，可诱导很强的体液免疫和细胞免疫，刺激机体产生抗-HBc。现有技术中常用ELISA和IRMA双抗体夹心法检测HBcAg，其检测步骤较繁琐，且需要加入开壳剂，使HBcAg释放与溶液中再进行测定，此过程存在较大的系统性误差，因此准确性有待提升。
发明内容
[0005]本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法，以解决现有技术中乙肝病毒核心抗原难以从血清中直接检出的技术问题。
[0006]本发明要解决的另一技术问题是现有技术的乙肝病毒核心抗原检测步骤繁琐。[0007]本发明要解决的再一技术问题是现有技术的乙肝病毒核心抗原检测成本较高。[0008]为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0009]一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法，该方法属于HPLC法，该方法利用C8谱柱进行分离，并利用ELSD检测器进行检测；其谱条件如下：流动相由pH8.5、浓度0.12mol/L 的乙酸铵溶液与乙腈组成，其中乙腈占流动相总量的50～70％(v/v)；流速为0.5～0.9mL/ min；柱温为25～35℃。
[0010]优选的，乙腈占流动相总量的60％(v/v)。
[0011]优选的，所述流速为0.7mL/min。
[0012]优选的，所述柱温为32℃。
[0013]优选的，具有以下操作条件：ELSD检测器的飘移管温度55℃，气体流速22psi，进样
量17μL。
[0014]优选的，所述C8谱柱的长度为150mm；在此基础上进一步优选的：所述C8谱柱内径为4.3mm、填料平均粒径为4μm。
[0015]优选的，检测后利用内标法对乙肝病毒核心抗原进行定量。
[0016]本发明利用高效液相谱法对乙肝病毒核心抗原执行检测，并对检测器、谱条件进行了优化，使得检测精度显著提升，在无需添加开壳剂的条件下直接取血清即可检出痕量的HBcAg。由于ELSD检测器在执行检测的过程中流动相和溶剂会完全蒸发，因此得到的谱图没有溶剂峰，且梯度洗脱没有折光视差效应、不会出现基线漂移，极大的简化了后续的定量分析。而C8柱的保留时间较短、分离效果较好，因此显著缩短了检测时间。此外，由于该检测条件温和，因此不会导致蛋白、核酸等成分的变性失活，有效保证了检测准确性。本发明以创新性的技术改进实现了优越的技术效果，同时灵敏度较高、操作简便，检测后利用内标法即可实现准确定量。
附图说明
[0017]图1是本发明实施例1乙肝病毒核心抗原标准品的HPLC检测谱；
[0018]图2是本发明实施例1乙肝病毒核心抗原含量与谱图峰面积对应关系图。
具体实施方式
[0019]以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0020]除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
[0021]实施例1
[0022](1)谱条件
[0023]选用岛津C8柱(4.5*130mm，4μm)，流动相是0.12mol/L乙酸铵溶液(pH8.5)与乙腈(40∶60，V/V)混合物，流速是0.7ml/min，柱温为32℃，蒸发光散射检测器的飘移管温度55℃，气体流速22psi。自动进样器进样量为17μL。
[0024](2)标准曲线的绘制
[0025]取HBcAg标准品50mg，用谱级乙腈溶解、定容至50mL，依次稀释成HBcAg含量为5，10，20，50，100，200，500μg/ml的标准溶液，分别加入到步骤(1)处于运行状态的高效液相谱仪的谱柱中20μl，分别计算相同保留时间下的峰面积，以浓度对数log10(C)为横坐标，以峰面积对数log10(A)为纵坐标，绘制标准曲线表达式(如附图2所示)，结果显示二者线性关系良好。
[0026](3)待测样品中HBcAg含量的检测
[0027]取待测血清，用谱级乙腈溶解，混匀，再用0.22μm滤膜过滤，而后加入到步骤(1)处于运行状态的高效液相谱仪的谱柱中20μl，计算相同保留时间下的峰面积，带入步骤(2)所得的标准曲线表达式，计算出待测样品中HBcAg浓度，再通过样品的取样量计算出HBcAg含量。其计算方法如下：
[0028]HBcAg含量＝(待测样品溶液的浓度÷待测HBcAg取样量÷稀释因子)×100％
[0029]HBcAg(％)＝样品中HBcAg含量÷HBcAg制剂标示量×100％
[0030](4)检测准确性实验
[0031]对同一血清样品，连续6次进样，峰面积分别如表1所示：
[0032]表1同样血清样品多次检测结果
[0033]
次数123456
峰面积85629.58554385345.985112.48571685897 [0034]峰面积RSD值为0.31％，结果表明，本发明方法对HBcAg含量检测的准确性高，结果较稳定。
[0035]实施例2
[0036](1)谱条件
[0037]选用安捷伦C8柱(所述C8谱柱的长度为150mm，内径4.3mm，填料平均粒径4μm)，流动相是0.12mol/L乙酸铵溶液(pH8.5)与乙腈(50∶50，V/V)的混合物，流速是0.5ml/min，柱温为25℃，蒸发光散射检测器的飘移管温度55℃，气体流速22psi。自动进样器进样量为17μL。
[0038](2)标准曲线的绘制
[0039]取HBcAg标准品50mg，用谱级乙腈溶解、定容至50mL，依次稀释成HBcAg含量为5，10，20，
50，100，200，500μg/ml的标准溶液，分别加入到步骤(1)处于运行状态的高效液相谱仪的谱柱中20μl，分别计算相同保留时间下的峰面积，以浓度对数log10(C)为横坐标，以峰面积对数log10(A)为纵坐标，绘制标准曲线表达式。
[0040](3)待测样品中HBcAg含量的检测
[0041]取待测血清，用谱级乙腈溶解，混匀，再用0.22μm滤膜过滤，而后加入到步骤(1)处于运行状态的高效液相谱仪的谱柱中20μl，计算相同保留时间下的峰面积，带入步骤(2)所得的标准曲线表达式，计算出待测样品中HBcAg浓度，再通过样品的取样量计算出HBcAg含量。其计算方法如下：
[0042]HBcAg含量＝(待测样品溶液的浓度÷待测HBcAg取样量÷稀释因子)×100％[0043]检测后利用内标法对乙肝病毒核心抗原进行定量。
[0044]实施例3
[0045]一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法，该方法属于HPLC法，该方法利用C8谱柱进行分离，并利用ELSD检测器进行检测；其谱条件如下：流动相由pH8.5、浓度0.12mol/L 的乙酸铵溶液与乙腈组成，其中乙腈占流动相总量的70％(v/v)；流速为0.9mL/min；柱温为35℃。
[0046]在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0047]ELSD检测器的飘移管温度55℃，气体流速22psi，进样量17μL。
[0048]所述C8谱柱的长度为150mm。
[0049]检测后利用内标法对乙肝病毒核心抗原进行定量。
[0050]实施例4
[0051]一种乙肝病毒核心抗原含量检测方法，该方法属于HPLC法，该方法利用C8谱柱进行分离，并利用ELSD检测器进行检测；其谱条件如下：流动相由pH8.5、浓度0.12mol/L
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