(19)中华人民共和国国家知识产权局
| (12)发明专利说明书 | |
| (10)申请公布号 CN 104357365 A (43)申请公布日 2015.02.18 |
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(21)申请号 CN201410659766.0
(22)申请日 2014.11.18
(71)申请人 江南大学
地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号
(72)发明人 方芳 仇钰莹 刘晓慧 陈坚
(74)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务所(特殊普通合伙)
代理人 张勇
(51)Int.CI
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一株产游离的葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋杆菌，属于发酵技术领域。糖精葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter saccharivorans)L4，已于2014年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014352。该葡萄糖酸杆菌能够以葡萄糖为底物生产葡萄醛酸，对微生物法生产葡萄糖醛酸奠定了基础。 | |
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法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一株产葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter saccharivorans)L4，已于2014年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M2014352。
2.权利要求1所述的糖精葡糖醋杆菌L4在葡萄糖醛酸生产中的应用方法。
3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，是将菌株活化后，接种于GY培养基，28-30℃，200-220r/min摇床培养4-5天。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述GY培养基含有葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L。
5.权利要求1所述的糖精葡糖醋杆菌L4的应用。
说 明 书
技术领域
本发明涉及一株产游离葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋杆菌，属于发酵技术领域。
背景技术
葡萄糖醛酸(Glucuronic acid)是一种糖醛酸化合物，因其分子中同时存在高反应活性的醛基和羧基，可作为受体与多种人体内源性及外源性有毒物质结合，提高毒性物质的水溶性使其易于随尿与胆汁排出体外，发挥排毒功能，提高机体免疫功能。
葡萄糖醛酸在医药和保健品等领域也有着广泛的应用，可作为中间物质合成具有防癌抗癌作用的D-葡糖二酸钙、D-葡萄糖二酸1,4-内酯和L-抗坏血酸等，也可作为食品添加剂加入到功能性饮料中。其优势作用正在不断被发掘，有巨大的潜在经济效益。
目前葡萄糖醛酸主要以淀粉为原料在酸性条件下通过硝酸氧化来实现生产。该工艺存在能耗高、选择性差、产品收率低、环境污染严重等问题。以葡萄糖为底物用发酵法生产葡萄糖醛酸成本较低，对环境污染也较小，并且发酵生产葡萄糖醛酸可以大大减轻原料来源的限制。由于缺少能够产游离葡萄糖醛酸的独立菌株，目前，还没有利用单一微生物发酵生产葡萄糖醛酸的方法。
本发明筛选到以葡萄糖为底物生产游离葡萄糖醛酸的微生物菌株，对该菌株进行了鉴定，确定其为糖精葡糖酸醋杆菌，对其发酵条件进行了初步研究，为微生物发酵法产葡萄糖醛酸奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一株产葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋杆菌(Gluconacetobactersaccharivorans)L4，已于2014年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M2014352。
所述糖精葡糖醋杆菌L4，用GY培养基培养时，菌落呈圆形，表面干燥光滑，边缘规则，培
养时间小于5天菌落为白，培养时间大于5天菌落逐渐变黄，菌落直径为0.2-0.5mm。菌体革兰氏阴性，100×显微镜下观察细胞呈短杆状。
所述糖精葡糖醋杆菌L4能够发酵生产葡萄糖醛酸，所得葡萄糖醛酸游离于发酵上清液中，而不在胞外多糖中。
所述糖精葡糖醋杆菌L4的筛选是以从新疆长生堂红茶菌中分离的菌株为生产菌株，在初始的发酵培养基(糖茶水，含1.5～3％(m/v)蔗糖的茶叶水)中30℃、200rpm的条件下培养5天，通过液质联用(LC-MS)定性检测发酵上清液中葡萄糖醛酸，再通过离子谱定量检测发酵上清液中物质的含量，筛选出能以葡萄糖为底物发酵生产游离葡萄糖醛酸的菌株。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种应用所述糖精葡糖醋杆菌L4的方法，是将菌株活化后，接种于GY培养基，28-30℃，200-220r/min摇床培养4-5天。发酵上清液中含有葡萄糖醛酸。
所述GY培养基含有葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L。
本发明提供的菌株能将较廉价的底物葡萄糖转化成具有高附加值的葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸
直接分离到发酵上清液中，而不是混于胞外多糖，较化学生产法具有反应条件温和，产品工艺简单，生产过程易于控制，可用于食品和药物生产等优点，同时有利于保护环境，易于推广使用。
生物材料保藏
一株糖精葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter saccharivorans)L4，已于2014年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No：M2014352。
附图说明
图1葡萄糖醛酸质谱图，A：葡萄糖醛酸标样一级质谱图；B：Gluconacetobactersaccharivorans L4发酵上清液中葡萄糖醛酸质谱图。
图2葡萄糖醛酸离子谱图，A：葡萄糖醛酸标样，出峰时间10.117min；B：Gluconacetobacter saccharivorans L4发酵上清液中葡萄糖醛酸离子谱图，出峰时间10.150min。
具体实施方式
胞外多糖中葡萄糖醛酸的检测方法：
将菌体在GY培养基中30℃、200r/min条件下培养72h，以8000rpm离心15min，取清液。将4倍上清液体积的乙醇加入到上清液中，并将混合物保持在4℃下过夜。以8000r/min离心15分钟收集沉淀。将沉淀干燥，加入5倍上清液体积的0.5mol/L的H<Sub>2</Sub>SO<Sub>4</Sub>溶液，在70℃反应3h。将水解液通过0.45μm滤膜过滤，LCMS检测产物。
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