(19)中华人民共和国国家知识产权局
| (12)发明专利说明书 | |
| (10)申请公布号 CN 104178443 A (43)申请公布日 2014.12.03 |
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(21)申请号 CN201310198953.9
(22)申请日 2013.05.24
地址 300308 天津市空港经济区西七道32号
(72)发明人 张学礼 朱欣娜 徐洪涛 谭在高
(74)专利代理机构 北京永新同创知识产权代理有限公司
代理人 程大军
(51)Int.CI
C12N1/21
C12P7/46
C12R1/19
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及通过大肠杆菌发酵生产丁二酸的领域。具体而言，本发明提供了一种用于生产丁二酸的经工程化的重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有如下的一或多种修饰：a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因的活性增强，b)sthA基因的活性增强,和c)突变的lpdA基因。本发明还涉及使用所述经工程化的重组大肠杆菌用于生产丁二酸的用途，以及使用所述经工程化的重组大肠杆菌生产丁二酸的方法。 | |
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法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌中含有如下修饰：
(1)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因表达的抑制、和 /或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的 抑制， (2)pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活 性的抑制，
(3)ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制，和
(4)galP基因和/或外源glf基因表达的增强、和/或galP基因和/或外源glf基因所编 码的蛋白质活性的增强；
其中所述大肠杆菌还含有如下的一或多种修饰：
(a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达的增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP) 中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的增强；和
(b)sthA基因表达的增强、和/或sthA基因所编码的蛋白质活性的增强。
2.权利要求1的大肠杆菌，其中所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统 (PTS)中所涉及的基因是选自如下的一或多种基因：编码PTS系统酶I的基因ptsI、编 码PTS系统酶Hpr的基因ptsH、编码PTS系统酶IIA<sup>Glc</sup>的基因crr和编码PTS系统酶 IICB<sup>Glc</sup>的基因ptsG。
3.权利要求1或2的大肠杆菌，其中所述磷酸戊糖途径中所涉及的基因是选 自如下的一或多种基因：编码转酮醇酶的基因tktA、编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因 zwf、编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因pgl、编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因gnd、编 码5-磷酸核
糖异构酶的基因rpi、编码5-磷酸核酮糖差向异构酶的基因rpe和编码转醛 醇酶的基因talB。
4.权利要求3的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中sthA基因和tktA基因的表达 增强、和/或sthA基因和tktA基因所编码的蛋白质活性的增强。
5.权利要求1-4任一项的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下的修饰：
(5)ackA和pta基因表达的抑制、和/或ackA和pta基因所编码的蛋白质活性的抑制；
(6)aceBA基因簇表达的增强、和/或aceBA基因簇所编码的蛋白质活性的增强；
(7)dcuC基因表达的增强、和/或dcuC基因所编码的蛋白质活性的增强；和
(8)mgsA基因表达的抑制、和/或mgsA基因所编码的蛋白质活性的抑制。
6.权利要求1-5任一项的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中还含有突变的lpdA 基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的如下位置的位置上含 有修饰：T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID No.:1进行序列比对而确定 的，其
中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰 是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A，
任选地，所述大肠杆菌中所述突变的lpdA基因的表达增强、和/或所述突变的lpdA 基因所编码的蛋白质的活性增强。
7.权利要求6的大肠杆菌，其中所述突变的lpdA基因位于质粒或染体中。
8.权利要求6的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌以保藏号CGMCC7260保藏于 CGMCC。
9.权利要求1-7任一项的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下的修饰：(9) pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
10.权利要求9的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌以保藏号CGMCC7259保藏于 CGMCC。
11.权利要求9的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下修饰：
(10)adhE基因表达的抑制、和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制;和
(11)tdcDE基因簇表达的抑制、和/或tdcDE基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。
12.权利要求11的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌以保藏号CGMCC7550保藏于 CGMCC。
13.权利要求9的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下的遗传改造：aceEF 基因簇表达的增强、和/或aceEF基因簇所编码的蛋白质活性的增强。
14.生产丁二酸的方法，所述方法包括培养权利要求1-13任一项的大肠杆菌。
15.权利要求1-13任一项的大肠杆菌在生产丁二酸中的用途。
说 明 书
<p>发明领域
本发明涉及通过大肠杆菌发酵生产丁二酸的领域。具体而言，本发明提供了一种用于生产丁
二酸的经工程化的重组大肠杆菌。本发明还涉及使用所述经工程化的重组大肠杆菌用于生产丁二酸的用途，及使用所述经工程化的重组大肠杆菌生产丁二酸的方法。
发明背景
丁二酸又称作琥珀酸，是一种优秀的平台化合物，在化工、材料、医药、食品领域有着广泛的用途，被美国能源部列为未来12种最有价值的平台化合物之一(McKinlay et al.2007,Appl Microbiol Biotechnol76:727-740)。丁二酸目前主要应用于酯化溶剂、除冰装置、发动机冷却剂、食品香精、水处理化学品等。丁二酸还可以用于生产很多下游产品，如1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、N-甲基吡咯烷酮、2-吡喏烷酮。另外，丁二酸和1,4-丁二醇聚合能得到PBS(聚丁二酸丁二醇酯)塑料，其是一种性能优良的生物全降解塑料。据估计丁二酸未来的市场潜力每年将超过270万吨。大约有250种可以用苯为原料生产的化工产品都可以通过丁二酸为原料生产(McKinlay et al.2007,Appl Microbiol Biotechnol76:727-740)。
目前丁二酸的生产主要是基于顺酐为原料的石油化工路线。石油价格近年来波动很大，这严重制约了丁二酸生产的可持续性和价格稳定。另一方面，化学合成法工艺复杂且常需高温高
压，这大大增加了生产所需的能耗物耗；同时化学合成还会造成严重的环境污染。开发丁二酸的高效生物制造技术能从根本上解决石油化工路线的弊端：保证丁二酸价格稳定不受制于石油价格波动，降低PBS塑料的制造成本，促进其进一步的推广应用；实现绿可持续生产、简化生产工艺、节能减排、减少环境污染。另外，丁二酸的生物制造过程中还可以吸收二氧化碳，对实现低碳经济具有很好的促进作用。丁二酸生物制造技术的核心就是能够将生物质原料高效转化为丁二酸的微生物菌株。
目前丁二酸发酵菌种主要有两大类。第一类是天然产丁二酸菌，主要有产丁二酸放线杆菌(Actinobacillus succinogens)(Guettler et al.1996,US Patent No.5504004)、产丁二酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)(Glassner and Datta1992,US Patent No.5143834)、产丁二酸曼海姆菌(Mannheimia succiniciproducens)(Lee et al.2002,Appl Microbiol Biotechnol58:663-668)和巴斯夫琥珀菌(Basfia succiniciproducens)(Scholten et al.2009,Biotechnol Lett31:1947-1951)。另一类是通过代谢工程改造的工程菌，主要是大肠杆菌。
天然产丁二酸菌虽然能够高产丁二酸，但其自有很多缺陷。发酵过程中，糖酸转化率低，有
相当一部分碳源流入到其他有机酸的合成。另外，天然产丁二酸菌发酵过程 中需要丰富培养基，提高了生产成本和下游分离纯化成本，限制了其大规模工业化生产。大肠杆菌在糖发酵过程中虽然只积累少量的丁二酸，但由于其生理遗传背景都很清晰，易于改造，因此很多研究单位都选取大肠杆菌作为出发菌种，将其改造成高产丁二酸的工程菌。
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