(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利
(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201811129527.9
(22)申请日 2018.09.27
(65)同一申请的已公布的文献号
申请公布号 CN 110951765 A
(43)申请公布日 2020.04.03
(73)专利权人 中国科学院分子植物科学卓越创
新中心
地址 200032 上海市徐汇区枫林路300号
专利权人 上海医药工业研究院
(72)发明人 姜卫红 李雷 卫科科 刘小草
芦银华 陈少欣
(74)专利代理机构 上海申浩律师事务所 31280
代理人 贾师英
(51)Int.Cl.
C12N 15/76(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)
C12R 1/55(2006.01)
C12R 1/04(2006.01)
(56)对比文件
CN 106906238 A ,2017.06.30
CN 108251344 A ,2018.07.06
Lei Li et al..Multiplexed site-specific genome engineering for overproducing bioactive secondary metabolites in actinomycetes.《Metabolic Engineering》.2017,Jonathan M. Geisinger and Michele P. Calos.Using Phage Integrases in a Site-Specific Dual Integrase Cassette Exchange Strategy.《Methods in molecular biology》.2015,Nicholas C. O. Lee et al..Method to Assemble Genomic DNA Fragments or Genes on Human Artificial Chromosome with Regulated Kinetochore Using a Multi-Integrase System.《ACS Synthetic Biology》.2017,Keke Wei et al..Mil
R2，a novel TetR family regulator involved in 5-oxomilbemycin A3/A4 biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus.《Applied Microbiology and Biotechnology》.2018，审查员 刘涛 (54)发明名称
合方法
(57)摘要
本发明公开了一种系统，其包括：含有多克
隆位点MCS、链霉菌启动子kasOp*、整合基因、抗 性基因、通用组装接头、SpeI和SwaI酶切位点的
因、通用组装接头的第二质粒；CRISPR/Cas9反应
体系；Gibson组装反应体系。该系统为即插即用
型，可高效地在放线菌基因组上整合多拷贝的天
然产物合成基因簇。权利要求书2页 说明书14页序列表10页 附图5页CN 110951765 B 2022.03.08
C N 110951765
B
1.一种用于在放线菌基因组上整合多拷贝基因簇的即插即用型整合系统，其包括：
第一质粒，该质粒上包括：用于整合外源基因簇的多克隆位点MCS；位于MCS上游的链霉菌启动子kasOp*；两种以上作为整合位点的整合基因，所述整合基因选自噬菌体来源整合酶ΦC31、ΦBT1、R4、SV1或TG1基因结合attP位点的DNA片段；邻接所述整合基因的第一抗性基因，其选自阿普那抗性基因acc(3)IV、卡那抗性基因aphII、硫链丝菌素抗性基因tsr；分别位于整合基因及第一抗性基因上下游的上游接头和下游接头；限制性内切酶SpeI和SwaI 的酶切位点，所述SpeI和SwaI酶切位点对称地分别位于上游接头和下游接头两端，当用一种限制性内切酶SpeI或SwaI酶切后，留下另一种酶切位点SwaI或SpeI；
第二质粒，该质粒上包含：外源基因簇；一种或者两种以上作为整合位点的整合基因，所述整合基因选自ΦC31、ΦBT1、R4、SV1或TG1基因结合attP位点的DNA片段，并且当包含两种以上整合基因时，与
第一质粒上的整合基因不相同；邻接整合基因的第二抗性基因，所述抗性基因选自阿普那抗性基因acc(3)IV、卡那抗性基因aphII、硫链丝菌素抗性基因tsr，并且与第一抗性基因不相同；分别位于整合基因和第二抗性基因上下游的上游接头和下游接头；
该整合系统的质粒构建成模块化质粒，这些模块化质粒上包含两种以上的整合基因进行配套，并且不同模块化质粒上包含不同的整合基因，依据抗性标记的不同分为两个系列，每一系列含有11组质粒，其中在阿普那抗性标记acc(3)IV的质粒中，2个质粒含有1套整合系统即ΦC31或ΦBT1整合基因，3个质粒同时含有2套整合系统即ΦC31/ΦBT1、ΦC31/TG1或ΦBT1/TG1整合基因，3个质粒同时含有3套整合系统即ΦC31/ΦBT1/R4、ΦC31/ΦBT1/ SV1或ΦC31/ΦBT1/TG1整合基因，3个质粒同时含有4套整合系统即ΦC31/ΦBT1/R4/SV1、ΦC31/ΦBT1/R4/TG1或ΦC31/ΦBT1/SV1/TG1整合基因；在卡那抗性标记aphII的质粒中，2个质粒含有1套整合系统即ΦBT1或SV1整合元件，3个质粒同时含有2套整合系统即ΦBT1/ R4、ΦBT1/SV1或SV1/R4整合元件，3个质粒同时含有3套整合系统即SV1/R4/ΦBT1、SV1/R4/ΦC31或SV1/R4/TG1整合元件，3个质粒同时含有4套整合系统即SV1/R4/ΦBT1/ΦC31、SV1/ R4/ΦBT1/TG1或SV1/R4/ΦC31/TG1整合元件，
所述模块化质粒通过下述步骤构建：采用CRISPR/Cas9反应体系对第二质粒进行基因编辑，使用Cas9酶去除质粒上的整合基因和第二抗性基因，得到包含外源基因簇和上游接头及下游接头的第一轮无抗性质粒；酶切第一质粒，采用一种限制性内切酶SpeI或SwaI酶切去掉整合基因和第一抗性基因，得到包含
整合基因、第一抗性基因、上游接头及下游接头的第一轮DNA片段；采用Gibson反应体系将上述第一轮无抗性质粒与第一轮DNA片段组装一起，得到第一轮模块化质粒；
酶切第一轮模块化质粒，采用另一种限制性内切酶SwaI或SpeI酶切去掉整合基因和第一抗性基因，得到包含外源基因簇和上游接头及下游接头的第二轮无抗性质粒；酶切另一种第一质粒，该质粒上的整合基因和抗性基因与第一轮中第一质粒上的整合基因和抗性基因皆不相同，采用一种限制性内切酶SpeI或SwaI酶切去掉整合基因和抗性基因，得到包含整合基因、抗性基因、上游接头及下游接头的第二轮DNA片段；采用Gibson反应体系将上述第二轮无抗性质粒与第二轮DNA片段组装一起，得到第二轮模块化质粒。
2.如权利要求1所述的整合系统，其特征在于，还包含用于对第二质粒进行基因编辑的CRISPR/Cas9反应体系、以及Gibson组装反应体系。
3.如权利要求1所述的整合系统，其特征在于，所述外源基因簇是5‑酮米尔贝霉素合成基因簇。
4.一种在放线菌基因组上整合多拷贝外源基因簇的方法，包括如下步骤：
1）使用权利要求1中构建的第一轮模块化质粒转化放线菌细胞，从而在噬菌体来源整合酶介导下，将外源基因簇整合到放线菌基因组上；
2）继续使用权利要求1中构建的第二轮模块化质粒转化步骤1）中构建的放线菌细胞，从而在噬菌体来源整合酶介导下，再次将外源基因簇整合到放线菌基因组上。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述放线菌是吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus），所述外源基因簇是5‑酮米尔贝霉素合成基因簇。
一种放线菌天然产物合成基因簇多拷贝整合方法
技术领域
[0001]本发明属于代谢工程领域，涉及一种用于在放线菌基因组上整合多拷贝基因簇的整合系统及其应用，具体涉及一种放线菌天然产物合成基因簇多拷贝整合方法和用于实施该方法的整合系统。
背景技术
[0002]微生物产生的具有生物活性的天然产物(又称次级代谢产物)是人类抵抗癌症、衰老和感染性疾病等的宝贵财富。以抗生素为例，据统计，在已报道的天然来源的抗生素中，有50％左右是由放线菌科的链霉菌产生的。抗生素生物合成基因簇包含了结构、抗性、外排、调控与后修饰等基因，基因簇大小一般在10‑100kb不等。伴随着代谢工程的迅速发展，多种提高抗生素产量有利的策略被开发与应用，包括优化调控网络、减少竞争途径、提高耐受性以及扩增合成基因簇拷贝数等。这些策略避免了传统诱变筛选
时所需大量的时间与人力成本，可有效优化次级代谢产物的生物合成。
[0003]吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)是一种在适当的条件下，可以生产5‑ 酮米尔贝霉素(5‑oxomilbemycin)的放线菌。5‑酮米尔贝霉素的衍生物米尔贝肟已在美国、日本及等地区广泛用于植物病虫害与动物寄生虫防治。因此构建高产5‑ 酮米尔贝霉素的工程菌将显著加快其衍生物米尔贝肟在国内的产业化进程。
[0004]尽管放线菌现已被较多地应用于生产各种重要的天然药物，但是鉴于其代谢机制复杂，生产过程中不确定因素较多，本领域仍然需要进一步开发优化其生物合成途径、优化调控网络等的技术，以期进一步地提高天然药物的产量。
[0005]为了在放线菌比如链霉菌的基因组上整合多拷贝的天然产物合成基因簇，考虑到放线菌基因组中天然存在着许多不同整合系统对应的attB位点的特点，前期我们已经开发了一种基于“一个整合酶‑多个a t t B位点”理念的基因簇多拷贝扩增方法M S G E (Multiplexed Site‑specific Genome Engineering)(Li et al.,Metabolic Engineering,2017)，其机理参见图1。该方法在体外基因簇编辑方法CGE(CRISPR/Cas9 and Gibson assembly‑assisted DNA Editing)的辅助下，克服了传统的放线菌基因组上多个attB位点需要人工引入、费时费力的缺陷，通过在含有目标基因簇的载体中直接添加上多套整合系统，可一步实现多拷贝插入。但是，后来的研究发现，该MSGE方法也存在一些缺陷，比如，要想一步实现4个以上拷
贝同时插入比较困难，成功率较低；该方法需提前将外源attB位点插入至染体中，比较耗时；该方法很难用于遗传操作困难的菌株，因为此时将不能再使用高效的CRISPR/Cas9技术引入外源attB位点，等等。因此针对MSGE 方法的不足，有必要进一步开发新一代基因簇多拷贝扩增方法。
发明内容
[0006]为了克服MSGE方法的不足，避免一步实现多拷贝同时插入放线菌基因组时比较困难、成功率低的缺陷，我们设计了目标基因簇两轮迭代插入放线菌基因组的多拷贝整合方
法。
[0007]因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于整合多拷贝基因簇的即插即用型整合系统或称整合工具箱。
[0008]本发明的第二个目的在于提供一种在放线菌基因组整合多拷贝基因簇的方法。[0009]为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0010]一种用于在放线菌基因组上整合多拷贝基因簇的整合系统，其包括第一质粒，该质粒上包括：用于整合外源基因簇(或称目标基因簇)比如天然产物合成基因簇的多克隆位点MCS；位于多克隆位点MCS上游的链霉菌启动子kasOp*；两种以上作为整合位点的整合基因，所述整合基因选自噬菌体来源整合酶
ΦC31、ΦBT1、R4、SV1或TG1基因结合attP位点的DNA片段，即ΦC31Att/Int(缩写为C)、ΦBT1Att/Int(缩写为B)、R4Att/Int (缩写为R)、SV1Att/Int(缩写为S)、TG1Att/Int(缩写为T)；邻接整合基因的第一抗性基因，其选自阿普那抗性基因acc(3)IV、卡那抗性基因aphII、硫链丝菌素抗性基因tsr；分别位于整合基因及第一抗性基因上下游的通用组装接头即上游接头和下游接头；限制性内切酶SpeI和SwaI的酶切位点，所述SpeI和SwaI酶切位点对称地分别位于上游接头和下游接头两端，当用一种限制性内切酶SpeI或SwaI酶切后，留下另一种酶切位点SwaI 或SpeI。
[0011]优选地，上述整合系统还包含第二质粒，该质粒上包含：外源基因簇(或称目标基因簇)比如天然产物合成基因簇；一种或者两种以上作为整合位点的整合基因，所述整合基因选自ΦC31、ΦBT1、R4、SV1或TG1基因结合attP位点的DNA片段，并且当包含两种以上整合基因时，与第一质粒上的整合基因不相同；邻接整合基因的第二抗性基因，所述抗性基因选自阿普那抗性基因acc(3)IV、卡那抗性基因aphII、硫链丝菌素抗性基因tsr，并且与第一抗性基因不相同；分别位于整合基因和第二抗性基因上下游的通用组装接头即上游接头和下游接头。
[0012]例如，当第一质粒上两种整合基因为ΦC31/ΦBT1或R4/SV1配对时，第二质粒上两种配套的整合基因可以是R4/SV1或ΦC31/ΦBT1；或者第二质粒上仅有一个整合基因比如ΦC31。
[0013]上述两种以上整合基因的所谓“配对”与“配套”意义相同，都是指两种以上不同的整合基因之间的组合方式。
[0014]优选地，上述第一质粒上包含两种整合基因，选自ΦC31/ΦBT1或R4/SV1配对。[0015]优选地，上述第二质粒上可以仅包含一种整合基因比如ΦC31。
[0016]在一种实施方式中，上述整合系统还包含用于对第二质粒进行基因编辑的 CRISPR/Cas9反应体系、以及Gibson组装反应体系。
[0017]上述外源基因簇可以是5‑酮米尔贝霉素合成基因簇。
[0018]作为一种“多个整合酶‑多个attB位点”系统的具体应用方式，优选上述整合系统呈试剂盒形式。
[0019]在一种优选的实施方式中，上述整合系统可进行如下两轮的即插即用式操作：第一轮，采用CRISPR/Cas9反应体系对第二质粒进行基因编辑，使用Cas9核酸内切酶除去质粒上的整合基因比如ΦC31和第二抗性基因比如acc(3)IV，得到包含外源基因簇和上游接头及下游接头的第一轮无抗性质粒；酶切第一质粒，采用一种限制性内切酶SpeI或SwaI 酶切去掉整合基因比如R4/SV1和第一抗性基因比如aphII，得到包含整合基因比如 R4/SV1、第
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