(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911215384.8
(22)申请日 2019.12.02
(71)申请人 广东容大生物股份有限公司
地址 511500 广东省清远市清远高新技术
产业开发区建设二路31号
(72)发明人 张文 方文棋 蒋顺进 黄炜乾
张泳 郑雪媚 刘宗新 吴阳开
潘庆伟 林万华 何海峰 贾元斌
(74)专利代理机构 广州三环专利商标代理有限
公司 44202
代理人 颜希文
(51)Int.Cl.
C12N 13/00(2006.01)
C12N 15/01(2006.01)
C12N 15/04(2006.01)
C12N 1/14(2006.01)C12P 19/40(2006.01)C12R 1/645(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种地顶孢霉培养物的生产
方法，通过本方法的筛选、优化、诱变，从而得到
进行培养，然后调节培养参数来确定地顶孢霉变
株的培养参数，从而使生产出来的地顶孢霉培养
物里虫草素含量显著增加。权利要求书1页 说明书3页CN 110951721 A 2020.04.03
C N 110951721
A
1.一种地顶孢霉培养物的生产方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
S1.通过对虫草真菌分离筛选获得地顶孢霉FR01为出发菌种；
S2.对地顶孢霉FR01进行原生质体制备以及再生条件优化；
S3.通过紫外线和常压室温等离子体ARTP对原生质体进行诱变研究，同时通过氯化锂浓度的浓度固化菌株的诱变效应，然后分别以菌丝体的生物量及虫草素含量为指标筛选优质变株，再以生物量最高和虫草素合成最好的变株为出发菌株，通过加热的方式对原生质体进行亲本双灭活，以聚乙二醇为促融剂，进行细胞融合与再生，并通过微孔板初筛菌株生物量大且虫草素含量明显提高的变株，再通过摇瓶发酵复筛得到发酵菌丝体生物量多、同时能够有效合成虫草素的地顶孢霉变株；
S4.根据S3选育获得的变株生理特性，以摇瓶种子配方为基础制备营养液，并添加一定量的小米替代琼脂粉的固化，制成表面积大、通气量好且易于地顶孢霉变株萌发的强化培养基；
S5.移种地顶孢霉变株种子至强化培养基上进行培养从而制备制备菌悬液；
S6.观测步骤S5中不同碳源、氮源、无机盐对变株生物量即虫草素积累的影响从而制定最适合的培养基促生长因子以及地顶孢霉变株种子的占比；
S7.采用陶瓷膜超滤分离技术结合滤液吸附工艺分级收集发酵菌丝以及虫草素。
2.如权利要求1所述的一种地顶孢霉培养物的生产方法，其特征在于：
步骤S6内确定的促生长因子为蛋氨酸、精氨酸和B族维生素。
3.如权利要求1所述的一种地顶孢霉培养物的生产方法，其特征在于：
步骤S5中对地顶孢霉变株种子培养采用的是斜面培养。
4.如权利要求1所述的一种地顶孢霉培养物的生产方法，其特征在于：步骤S3中的微孔板为96孔微孔板。
权 利 要 求 书1/1页CN 110951721 A
一种地顶孢霉培养物的生产方法
技术领域
[0001]本发明涉及虫草领域，特别是一种地顶孢霉培养物的生产方法。
背景技术
[0002]近年来，随着科学的发展，人们对健康意识的不断增强以及抗生素可能产生的副作用的不断认识，从保护健康与环境出发，不同的国家，尤其是经济发达国家对抗生素饲料添加剂的使用作了不同的限制。瑞典在1996年就开始禁止在猪饲料中使用抗生素促长剂，以望为消费者提供“天然的猪肉”；美国对饲料中使用抗生素的反应不如欧盟国家强烈，但采纳了欧盟国家禁用抗生素的积极方面，由美国FDA、疾病控制和预防中心、农业部协作成立了国家抗生素的抗药性检控体系，一旦发现耐药性产生，便启动相应的法律禁止使用。我国已制定发布了《饲料药物添加剂使用规范》规范抗生素饲料添加剂的使用。限制抗生素作饲料添加剂，是生产安全食品的需要，是发展的大趋势。
[0003]在中国养殖业规模化发展提速、减抗限抗禁抗的呼声日益强烈的大背景下，开发高效、营养型的饲料添加对于动物健康及养殖业可持续发展显得尤为重要。发明人以从长白山山区的北虫草中分离到的野生虫生真菌——地顶孢霉为出发菌株，并以此为基础提取出地顶孢霉培养物。该培养物是饲料添加剂目录中收录的安全、高效的新型绿饲料添加剂，可用于添加饲喂各生长阶段的畜禽，对维护动物健康，逐步实现生态健康养殖具有良好的社会与现实意义。
[0004]但是作为地顶孢霉培养物中的主要活性成分的虫草素含量普遍不高。虫草的几种主要活性成分中，
唯有虫草素是虫草类的特有成分，其他活性成分都有各自的功能，但若能提高虫草类产品的虫草素含量，不仅可以提高应用效果，还可以在宣传和包装上突出虫草素含量，促进产品的销售推广，为开发带来可观利润。
发明内容
[0005]为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种虫草素含量更高的一种地顶孢霉培养物的生产方法。
[0006]本发明为解决问题所采用的技术方案是：一种地顶孢霉培养物的生产方法，依次包括以下步骤：
[0007]S1.通过对虫草真菌分离筛选获得地顶孢霉FR01为出发菌种；
[0008]S2.对地顶孢霉FR01进行原生质体制备以及再生条件优化；
[0009]S3.通过紫外线和常压室温等离子体ARTP对原生质体进行诱变研究，同时通过氯化锂浓度的浓度固化菌株的诱变效应，然后分别以菌丝体的生物量及虫草素含量为指标筛选优质变株，再以生物量最高和虫草素合成最好的变株为出发菌株，通过加热的方式对原生质体进行亲本双灭活，以聚乙二醇为促融剂，进行细胞融合与再生，并通过微孔板初筛菌株生物量大且虫草素含量明显提高的变株，再通过摇瓶发酵复筛得到发酵菌丝体生物量多、同时能够有效合成虫草素的地顶孢霉变株；
[0010]S4.根据S3选育获得的变株生理特性，以摇瓶种子配方为基础制备营养液，并添加一定量的小米替代琼脂粉的固化，制成表面积大、通气量好且易于地顶孢霉变株萌发的强化培养基；
[0011]S5.移种地顶孢霉变株种子至强化培养基上进行培养从而制备制备菌悬液；[0012]S6.观测步骤S5中不同碳源、氮源、无机盐对变株生物量即虫草素积累的影响从而制定最适合的培养基促生长因子以及地顶孢霉变株种子的占比；
[0013]S7.采用陶瓷膜超滤分离技术结合滤液吸附工艺分级收集发酵菌丝以及虫草素。[0014]作为上述技术方案的进一步改进，步骤S6内确定的促生长因子为蛋氨酸、精氨酸和B族维生素。
[0015]作为上述技术方案的进一步改进，步骤S5中对地顶孢霉变株种子培养采用的是斜面培养。
[0016]作为上述技术方案的进一步改进，步骤S3中的微孔板为 96孔微孔板。
[0017]本发明的有益效果：通过本方案的筛选、优化、诱变，从而得到生产虫草素含量更高的地顶孢霉变株，然后对其进行培养，然后调节培养参数来确定地顶孢霉变株的培养参数，从而使生产出来的地顶孢霉培养物里虫草素含量显著增加。
具体实施方式
[0018]一种地顶孢霉培养物的生产方法，依次包括以下步骤：
[0019]S1.通过对虫草真菌分离筛选获得地顶孢霉FR01为出发菌种；
[0020]S2.对地顶孢霉FR01进行原生质体制备以及再生条件优化；
[0021]S3.通过紫外线和常压室温等离子体ARTP对原生质体进行诱变研究，同时通过氯化锂浓度的浓度固化菌株的诱变效应，然后分别以菌丝体的生物量及虫草素含量为指标筛选优质变株，再以生物量最高和虫草素合成最好的变株为出发菌株，通过加热的方式对原生质体进行亲本双灭活，以聚乙二醇为促融剂，进行细胞融合与再生，并通过微孔板初筛菌株生物量大且虫草素含量明显提高的变株，再通过摇瓶发酵复筛得到发酵菌丝体生物量多、同时能够有效合成虫草素的地顶孢霉变株；
[0022]S4.根据S3选育获得的变株生理特性，以摇瓶种子配方为基础制备营养液，并添加一定量的小米替代琼脂粉的固化，制成表面积大、通气量好且易于地顶孢霉变株萌发的强化培养基；
[0023]S5.移种地顶孢霉变株种子至强化培养基上进行培养从而制备制备菌悬液；[0024]S6.观测步骤S5中不同碳源、氮源、无机盐对变株生物量即虫草素积累的影响从而制定最适合的培养基促生长因子以及地顶孢霉变株种子的占比；
[0025]S7.采用陶瓷膜超滤分离技术结合滤液吸附工艺分级收集发酵菌丝以及虫草素。[0026]通过本方案的筛选、优化、诱变，从而得到生产虫草素含量更高的地顶孢霉变株，然后对其进行培养，然后调节培养参数来确定地顶孢霉变株的培养参数，从而使生产出来的地顶孢霉培养物里虫草素含量显著增加。
[0027]进一步进行优选，步骤S6内确定的促生长因子优选为蛋氨酸、精氨酸和B族维生素。
[0028]进一步进行改进，为了使步骤S5中对地顶孢霉变株种子的培养效果更好，优选采
用斜面培养。
[0029]进一步进行改进，步骤S3中的微孔板为96孔微孔板。
[0030]以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
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