(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.11.20C N 103397000 A (21)申请号 201310291474.1
(22)申请日 2013.07.11
CGMCC No.7307 2013.02.28
C12N 7/00(2006.01)
A61K 39/205(2006.01)
A61P 31/14(2006.01)
C12R 1/93(2006.01)
(71)申请人北京天坛生物制品股份有限公司
地址100024 北京市朝阳区三间房南里4号
(72)发明人王辉 张月兰 苏桂民 李爱灵
梁宏阳 赵硕 张晋 马可
(74)专利代理机构北京三友知识产权代理有限
公司 11127
代理人丁香兰 韩蕾
(54)发明名称
法与应用
(57)摘要
本发明提供了一种狂犬病病毒人二倍体细胞
适应株及其制备方法与应用，具体是指一种狂犬
病病毒aG 株人二倍体细胞（2BS ）适应株，该狂犬
病病毒人二倍体细胞适应株的保藏编号为CGMCC
No.7307。本发明还提供了该适应株的制备方法、
该适应株在制备人二倍体细胞狂犬病疫苗中的应
用、以及以该适应株制备人二倍体细胞狂犬病疫
苗的方法和所制备得到的狂犬病疫苗。
(83)生物保藏信息
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书7页 附图3页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页 附图3页(10)申请公布号CN 103397000 A
*CN103397000A*
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1.一种狂犬病病毒人二倍体细胞适应株，该适应株的保藏编号为CGMCC No.7307。
2.权利要求1所述的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株的制备方法，该方法包括：采用狂犬病病毒固定毒aG 株在人二倍体细胞2BS 细胞上传代与挑斑相结合的方法，即当病毒传代至病毒滴度达到一定水平后，将10倍系列稀释的病毒液与消化分散的2BS 细胞同种于6孔板进行挑斑，挑选到抗原含量高的病毒克隆后继续在小方瓶中传代适应，得到狂犬病病毒人二倍体细胞适应株CGMCC No.7307。
3.权利要求1所述的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株在制备人二倍体细胞狂犬病疫苗中的应用。
4.一种制备人二倍体细胞狂犬病疫苗的方法，该方法包括：反应器或细胞工厂培养人二倍体细胞-2BS ，接种权利要求1所述的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株，收获单次病毒收获液，将病毒收获液合并，进行超滤浓缩，利用柱层析法纯化，之后灭活将病毒，并添加保护剂，冻干，即为冻干人二倍体细胞狂犬病疫苗。
5.一种人二倍体细胞狂犬病疫苗，其是利用权利要求1所述的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株制备得到的。
6.根据权利要求5所述的人二倍体细胞狂犬病疫苗，其是按照权利要求4所述的方法制备得到的。权 利 要 求 书CN 103397000 A
狂犬病病毒人二倍体细胞适应株及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明是关于一种狂犬病病毒人二倍体细胞适应株及其制备方法与应用，具体是指一种狂犬病病毒aG株人二倍体细胞（2BS）适应株、该适应株的制备方法以及该适应株在制备人二倍体细胞狂犬病疫苗中的应用。
背景技术
[0002] 狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒感染所导致的以损害中枢神经系统为主要症状的急性传染病，属人兽共患的自然疫源性疾病，一旦发病，病死率100%，目前尚无特效药物用于，接种狂犬病疫苗是预防狂犬病的有效方法。
[0003] 在我国，目前上市的狂犬病疫苗主要有三种，分别为Vero传代细胞、原代地鼠肾细胞和原代鸡胚细胞疫苗。
[0004] Vero细胞生产用毒种为狂犬病病毒固定毒CTN-1V、aGV株或其他经Vero细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。Vero细胞系是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的，Vero细胞系是连续的非整倍体细胞。由于是传代细胞系，有一定的致肿瘤性；疫苗必须纯化，且细胞DNA含量须达到标准（10ng/剂）。
[0005] 原代地鼠肾细胞生产用毒种为狂犬病病毒固定毒aG株或经批准的其他地鼠肾细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。由多种类型的细胞组成，细胞种类比较复杂，细胞间特性存在差异；动物的个体间存在差异，难以保证细胞质量的一致性；需要建立符合要求的动物繁殖设施，污染环境有悖3R原则，原代细胞培养的营养条件要求较高，不能进行生物反应器现代化大规模培养，外源致病微生物污染的风险较大。
[0006] 而进口鸡胚细胞狂犬病疫苗采用的是狂犬病病毒Flury LEP。SPF鸡蛋成本高，疫苗价格高；鸡蛋过敏者仍须慎重使用；病毒株在鸡胚细胞中产量较低，生产成本较高；剂量大，每剂量1ml。
[0007] 人二倍体细胞来源于人胚肺，为人正常核型细胞，无致癌性，无病毒外源因子和外源动物杂质污染，是疫苗生产的最安全细胞基质。人二倍体细胞狂犬病疫苗于20世纪60年代由美国Wistar研究所Wiktor等人首创，1974年在法国首次获准生产上市，1977年WHO 推荐使用，主要由法国、德国生产，
仅在美国、欧洲等发达国家以及部分亚洲国家使用，目前已接种150多万人。人二倍体细胞狂犬病疫苗具有高免疫原性和良好的耐受性，无严重的不良反应，不含外源因子，预防性接种产生高滴度的中和抗体，对暴露后人的安全有效，被认为是狂犬病疫苗的黄金标准。但目前的人二倍体细胞狂犬病疫苗生产技术仍存在产能不高的问题，且疫苗质量有待更进一步提高。
[0008] 目前我国还没有人二倍体细胞狂犬病疫苗上市的报道。生产人二倍体细胞狂犬病疫苗首要条件为建立狂犬病病毒人二倍体细胞适应株。
发明内容
[0009] 本发明的一个目的即在于提供一种人二倍体细胞适应株，以进一步提供安全、有
效、与人类抗原性高度一致的狂犬病疫苗。
[0010] 本发明研究采用人二倍体细胞株——2BS株，对狂犬病病毒aG株进行传代适应性研究，通过带毒细胞传代与挑斑相结合的方法，挑选出了病毒滴度高、免疫原性好的狂犬病病毒适应毒种，建立了狂犬病病毒aG株在人二倍体细胞2BS上的适应株。本发明将该适应株命名为2aG4-B（B为2BS中的B）。本发明的适应株已于2013年02月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号：CGMCC No.7307。
[0011] 根据本发明的具体实施方案，本发明采用的狂犬病病毒为固定毒aG株，来源于武汉生物制品研究所，适应前代次为2aG4。毒种2aG4采用在2BS细胞上传代与挑斑相结合的方法，在传代至第40代时建立了本发明的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株。按照《中华人民共和国药典》对该第40代进行毒种检定，免疫原性保护指数为270以上，鉴别试验显示所有的病毒被抗狂犬病血清所中和，中和指数高，无外源病毒污染，无菌检查、支原体检查及病毒外源因子检查均合格。此外，通过病毒RNA序列的测定显示适应前后有16个碱基发生了变化，但未对病毒关键序列造成影响，病毒毒力和抗原性无变异。抗狂犬病病毒单克隆IgG荧光显显示狂犬病病毒阳性。
[0012] 根据病毒传代稳定性研究结果显示，第40代至第46代病毒，病毒滴度、免疫原性、鉴别试验及RNA序列等无差别，作为毒种均可以生产人二倍体细胞狂犬病疫苗，因此，第40代至第46代七个代次的病毒均被定义为狂犬病病毒人二倍体细胞适应株。
[0013] 本发明的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株具有优异的对细胞的亲和性强、传代稳定、无变异、抗原性好、培养产毒量高等特性，能生产出病毒滴度高、效价高、安全性好的狂犬病疫苗。
[0014] 从而，一方面，本发明提供了一种狂犬病病毒人二倍体细胞适应株，该适应株的保藏编号为CGMCC No.7307。
[0015] 另一方面，本发明提供了所述的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株的制备方法，该方法包括：采用
狂犬病病毒固定毒aG株在人二倍体细胞2BS细胞上传代与挑斑相结合的方法，即当病毒传代至病毒滴度达到一定水平后，将10倍系列稀释的病毒液与消化分散的2BS细胞同种于6孔板进行挑斑，挑选到抗原含量高的病毒克隆后继续在小方瓶中传代适应，得到狂犬病病毒人二倍体细胞适应株CGMCC No.7307。
[0016] 另一方面，本发明还提供了所述的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株在制备人二倍体细胞狂犬病疫苗中的应用。
[0017] 另一方面，本发明还提供了一种制备人二倍体细胞狂犬病疫苗的方法，该方法包括：
[0018] 反应器或细胞工厂培养人二倍体细胞-2BS，将本发明的的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株以合适的MOI接种到人二倍体细胞上，收获单次病毒收获液，将病毒收获液合并，进行超滤浓缩，利用柱层析法纯化，之后灭活病毒，并添加保护剂，冻干，即为冻干人二倍体细胞狂犬病疫苗。
[0019] 另一方面，本发明还提供了一种人二倍体细胞狂犬病疫苗，其是利用权利要求1所述的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株制备得到的。
[0020] 更具体地，本发明的人二倍体细胞狂犬病疫苗是按照上述方法制备得到的。该疫
苗效价高、安全性好。
[0021] 综上所述，本发明提供了一种狂犬病病毒人二倍体细胞适应株CGMCC No.7307，采用本发明的适应株，为生产人二倍体细胞狂犬病疫苗提供了毒种。以此毒种生产的人二倍体细胞狂犬病疫苗无外源因子污染，制品质量高，免疫效果好，质量高度可控，生产纯化时无须考虑细胞DNA，与人类抗原性一致，过敏反应小，安全可靠；且目前狂犬病疫苗市场需求大。
附图说明
[0022] 图1为本发明的病毒传代方式流程示意图。
[0023] 图2为2aG4传代与挑斑各培养代次病毒滴度和抗原含量曲线图。
[0024] 图3A～图3C为适应株的稳定性：免疫原性、鉴别试验和病毒滴度检测曲线图。[0025] 图4为不同稀释度的适应株在BHK-21细胞上培养3天后的荧光染图。其中，图片A：10-3；图片B：10-4；图片C：10-5；图片D：10-6；图片E：正常细胞对照。狂犬病病毒阳性显现绿荧光。
[0026] 图5为实验样品抗原含量和效价曲线图。
[0027] 用于专利程序的微生物保存：
[0028] 保藏日期：2013年2月28日
[0029] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0030] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所[0031] 保藏编号：CGMCC NO.7307
[0032] 分类命名：狂犬病病毒。
具体实施方式
[0033] 为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中所用各原始试剂、材料均可商购获得；实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商或提供商所建议的条件。
[0034] 实施例1狂犬病病毒人二倍体细胞适应株的建立
[0035] 请参照图1所示的病毒传代流程示意图，取狂犬病病毒2aG4毒种（来源自武汉生物制品研究所的固定毒aG株，代次为2aG4）1ml，与1：2分种率的2BS细胞同种至25cm2小方瓶中（2瓶），记为2aG4-B1(B为2BS中的B，B1表示狂犬病病毒在2BS细胞上传一代)，生长液为含8-10%新生牛血清、pH7.2-7.4的GIBCO MEM，于37±0.5℃培养三天，换含0.05-0.2%人血白蛋白、pH7.0-7.6的GIBCO MEM维持液35±0.5℃继续培养。至6-8天，混合收获病毒液，其中一瓶以0.25%胰酶消化，以1：2的分
种率进行带毒细胞传代，并补加正常2BS细胞约1×105个/瓶（以后视细胞病变程度增减细胞补加量），同时接种病毒液1ml/瓶，记为2aG4-B2（B2表示狂犬病病毒在2BS细胞上传二代，依次类推），另一瓶换新鲜维持液继续培养。以上为一个完整的病毒代方式。
[0036] 病毒滴度按照NIH法脑内接种11-13g小鼠，0.03ml/只，每个稀释度6只，测定小鼠脑内毒力。病毒收获液采用56℃水浴30分钟的灭活方法，ELISA法检测狂犬病病毒抗原
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