(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611139117.3
(22)申请日 2016.12.12
(71)申请人 中国科学院天津工业生物技术研究
所
地址 300308 天津市滨海新区空港经济区
西七道32号中国科学院天津工业生物
技术研究所
(72)发明人 冯淼 田会娟 王璐 王丽娜
田敬东
(74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限
公司 11227
代理人 赵青朵
(51)Int.Cl.
C12N 15/10(2006.01)
C40B 50/06(2006.01)
C40B 40/08(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因饱
续多点饱和突变库构建方法适用于高通量蛋白
质功能筛选，以含有表达目的蛋白的基因的环状
双螺旋DNA质粒为模板，采用一对序列完全反向
互补的正向和反向突变引物，通过聚合酶链式反
应，仅需一步反应即可实现在长序列DNA中连续
排列的多个碱基的饱和突变，具有简单、快速、突
变成功率高的特点，可实现在氨基酸水平上对蛋
白质功能位点的快速筛选定位和高效突变改造。权利要求书1页 说明书11页序列表39页 附图4页CN 106754875 A 2017.05.31
C N 106754875
A
1.一种基因饱和突变库的构建方法，其特征在于，以含有表达目的蛋白的基因的环状双螺旋DNA质粒为模板，采用一对序列完全反向互补的正向突变引物和反向突变引物，通过聚合酶链式反应构建获得基因饱和突变库；
所述正向突变引物和所述反向突变引物的序列中分别含有9个以上连续排列的兼并碱基。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述含有表达目的蛋白的基因的环状双螺旋质粒的长度不小于8kb。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应的循环数不高于18。
4.根据权利要求1至3任一项所述的构建方法，其特征在于，获得所述基因饱和突变库后还包括经DpnI酶消化除去模板后，直接转化到宿主菌进行培养基平板筛选的步骤。
5.根据权利要求1至4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述正向突变引物由三部分序列组成：5’-模板序列、兼并碱基序列和3’-模板序列，其中所述兼并碱基序列是以兼并碱基代替了目的基因中待突变的序列，5’-模板序列是目的基因中待突变序列5’端上游的序列，3’-模板序列是目的基因中待突变序列3’端下游的序列；
所述反向突变引物的序列为所述正向突变引物的反向互补序列。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述5’-模板序列和所述3’-模板序列的T m 值相差不高于5℃，所述5’-模板序列和所述3’-模板序列的长度均不低于所述兼并碱基序列。
7.根据权利要求1至6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述正向突变引物和所述反向突变引物的序列如SEQ ID No.7～SEQ ID No.112所示。
8.根据权利要求1至7任一项所述的构建方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应的体系为：所述环状双螺旋DNA质粒20～100ng、所述正向突变引物100～200nM、所述反向突变引物100～200nM、Q5高保真聚合酶1U、1×Q5反应缓冲液。
9.根据权利要求1至8任一项所述的构建方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应的条件为：98℃预变性1～2.5min、以如下条件进行10～18个循环：98℃0.5～1min、退火0.5～2min、72℃延伸15s/kb，最后以72℃再进行2～5min延伸。
10.根据权利要求1至9任一项所述的构建方法获得的基因饱和突变库。
11.根据权利要求10所述的基因饱和突变库在蛋白质功能位点的快速筛选定位和/或高效突变改造中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 106754875 A
基因饱和突变库及其构建方法、应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因饱和突变库及其构建方法、应用。
背景技术
[0002]蛋白质改造和筛选技术在天然基因的异源表达、疫苗、抗体等蛋白类药物的优化、人工合成细胞
工厂乃至人造生命体等方面应用广泛，对人类健康和社会发展具有重大意义。在蛋白质功能研究和工程改造中，首先要确定影响蛋白质功能的关键氨基酸位点，通过对这些位点进行多轮突变和筛选，获得所需功能和活性的工程蛋白质。通常的策略是先采用多轮易错PCR对目的基因进行随机突变，初步筛选出一些可疑位点。随后，采用定点突变或多点突变方法围绕可疑位点展开进一步探查。
[0003]然而，虽然易错PCR可以随机地向目的基因中一次性引入多个碱基突变，但它的这种随机性也限制了这种方法的突变效率，比如多轮突变中某些位点被重复突变，而某些区域的序列始终没有被突变，各轮的突变碱基个数也不尽相同，导致在有限的实验次数中几乎无法实现对目的基因序列的全面探查。另一方面，目前所采用的各种定点突变方法通常单轮实验只能实现1-3个相邻碱基突变，多点突变则要求各个突变位点之间的间隔需在几十到几百个碱基对以上，并且通常也需要多个PCR反应串联才能实现最终的突变目的。这些方法对指定序列中连续排列的多个碱基突变效率低、步骤繁琐，并且对长序列DNA的兼容性差。
发明内容
[0004]有鉴于此，本发明提供一种适用于高通量蛋白质功能筛选的长序列DNA中连续多点饱和突变库构建方法。本发明提供的连续多点饱和突变库构建方法仅需一步反应即可实现在长序列DNA中连续排列的多个碱基的饱和突变，具有简单、快速、突变成功率高的特点，可实现在氨基酸水平上对蛋白质功能位点的快速筛选定位和高效突变改造。
[0005]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006]本发明提供了一种基因饱和突变库的构建方法，以含有表达目的蛋白的基因的环状双螺旋DNA质粒为模板，采用一对序列完全反向互补的正向突变引物和反向突变引物，通过聚合酶链式反应构建获得基因饱和突变库；
[0007]所述正向突变引物和所述反向突变引物的序列中分别含有9个以上连续排列的兼并碱基。
[0008]在本发明的一些具体实施方案中，所述含有表达目的蛋白的基因的环状双螺旋质粒的长度不小于8kb。
[0009]在本发明的一些具体实施方案中，所述聚合酶链式反应的循环数不高于18。[0010]在本发明的一些具体实施方案中，获得所述基因饱和突变库后还包括经DpnI酶消化除去模板后，直接转化到宿主菌进行培养基平板筛选的步骤。
[0011]在本发明的一些具体实施方案中，所述正向突变引物由三部分序列组成：5’-模板
序列、兼并碱基序列和3’-模板序列，其中所述兼并碱基序列是以兼并碱基代替了目的基因中待突变的序列，5’-模板序列是目的基因中待突变序列5’端上游的序列，3’-模板序列是目的基因中待突变序列3’端下游的序列；
[0012]所述反向突变引物的序列为所述正向突变引物的反向互补序列。
[0013]在本发明的一些具体实施方案中，所述5’-模板序列和所述3’-模板序列的T m值相差不高于5℃，所述5’-模板序列和所述3’-模板序列的长度均不低于所述兼并碱基序列。[0014]在本发明的一些具体实施方案中，所述正向突变引物和所述反向突变引物的序列如SEQ ID No.7～SEQ ID No.112所示。
[0015]在本发明的一些具体实施方案中，所述聚合酶链式反应的体系为：所述环状双螺旋DNA质粒20～100ng、所述正向突变引物100～200nM、所述反向突变引物100～200nM、Q5高保真聚合酶1U、1×Q5反应缓冲液。
[0016]在本发明的一些具体实施方案中，所述聚合酶链式反应的条件为：98℃预变性1～2.5min、以如下条件进行10～18个循环：98℃0.5～1min、退火0.5～2min、72℃延伸15s/kb，最后以72℃再进行2～5min延伸。
[0017]本发明还提供了所述的构建方法获得的基因饱和突变库。
[0018]本发明还提供了所述的基因饱和突变库在蛋白质功能位点的快速筛选定位和/或高效突变改造中的应用。
[0019]本发明提供了一种适用于高通量蛋白质功能筛选的长序列DNA中连续多点饱和突变库构建方法，
以含有表达目的蛋白的基因的环状双螺旋DNA质粒为模板，采用一对序列完全反向互补的正向和反向突变引物，通过聚合酶链式反应，仅需一步反应即可实现在长序列DNA中连续排列的多个碱基的饱和突变，具有简单、快速、突变成功率高的特点，可实现在氨基酸水平上对蛋白质功能位点的快速筛选定位和高效突变改造。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0021]图1示本发明提供的长序列DNA饱和突变库构建方法全过程的示意图；
[0022]图2示实施例1和2中用于构建饱和突变库的模板质粒图谱；其中，图2(A)示EBPA质粒图谱；图2(B)示EBPP质粒图谱；
[0023]图3示实施例1和2中目的基因突变区域分组示意图；
[0024]图4示实施例3中突变库测序峰图；
[0025]图5示实施例4中突变基因库转化到表达宿主中的进行筛选的培养平板。
具体实施方式
[0026]本发明公开了一种适用于高通量蛋白质功能筛选的长序列DNA中连续多点饱和突变库构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现
和应用本发明技术。
[0027]本发明提供的长序列DNA中连续多位点饱和突变库构建方法包括以下步骤：[0028](1)构建含有目的基因的环状双螺旋DNA质粒；
[0029](2)确定待突变的基因位点或区域，设计和合成构建基因筛选库所需的突变引物；[0030](3)采用聚合酶链式反应进行突变基因库的合成；
[0031](4)所获得的突变基因库经DpnI酶消化除去模板后，直接转化到宿主菌进行培养基平板筛选。
[0032]优选的，所述的环状双螺旋DNA质粒的长度大于等于10kb。
[0033]所述的突变引物包括正向突变引物和反向突变引物。正向突变引物由5’-模板序列、兼并碱基序列和3’-模板序列这三部分序列组成，其中兼并碱基序列是以兼并碱基代替了目的基因中待突变的序列，5’-模板序列是目的基因中待突变序列5’端上游的一段序列，3’-模板序列是目的基因中待突变序列3’端下游的一段序列。反向突变引物的序列为正向突变引物的反向互补序列。
[0034]优选的，5’-模板序列和3’-模板序列的T m值相差不高于5℃；
[0035]优选的，5’-模板序列和3’-模板序列的长度均不低于兼并碱基序列。
[0036]所述的聚合酶链式反应中，反应体系由质粒模板、正向引物、反向引物、高保真DNA 聚合酶、聚合酶反应缓冲液及去离子水组成。
[0037]优选的，质粒模板的用量为20-100ng；
[0038]优选的，正向引物和反向引物在反应体系中的终浓度为100-200nM；
[0039]优选的，高保真DNA聚合酶具备长链DNA扩增能力；
[0040]优选的，高保真DNA聚合酶为Phusion高保真聚合酶或高保真聚合酶；[0041]所述的聚合酶反应由以下步骤组成：预变性，循环反应(变性、退火、延伸)，再次延伸。
[0042]优选的，预变性的温度为98℃，时间为1-2.5min；
[0043]优选的，循环反应的循环数为10-18个循环；
[0044]优选的，变性温度为98℃，时间为0.5-1min；
[0045]优选的，退火温度为正向突变引物中5’端模板序列与3’端模板序列两者的T m值中较低的数值减去2-5℃，退火时间为0.5-2min；
[0046]优选的，延伸温度为72℃，延伸时间以15s/kb计算而得；
[0047]优选的，再次延伸的温度为72℃，时间为2-5min。
[0048]优选的，所构建的突变基因库中加入10-20U DpnI酶消化模板，消化时间为0.5～2hr。
[0049]优选的，所述培养基平板上可以含有目的蛋白的功能底物或指示剂，以便于快速筛选。
[0050]具体的，本发明公开了一种适用于高通量蛋白质功能筛选的长序列DNA中连续多点饱和突变库构建方法，该方法全过程的示意图见图1。以含有表达目的蛋白的基因的环状双螺旋DNA质粒为模板，采用一对序列完全反向互补的正向和反向突变引物，通过聚合酶链式反应实现目的基因饱和突变库的构建。
正向突变引物由5’-模板序列、兼并碱基序列和3’-模板序列这三部分序列组成，其中兼并碱基序列是以兼并碱基代替了目的基因中待突
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