(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811538653.X
(22)申请日 2018.12.14
(71)申请人 江苏省农业科学院
地址 211225 江苏省南京市钟灵街50号江
苏省农业科学院
(72)发明人 黄午阳 吴寒 宝琳 柴智
李大婧 刘春泉 徐亚平
(51)Int.Cl.
A61K 31/35(2006.01)
A61P 3/10(2006.01)
(54)发明名称一种葡萄糖诱导人肝癌细胞HepG2建立糖尿病模型的方法及应用(57)摘要本发明涉及一种葡萄糖诱导的人肝癌细胞HepG2糖尿病模型的制备方法及应用，属于生物技术领域。该方法于37℃，5％CO 2恒温培养箱中，培养HepG2细胞至贴壁长满80％-90％，按细胞浓度1×105个/mL接种于96孔板，细胞生长至96孔板底部50-70％时，不完全培养基饥饿培养4h后，加入终浓度30-120mM葡萄糖诱导24-48h建立糖尿病细胞模型。本发明建立了葡萄糖诱导的体外糖尿病细胞模型，通过高浓度葡萄糖刺激，HepG2细胞存活率显著下降，模型组细胞存活率为对照组的35-75％，该方法简单易行，可用于探讨药物对糖代谢的影响，提高对降糖药物筛选的速度， 对糖尿病的研究具有深远的意义。权利要求书1页 说明书3页 附图1页CN 109512812 A 2019.03.26
C N 109512812
A
1.葡萄糖诱导人肝癌细胞HepG2建立糖尿病模型的方法及应用，包括了以下步骤：
(1)HepG2细胞培养：HepG2细胞用完全培养基(1％双抗、1％Hepes 1M、10％FBS、5.5mM 葡萄糖)置于37℃，5％CO 2的温箱里培养，使之完全贴壁后备用。
(2)HepG2样品制备：HepG2细胞贴壁长满至80％-90％左右，加入胰酶放置培养箱中消化2-5min，制备成悬浮液，滴入细胞计数板中，于显微镜下计数，调整细胞浓度为1×105个/mL，设置空白组和对照组，按每孔100μL接种于96孔板中，置于37℃培养箱中培养至细胞长满50％-70％。
(3)葡萄糖诱导HepG2细胞模型建立：弃去上层清夜，加入100μL不完全培养基(1％双抗、1％Hepes 1M、5.5mM葡萄糖)饥饿培养4h，使所有HepG2细胞同步化。之后建立模型，模型组(即高糖组)加入葡萄糖，使其终浓度为30-120mM，刺激24-48h；对照组即低糖组，仅包含培养基中的5.5mM葡萄糖。MTT法测定细胞活力，加入20μL MTT(1mg/mL)，培养4h，弃去上清液，加入150μL DMSO，37℃溶解10min，用酶标仪于490nm波长处测定吸光度值，计算细胞活力，HepG2细胞存活率显著下降，模型
组细胞存活率为对照组的35-75％，该模型可用于探讨药物对糖代谢的影响，提高对降糖药物筛选的速度。
2.根据权利要求书1所述葡萄糖诱导的人肝癌细胞HepG2糖尿病模型的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，按每孔100μL接种于96孔板，置于37℃培养箱用完全培养基培养至细胞长满50％-70％(以细胞培养板底部面积百分数计)。
3.根据权利要求书1所述葡萄糖诱导的人肝癌细胞HepG2糖尿病模型的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，高糖组加入30-120mM葡萄糖(以终浓度计)刺激HepG2细胞24-48h，使得HepG2细胞存活率显著下降，模型组细胞存活率为对照组的35-75％。
权 利 要 求 书1/1页CN 109512812 A
一种葡萄糖诱导人肝癌细胞HepG2建立糖尿病模型的方法及
应用
一、技术领域
[0001]本发明涉及一种葡萄糖诱导的人肝癌细胞HepG2糖尿病模型的制备方法及应用，属于生物技术领域。
二、背景技术
[0002]糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢疾病，由体内胰岛素绝对或者相对缺少所导致的一系列临床综合症，且与遗传基因有着密切的联系。现如今糖尿病与其并发症的发病率一直在升高，成为全球性的问题。据国际糖尿病联盟统计，2000年全球糖尿病患者为1.5亿，而目前已达到2.85亿，按现有的增长速度，预计2030年全球将有5亿人患有此病，中国也成为糖尿病的重灾区。
[0003]糖尿病主要分为1型、2型和妊娠型糖尿病，其中2型糖尿病占主要部分。2型糖尿病主要发病机制是胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是指机体靶细胞对胰岛素的敏感性降低，导致器官组织之间的胰岛素分泌关系絮乱，胰岛素分泌减少，糖代谢混乱。机体内对胰岛素敏感的主要部位是肝脏细胞和外周组织，当两者之间失去平衡，就整体来讲，其中一方的细胞水平就会表现出胰岛素受体数目减少。目前，实验室评价胰岛素抵抗能力主要通过测定细胞上胰岛素受体的数目、亲和力、结合律等。
[0004]如今，国内外对降糖药物的筛选及药物的降糖机制主要还是依靠动物模型，操作复杂严格，时间冗长，费用高昂。因而体外糖尿病模型也在不断成长起来。人肝癌细胞HepG2细胞是从人体肝癌细胞分离出来的，具有肝细胞很多特性，同时保留了肿瘤细胞易于体外传代培养的特性，它能够表达胰岛素受体和胰岛素生长因子的代谢反应，发挥葡萄糖摄取、糖原合成、酶的活性等一些其他作用，也能比较完善的模拟肝细胞对周围环境中的葡萄糖摄取和消耗。HepG2细胞培养操作简单方便，可重复，因此利用HepG2细胞建立糖尿病模型，能更直观的探讨药物对糖代谢的影响，方便筛选降糖药物。
[0005]此前，虽有专利(CA 104357397A)公开了“一种耐药肝癌HepG2细胞模型的建立方法”，但对于HepG2细胞的生长状态对药物的作用效果并未做出研究，人肝癌细胞HepG2也仅在抗肿瘤、抗氧化方面的研究中得以应用。除此之外，以HepG2细胞为研究对象，建立糖尿病模型的专利也并未有所公布。本发明不仅通过葡萄糖诱导人肝癌细胞HepG2，建立了体外糖尿病研究模型，还进行了验证试验，说明该模型的应用情况，证明了该发明能有效用于药物对糖尿病引起的肝脏细胞损伤保护的研究。
三、发明内容
[0006]技术问题：本发明主要提供一种葡萄糖诱导人肝癌细胞HepG2建立糖尿病模型的方法及应用。
[0007]技术方案：本发明以人肝癌细胞HepG2为材料，通过葡萄糖诱导，构建了一种体外研究糖尿病的实验模型，该方法包括以下步骤：
[0008](1)HepG2细胞培养：HepG2细胞用完全培养基(1％双抗、1％Hepes 1M、10％FBS、5.5mM葡萄糖)置于37℃，5％CO2的温箱里培养，使之完全贴壁后备用。
[0009](2)HepG2样品制备：HepG2细胞贴壁长满至80％-90％左右，加入胰酶放置培养箱中消化2-5min，制备成悬浮液，滴入细胞计数板中，于显微镜下计数，调整细胞浓度为1×105个/mL，设置空白组和对照组，按每孔100μL接种于96孔板中，置于37℃培养箱中培养至细胞长满50％-70％。
[0010](3)葡萄糖诱导HepG2细胞模型建立：弃去上层清夜，加入100μL不完全培养基(1％双抗、1％Hepes 1M、5.5mM葡萄糖)饥饿培养4h，使所有HepG2细胞同步化。之后建立模型，模型组(即高糖组)加入葡萄糖，使其终浓度为30-120mM，刺激24-48h；对照组即低糖组，仅包含培养基中的5.5mM葡萄糖。MTT法测定细胞活力，加入20μL MTT(1mg/mL)，培养4h，弃去上清液，加入150μL DMSO，37℃溶解10min，用酶标仪于490nm波长处测定吸光度值，计算细胞活力，HepG2细胞存活率显著下降，模型组细胞存活率为对照组的35-75％。
[0011]本发明的优点和积极效果如下：
[0012]本发明旨在建立一种简单易行的葡萄糖诱导的HepG2细胞糖尿病体外模型。本方法通过对细胞生长率、葡萄糖浓度、刺激时间进行控制，建立了一种更有效的高浓度葡萄糖诱导的HepG2细胞糖尿病模型，可用于探讨药物对糖代谢的影响，提高对降糖药物筛选的速度，对糖尿病的研究具有深远的意义。
四、附图说明
[0013]图1葡萄糖对HepG2细胞活力的影响
[0014]注：***表示在P＜0.001水平上，模型组的细胞活力显著低于对照组。
[0015]图2蓝莓花青素对葡萄糖诱导HepG2细胞损伤的保护作用
[0016]注：***表示在P＜0.001水平上，模型组的细胞活力显著低于对照组；##表示在P＜0.01水平上，实验组的细胞活力显著高于模型组。
五、具体实施方式
[0017]下面结合具体实例对本发明作进一步说明：
[0018]实施案例1：
[0019]HepG2细胞用完全培养基(1％双抗、1％Hepes 1M、10％FBS、5.5mM葡萄糖)置于37℃，5％CO2的温箱里培养，使之完全贴壁后备用。待HepG2细胞贴壁长满至80％左右，加入2mL胰酶放置培养箱中消化2min，制备成悬浮液，滴入细胞计数板中，于显微镜下计数，调整细胞浓度为1×105个/ml。设置对照组和模型组，按每孔100μL接种于96孔板中，置于37℃培养箱中培养24h，至细胞长满70％。弃去上层清夜，加入100μL不完全培养基(1％双抗、1％Hepes 1M、5.5mM葡萄糖)饥饿培养4h，使所有HepG2细胞同步化。模型组加入终浓度为30mM 的葡萄糖溶液，刺激24h。根据MTT法测定细胞活力，加入20μL MTT(1mg/mL)，培养4h，弃去上清液，加入150μL DMSO，37℃溶解10min，用酶标仪于490nm波长处测定吸光度值即可。结果表明，在上述建立的糖尿病模型中，30mM葡萄糖刺激24h可以使HepG2细胞活力显著下降(P ＜0.001)，仅为对照细胞的40％(图1)。
[0020]实施案例2：
[0021]HepG2细胞用完全培养基(1％双抗、1％Hepes 1M、10％FBS、5.5mM葡萄糖)置于37℃，5％CO2的温箱里培养，使之完全贴壁后备用。待HepG2细胞贴壁长满至80％左右，加入2mL胰酶放置培养箱中消化2min，制备成悬浮液，滴入细胞计数板中，于显微镜下计数，调整细胞浓度为1×105个/ml。设置对照组、模型组、实验组，按每孔100μL接种于96孔板中，置于37℃培养箱中培养24h，至细胞长满70％。弃去上层清夜，加入100μL不完全培养基(1％双抗、1％Hepes 1M、5.5mM葡萄糖)饥饿培养4h，使所有HepG2细胞同步化。先在实验组加入终浓度为5μg/mL的蓝莓花青素提取物，保护24h，再加入终浓度为30mM葡萄糖溶液于模型组和实验组，刺激24h。根据MTT法测定细胞活力，加入20μL MTT(1mg/mL)，培养4h，弃去上清液，加入150μL DMSO，37℃溶解10min，用酶标仪于490nm波长处测定吸光度值即可。结果表明，葡萄糖诱导人肝癌细胞HepG2建立的糖尿病模型可以用于花青素对糖尿病预防的研究中，5μg/mL蓝莓花青素提取物能够有效保护高浓度葡萄糖损伤的HepG2细胞，显著提高HepG2细胞活力(P＜0.01)，使其由40％增加至90％。
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