(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010015510.1
(22)申请日 2020.01.07
(71)申请人 重庆植恩药业有限公司
地址 400039 重庆市九龙坡区迎宾大道38
号智博中心裙楼7楼
(72)发明人 徐天帅 龚大勇 王章洪 黄治川
黄山 张磊 高鑫 沈军伟
(74)专利代理机构 北京元本知识产权代理事务
所(普通合伙) 11308
代理人 黎昌莉
(51)Int.Cl.
C12N 9/04(2006.01)
C12P 7/64(2006.01)
(54)发明名称
用于制备奥利司他中间体的方法
(57)摘要
本发明属于本发明属于生物制药和生物化
工技术领域，具体地，涉及一种(R)-β-羟基十四
烷酸酯类化合物的合成方法。该方法是将β-羰
基十四烷酸酯在酮还原酶、葡萄糖、葡萄糖脱氢
酶、NADP +和缓冲液中反应得到(R)-β-羟基十四 烷酸酯类。该方法为酶催化生物合成方法，操作
简单，使用设备为常规设备，工艺环保，制得的产
品纯度高、产率高、
ee值高。
权利要求书2页 说明书7页序列表4页 附图1页CN 111154736 A 2020.05.15
C N 111154736
A
1.用于制备奥利司他中间体的生物酶，其特征在于，所述生物酶作用的底物为β-羰基十四烷酸酯，结构式如I所示，所述奥利司他中间体为(R)-β-羟基十四烷酸酯，结构式如II 所示，结构式I中的R指含有1-3个碳原子的饱和烷基，结构式II中R指含有1-3个碳原子的饱和烷基； 所述生物酶为酮还原酶，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示及其同一性大于90％的氨基酸序列，和/或如SEQ ID N0:2所示及其同一性大于90％的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的生物酶，其特征在于，所述生物酶为酶粉和/或酶液和/或固定化酶。
3.根据权利要求1所述的生物酶，其特征在于，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示及其同一性大于95％的氨基酸序列，和/或如SEQ ID N0:2所示及其同一性大于95％的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的生物酶，其特征在于，结构式I中的R为甲基、乙基、正丙基或异丙基中任一种，结构式II中的R为甲基、乙基、正丙基或异丙基中任一种。
5.含有权利要求1-3任一所述的生物酶和底物的组合物，其特征在于，所述底物为所述β-羰基十四烷酸酯。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述生物酶与所述底物的重量比为1: 1.1-150。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述生物酶与所述底物的重量比为1: 20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100、1：110、1：120、1：130、1：140和/或1：150。
8.含有权利要求1-4任一所述的生物酶的反应体系，其特征在于，所述反应体系由I所示的底物、所述生物酶、葡萄糖，葡萄糖脱氢酶、NADP+和缓冲液组成。 9.根据权利要求8所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系的pH值为6.0-8.0。
10.根据权利要求8所述的反应体系，其特征在于，所述缓冲溶液为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
11.根据权利要求8所述的反应体系，其特征在于，所述底物的浓度为20g/L-150g/L。
12.根据权利要求8所述的反应体系，其特征在于，所述NADP+的浓度为0.1-0.5g/L。
13.根据权利要求8所述的反应体系，其特征在于，化合物I与所述葡萄糖的摩尔比为1: 1.2-4。
14.根据权利要求8所述的反应体系，其特征在于，所述缓冲液的浓度为0.01-0.5mol/ L。
15.根据权利要求8所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系的反应时间不超过15小时，得反应液。
16.基于权利要求8所述的反应体系制备奥利司他中间体的方法，其特征在于，将所述反应体系在20-40℃条件下搅拌反应，得所述奥利司他中间体的反应液，所述奥利司他中间
体的中间体为(R)-β-羟基十四烷酸酯，结构式如II所示。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，用NaOH水溶液作为pH值调节剂。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述反应时间不超过15小时。
19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，在所得反应液中用溶剂萃取所述奥利司他中间体。
20.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述溶剂为无水乙醇或乙酸乙酯。
21.根据权利要求20所述的方法，所得萃取物进行减压浓缩，并降温结晶，白结晶固体即化合物II。
22.权利要求21所述的奥利司他中间体制备的奥利司他。
用于制备奥利司他中间体的方法
技术领域
[0001]本发明属于本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体地，涉及一种(R)-β-羟基十四烷酸酯类化合物的生物合成方法。
背景技术
[0002]肥胖症药物主要分为两大类，即中枢神经作用和非中枢神经作用。中枢神经作用的减肥效果明显，但是副作用较大，临床应用受到较大限制。其中芬氟拉明由于会引起肺动脉高压和肥厚性心脏瓣膜病变于1997年退市。由于可能增加严重心血管风险于2010年被国家食品药品监督管理局宣布停止生产、销售和使用。绿卡林(locaserin，商品名Belviq)2012年6月由FDA批准上市，尚存在增加心瓣膜病和不良心血管事件的风险，临床应用的安全性还有待进一步验证。奥利司他(Orlistat)是第一个非中枢神经作用的物，且是目前全球唯一一种OTC物。自1998年上市以来，因疗效确切、安全性高，已成为减肥的首选药物。奥利司他直接作用于胃肠道脂肪酶，抑制脂肪吸收效果显著，其靶点高度专一，对其他胃肠道酶没有影响，且无需通过全身吸收而发挥药效，其体内系统药物暴露量很低，主要副作用为胃肠道反应，安全性优异。奥利司他全球销售已超过20年，目前已在超过145个国家获得批准上市，其优异的疗效和安全性已被大量的临床应用验证。
[0003]奥利司他的市场需求量大，而寻高效的奥利司他及其中间物的合成方法是极其重要的。而(R)-β-羟基十四烷酸酯是合成药物奥利司他的重要中间体，该中间体的光学纯度极为关键。如何高效的获得光学纯的(R)-β-羟基十四烷酸酯呢？
[0004]如中国专利CN101538285B报道了一种利用制备的(R)-金属催化剂[(R)-Ru (MeOBIPHEP)Cl2]2·NEt3催化不对称氢化反应，但该化学催化反应需要在强酸且60bar高压条件下反应才能得到ee值>98.5％的产品。此类方法的不足之处在于：1)需要使用昂贵的(R)-配体与贵金属催化剂；
2)催化剂需要现做现用，工艺稳定性难以保证；3)需要高压氢化设备；4)需要耐酸设备；5)反应控制得不好会影响ee值。针对上述缺点，我们用生物酶法进行系统的改进，解决奥利司他关键中间体的规模化生产。
发明内容
[0005]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种制备奥利司他中间体的生物酶，该生物酶能够有效地作用底物β-羰基十四烷酸酯。
[0006]为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0007]用于制备奥利司他中间体(终物)的生物酶，所述生物酶作用的底物为β-羰基十四烷酸酯(原料)，结构式如I所示；所述奥利司他中间体为(R)-β-羟基十四烷酸酯，结构式如II所示；结构式I中的R指含有1-3个碳原子的饱和烷基，结构式II中R指含有1-3个碳原子的饱和烷基。
[0008]
[0009]所述生物酶为酮还原酶，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示及其同源性大于90％的氨基酸序列，来源于Singulisphaera acidiphila，NCBI数据库中的编码为WP_015245403.1，属于短链脱氢酶家族；和/或如SEQ ID N0:2所示及其同源性大于90％的氨基酸序列，来源于Sphingomonas echinoides，NCBI数据库中的编码为WP_010403640.1，属于短链脱氢酶家族。我们惊奇的发现，天然的或者经过基因/蛋白工程改造后的所述生物酶对所述底物有很好的催化作用，并得到光学纯度高的所述终物。当同一性/同源性≥90％的生物酶，我们希望视为等同侵权。
[0010]进一步，所述生物酶为酶粉和/或酶液和/或固定化酶。
[0011]进一步，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示及其同源性大于95％的氨基酸序列，和/或如SEQ ID N0:2所示及其同源性大于95％的氨基酸序列。当同一性/同源性≥95％的生物酶，我们希望视为等同侵权。
[0012]进一步，结构式I中的R为甲基、乙基、正丙基或异丙基中任一种，结构式II中的R为甲基、乙基、正丙基或异丙基中任一种。
[0013]本发明的目的之二在于提供一种组合物，该组合物中两者能形成酶和底物的协同关系，并得到如结构式II所示的产物。
[0014]为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0015]含有上面任一所述的生物酶和底物的组合物，所述底物为所述β-羰基十四烷酸酯。
[0016]进一步，所述的组合物中，所述生物酶与所述底物的重量比为1:1.1-150。[0017]进一步，所述的组合物中，所述生物酶与所述底物的重量比为1:20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100、1：110、1：120、1：130、1：140和/或1：150。
[0018]本发明的目的之三在于提供一种用于制备(R)-β-羟基十四烷酸酯的反应体系，该反应体系无需借助高温高压严苛条件即可得到(R)-β-羟基十四烷酸酯。
[0019]为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0020]含有所述的生物酶的反应体系，所述反应体系由结构式如I所示的底物、所述生物酶、葡萄糖，葡萄糖脱氢酶、NADP+和缓冲液组成。
[0021]进一步，所述的反应体系的pH值为6.0-8.0。
[0022]进一步，所述的反应体系中所述缓冲溶液为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。[0023]进一步，所述的反应体系中所述底物的浓度为20g/L-150g/L。
[0024]进一步，所述的反应体系，其特征在于，所述NADP+的浓度为0.1-0.5g/L。[0025]进一步，所述的反应体系，结构式如I所示的化合物与所述葡萄糖的摩尔比为1: (1.2-4)。
[0026]进一步，反应体系中，所述缓冲液的浓度为0.01-0.5mol/L。
[0027]进一步，所述反应体系的反应时间不超过15小时，得反应液。
[0028]本发明的目的之四在于提供奥利司他中间体的制备方法，该方法适用于工业化大
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