(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011452962.2
(22)申请日 2020.12.11
(71)申请人 南京明捷生物医药检测有限公司
地址 211500 江苏省南京市江北新区新锦
湖路3-1号中丹生态生命科学产业园
一期C栋6层
(72)发明人 顾凯 朱子丰 卢彦 嵇慧卿
(74)专利代理机构 南京常青藤知识产权代理有
限公司 32286
代理人 金迪
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
G01N 30/72(2006.01)
(54)发明名称
法
(57)摘要
本发明提供一种测定蛋白溶液中二硫苏糖
醇含量的方法，包括如下步骤：S1、取二硫苏糖醇
适量，以水为稀释剂，配制适当浓度的二硫苏糖
醇溶液，作为二硫苏糖醇对照品溶液；S2、取蛋白
溶液适量，以水为为溶剂，配制供试品溶液；S3、
配制系列二硫苏糖醇对照品溶液，经LC ‑MS/MS法
检测，分别获得对照品溶液中二硫苏糖醇的峰面
积，并与溶液浓度进行标准曲线拟合；S4、取供试
品溶液经LC ‑MS/MS法检测，获得供试品溶液的峰
面积，用外标标准曲线法计算供试品溶液中二硫
苏糖醇的含量。本发明采用碱性体系直接将DTT
氧化成DTTox，便于直接对DTT的氧化物的含量进
行测定，且具有专属性好、
准确度高等优点。权利要求书1页 说明书3页 附图1页CN 112526028 A 2021.03.19
C N 112526028
A
1.一种测定蛋白溶液中二硫苏糖醇含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取二硫苏糖醇适量，以水为稀释剂，配制适当浓度的二硫苏糖醇溶液，作为二硫苏糖醇对照品溶液；
S2、取蛋白溶液适量，以水为为溶剂，配制供试品溶液；
S3、配制系列二硫苏糖醇对照品溶液，经LC ‑MS/MS法检测，分别获得对照品溶液中二硫苏糖醇的峰面积，并与溶液浓度进行标准曲线拟合；
S4、取供试品溶液经LC ‑MS/MS法检测，获得供试品溶液的峰面积，用外标标准曲线法计算供试品溶液中二硫苏糖醇的含量；
步骤S3和步骤S4中的LC ‑MS/MS法的谱条件为：谱柱采用Xbridge BEH C18，规格为
2.5μm，
3.0×100mm，柱温为30‑40℃，进样量为15‑35μL；检测器为质谱检测器，离子源为ESI，正离子模式，离子对为150.9/175；
以0.1％氨水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流速为0.4mL/min，梯度洗脱程序为：0‑2min，流动相B的体积百分数为20％；2‑4min，流动相B的体积百分数由20％变化至90％；4‑5min，流动相B的体积百分数为90％；5‑5.1min，流动相B的体积百分数由90％变化至20％；
5.1‑6min，流动相B的体积百分数为20％。
2.根据权利要求1所述的一种测定蛋白溶液中二硫苏糖醇含量的方法，其特征在于，步骤S3和步骤S4中的LC ‑MS/MS法的谱条件中的柱温为35℃，进样量为20μL。
3.根据权利要求1所述的一种测定蛋白溶液中二硫苏糖醇含量的方法，其特征在于，步骤S3系列二硫苏糖醇对照品溶液的浓度为0.4ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL和4ng/mL。
权 利 要 求 书1/1页CN 112526028 A
一种测定蛋白溶液中二硫苏糖醇含量的方法
技术领域
[0001]本发明属于检测技术领域，具体涉及一种测定蛋白溶液中二硫苏糖醇含量的方法。
背景技术
[0002]二硫苏糖醇(DTT)是一种很强的还原剂，其还原性很大程度上是由于其氧化状态六元环(含二硫键)的构象稳定性。DTT的用途之一是作为巯基化DNA的还原剂和去保护剂，DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。DTTox是DTT的氧化态，是一种包含二硫键的六元环状结构，具有较高的还原性。
[0003]二硫苏糖醇还用于主要用于临床和实验领域，在有些药品的生产过程中加入DTT 可以保护目标蛋白结构，以维持药物活性。但是DTT的还原性较强，在体内可能会破坏蛋白质结构，从而引起酶失活等现象，而DTTox会使肌酸激酶结构发生变化，达到一定浓度时甚至会使肌酸激酶完全失活，因此有必要对药品中的DTT和DTTox进行检测。但是采用传统分光光度计法进行测定时，DTT极容易被氧化，响应不稳定，灵敏度低，不能满足检测要求，目前也有用HPLC对二硫苏糖醇(DTT)残留量进行定量的报道，但是专属性不高。
发明内容
[0004]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种测定蛋白溶液中二硫苏糖醇含量的方法。
[0005]本发明提供了如下的技术方案：
[0006]一种测定蛋白溶液中二硫苏糖醇含量的方法，包括如下步骤：
[0007]S1、取二硫苏糖醇适量，以水为稀释剂，配制适当浓度的二硫苏糖醇溶液，作为二硫苏糖醇对照品溶液；
[0008]S2、取蛋白溶液适量，以水为为溶剂，配制供试品溶液；
[0009]S3、配制系列二硫苏糖醇对照品溶液，经LC‑MS/MS法检测，分别获得对照品溶液中二硫苏糖醇的峰面积，并与溶液浓度进行标准曲线拟合；
[0010]S4、取供试品溶液经LC‑MS/MS法检测，获得供试品溶液的峰面积，用外标标准曲线法计算供试品溶液中二硫苏糖醇的含量；
[0011]步骤S3和步骤S4中的LC‑MS/MS法的谱条件为：谱柱采用Xbridge BEH C18，规格为2.5μm，3.0×100mm，柱温为30‑40℃，进样量为15‑35μL；检测器为质谱检测器，离子源为ESI，正离子模式，离子对为150.9/175；
[0012]以0.1％氨水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流速为0.4mL/min，梯度洗脱程序为：0‑2min，流动相B的体积百分数为20％；2‑4min，流动相B的体积百分数由20％变化至90％；4‑5min，流动相B的体积百分数为90％；5‑5.1min，流动相B的体积百分数由90％变化至20％；5.1‑6min，流动相B的体积百分数为20％。具体的梯度洗脱程序如下：
[0013]T/min0.1％甲酸水溶液甲醇
080％20％
280％20％
410％90％
510％90％
5.180％20％
680％20％
[0014]优选的，步骤S3和步骤S4中的LC‑MS/MS法的谱条件中的柱温为35℃，进样量为20μL。
[0015]优选的，步骤S3系列二硫苏糖醇对照品溶液的浓度为0.4ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL和4ng/mL。
[0016]本发明的有益效果是：
[0017]本发明提供一种测定蛋白中二硫苏糖醇的残留量测定方法，可以实现精确至2.5ppm的准确定量，具有检测时间短，准确度好，精密度高，重复性好的优点，本发明采用串联质谱检测器，专属性好，灵敏度高，方法时间短，效率高，采用碱性体系直接将DTT氧化成DTTox，便于直接对DTT的氧化物的含量进行测定。
附图说明
[0018]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0019]图1是本发明二硫苏糖醇的标准曲线；
[0020]图2是本发明专属性结果对比图。
具体实施方式
[0021]一种测定蛋白溶液中二硫苏糖醇含量的方法，包括如下步骤：
[0022]S1、取二硫苏糖醇适量，以水为稀释剂，配制适当浓度的二硫苏糖醇溶液，作为二硫苏糖醇对照品溶液；
[0023]S2、取蛋白溶液适量，以水为为溶剂，配制供试品溶液；
[0024]S3、配制系列二硫苏糖醇对照品溶液，其浓度依次为0.4ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL和4ng/mL，经LC‑MS/MS法检测，分别获得对照品溶液中二硫苏糖醇的峰面积，并与溶液浓度进行标准曲线拟合，所得数据如表1所示，得到的标准曲线公式为y＝13623x+749，R2＝0.9961，结果表明二硫苏糖醇在浓度范围内呈良好的线性关系，符合要求；
[0025]表1系列二硫苏糖醇对照品溶液检测结果
[0026]二硫苏糖醇浓度(ng/mL)峰面积
L‑10.45939
L‑2113595
L‑3230128
L‑4340617
L‑5455146
[0027]S4、取供试品溶液经LC‑MS/MS法检测，获得供试品溶液的峰面积，用外标标准曲线法计算供试品溶液中二硫苏糖醇的含量；
[0028]步骤S3和步骤S4中的LC‑MS/MS法的谱条件为：谱柱采用Xbridge BEH C18，规格为2.5μm，3.0×100mm，柱温为35℃，进样量为20μL；检测器为质谱检测器，离子源为ESI，正离子模式，离子对为150.9/175；
[0029]以0.1％氨水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流速为0.4mL/min，梯度洗脱程序为：0‑2min，流动相B的体积百分数为20％；2‑4min，流动相B的体积百分数由20％变化至90％；4‑5min，流动相B的体积百分数为90％；5‑5.1min，流动相B的体积百分数由90％变化至20％；5.1‑6min，流动相B的体积百分数为20％。
[0030]按照步骤S3和步骤S4中的LC‑MS/MS法的谱条件，测定专属性结果，具体的专属性结果如图2所示，从图2可以看出，空白溶液和供试品溶液无干扰，供试品加标溶液(指的是供试品溶液+对照品溶液)具有明显响应。
[0031]在供试品溶液中加入适量对照品溶液，作准确度实验，准确度结果如表2所示。[0032]表2准确度结果
[0033] 峰面积加入量(ng)测得量(ng/mL)原有量(ng)回收率20％‑125967 4.1818.882915.0506106％
20％‑225197 4.1818.323015.0506108％
20％‑324607 4.1817.893915.0506108％
100％‑14508620.932.786015.0506110％
100％‑24614020.933.552515.0506106％
100％‑34667020.933.937915.0506111％
150％‑16612931.3548.088215.0506115％
150％‑26162431.3544.812315.0506112％
150％‑36021031.3543.784015.0506112％[0034]从上表可以看出，本方法具有良好的准确度。
[0035]本发明提供一种测定蛋白中二硫苏糖醇的残留量测定方法，可以实现精确至2.5ppm的准确定量，具有检测时间短，准确度好，精密度高，重复性好的优点，本发明采用串联质谱检测器，专属性好，灵敏度高，方法时间短，效率高，采用碱性体系直接将DTT氧化成DTTox，便于直接对DTT的氧化物的含量进行测定。
[0036]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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