(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510328777.5
(22)申请日 2015.06.15
C12N 15/82(2006.01)
C12N 5/10(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)
A01H 5/00(2006.01)
(71)申请人创世纪种业有限公司
地址518048 广东省深圳市福田区新洲南路
2017号4楼
(72)发明人何云蔚 崔洪志 王建胜
(74)专利代理机构北京北翔知识产权代理有限
公司 11285
代理人
屈静
(54)发明名称
应用
(57)摘要
本发明公开了一种含有抗草甘膦基因的植物
表达载体。所述植物表达载体为含两个拷贝的抗
草甘膦基因的环形载体：所述抗草甘膦基因编码
氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列的蛋白质或
氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比有一个或几个氨
基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、且具有草
甘膦抗性的蛋白质；所述两个拷贝的抗草甘膦基
因分别被来自棉花的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶
基因启动子和来自拟南芥激动蛋白基因的启动子
驱动。本发明证明，导入本发明的植物表达载体的
转基因棉花具有非常强的草甘膦抗性。本发明对
于进一步培育高抗草甘膦植物及其应用具有非常
重要的意义。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书11页序列表10页 附图4页CN 106318967 A 2017.01.11
C N 106318967
A
1.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体为含两个拷贝的抗草甘膦基因的环形载体，所述抗草甘膦基因编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示序列的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述抗草甘膦基因编码序列为序列表中SEQ ID NO.2所示的序列。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：
所述两个拷贝的抗草甘膦基因分别在两个表达盒中，
所述第一表达盒中启动抗草甘膦基因转录的启动子为来自拟南芥激动蛋白基因的启动子，所述启动子序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述第二表达盒中启动抗草甘膦基因转录的启动子为来自棉花1,5-二磷酸核酮糖羧化酶基因启动子，所述启动子序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；
所述启动子和抗草甘膦基因之间包括来自矮牵牛5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的叶绿体导肽，所述叶绿体导肽序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：
对于所述两个抗草甘膦基因，终止抗草甘膦基因转录的终止序列均为NosT，其序列如序列表中SEQ ID NO.6中所示的第235-504位；
所述抗草甘膦基因和终止子之间还包括来促进剪切的PS序列，其序列如序列表中SEQ ID NO.6中的第1-228位。
5.含有权利要求1-4任一项所述的表达载体的重组细胞系或转基因微生物。
6.权利要求5的重组细胞系或转基因微生物，所述重组细胞系或转基因微生物为农杆菌，例如菌株LBA4404。
7.权利要求1-4中任一项所述的表达载体或权利要求5或6所述的重组细胞系或转基因微生物在培育耐草甘膦转基因植物中的应用。
8.权利要求7的应用，其中所述耐草甘膦转基因植物为棉花。
9.一种培育耐草甘膦转基因植物的方法，所述方法包括如下步骤：
1)向目的植物中导入权利要求1-4任一项所述的表达载体或权利要求5或6所述的重组细胞系或转基因微生物，得到同时表达权利要求1-4任一项所述两个拷贝抗草甘膦基因的转基因植物；
2)从步骤1)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，草甘膦抗性增强的转基植物。
10.权利要求9的方法，其中所述植物为棉花。
一种含有抗草甘膦基因的植物表达载体及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及含有抗草甘膦基因的植物表达载体。
背景技术
[0002] 草甘膦是一种非选择性除草剂，具有理化性质稳定、高效、广谱、低毒、低残留、易于被微生物分解，不破坏土壤环境等优点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的农药品种。自从1976年美国孟山都公司的草甘膦类除草剂-农达(Roundup)研制成功并得到广泛应用以来，作物抗草甘膦转基因研究成为抗除草剂基因工程研究的热点。随着抗草甘膦基因克隆的发展，抗草甘膦转基因作物也相继问世并大面积推广应用，这些转基因作物具有如下优点：(1)减少除草剂总用量，使杂草防治费用下降，增加农产品的经济效益；(2)所用除草剂品种广谱、选择性强、对环境友好、使用方便，特别适用于保水，减轻土壤侵蚀及石油耗量少的少耕与免耕体系，减少机械耕作作业，大大节省能源；(3)解决了常规除草剂难以防治的特殊杂草问题，如稻田的野生稻、赤稻、宽叶臂形草、圆叶牵牛、大果田菁；小麦田的雀麦(Bromus spp)、莎草(Cyperus spp)；大豆田的鸭趾草、蓟、苣荬菜、纯叶决明以及寄生杂草。(6)解决土壤长残留性除草剂对后茬作物的伤害。转基因作物所使用的草甘膦无土壤残留，故对后茬作物十分安全。
[0003] 草甘膦的作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该酶是真菌、细菌、藻类和高等植物体内芳香族氨基酸(包括氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键性的酶。草甘膦是磷酸稀醇式丙酮酸(PEP)的类似物，是EPSPS竞争性抑制剂，草甘膦、EPSPS和三磷酸莽草酸(S3P)结合形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体(此复合体非常稳定)，抑制EPSPS的活性导致分支酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最终导致一些激
素和关键性代谢物如类黄酮、木质素和酚类化合物代谢失调，从而扰乱了生物体正常的氮代谢而使其死亡。[0004] 棉花是全球最重要的植物纤维作物，主要种植于热带或亚热带的干旱地区。草害严重威胁着棉花的品质和产量。除草剂的推广使用，可大幅度减少棉田管理用工，降低劳动强度。目前推广的棉花品种对除草剂不具有抗性，经常出现药害现象，对棉花植株造成一定的损伤，培育抗除草剂作物品种是防止除草剂药害最有效的途径。因此，本领域持续需要培育更多的防止除草剂药害的抗除草剂作物品种。
发明内容
[0005] 本发明利用抗草甘膦基因mc2-epsps，构建含该基因的植物双价表达载体，并利用不同启动子驱动目的基因的表达。通过植物遗传转化，可以获得高抗草甘膦的转基因植物。更具体而言，本发明人将抗草甘膦基因mc2-epsps基因用不同启动子驱动，构建出双价植物表达载体。
[0006] 因此，在第一方面中，本发明的目的是提供一种植物表达载体，所述植物表达载体是含有两个拷贝的抗草甘膦基因mc2-epsps的环形载体。优选地，所述两个拷贝的抗草甘
膦基因相同。
[0007] 在一个实施方案中，所述抗草甘膦基因mc2-epsps编码的蛋白质可以为下述a1)或a2)：
[0008] a1)氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示序列的蛋白质；
[0009] a2)氨基酸序列与a1)的蛋白质的氨基酸序列相比有一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、且具有草甘膦抗性的蛋白质。
[0010] 在一个实施方案中，在本发明的植物表达载体中，所述抗草甘膦基因编码序列为序列表中SEQ ID NO.2所示序列。
[0011] 在本发明的植物表达载体中，所述两个拷贝的抗草甘膦基因优选分别在两个表达盒中，所述第一表达盒中启动抗草甘膦基因转录的启动子可以为来自拟南芥激动蛋白基因(ActinⅡ)的启动子，所述启动子序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述第二表达盒中启动抗草甘膦基因转录的启动子可以为来自棉花1,5-二磷酸核酮糖羧化酶基因(Rubisco)启动子，所述启动子序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。
[0012] 在本发明的植物表达载体中，所述启动子和抗草甘膦基因之间优选还包括来自矮牵牛5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因(epsps)的叶绿体导肽，所述叶绿体导肽序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。
[0013] 在本发明的植物表达载体中，终止所述两个抗草甘膦基因表达的终止序列可以均为NosT；优选地，NosT的序列如序列表中SEQ ID NO.6中所示的第235-504位；优选地，所述两个抗草甘膦基因在两个表达盒中。
[0014] 在本发明的植物表达载体中，所述抗草甘膦基因和终止子之间优选还包括用来促进剪切的PS(Processing&Splicing sequence)序列；优选地，其序列如序列表中SEQ ID NO.6中的第1-228位。
[0015] 在第二方面中，本发明的目的在于提供一种含有本发明第一方面的植物表达载体的重组细胞系或转基因微生物，以及用本发明第一方面的植物表达载体转化的植物细胞、组织或植株。在一个具体的实施方案中，所述重组细胞系或转基因微生物为农杆菌，例如菌株LBA4404。
[0016] 在第三方面中，本发明的目的在于提供本发明第一方面的抗草甘膦表达载体或本发明第二方面的重组细胞系或转基因微生物在抗草甘膦植物品种中的应用。优选地，本发明还提供了一种培育耐草甘膦转基因植物的方法，所述方法包括如下步骤：
[0017] 1)向目的植物中导入本发明第一方面的植物表达载体或本发明第二方 面的重组细胞系或转基因微生物，得到同时表达本发明的植物表达载体中两个拷贝抗草甘膦基因的转基因植物；
[0018] 2)从步骤1)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，草甘膦抗性增强的转基植物。
[0019] 在一个具体的实施方案中，所述植物为棉花。
[0020] 发明人利用农杆菌介导法将本发明的双价植物表达载体遗传转化至棉花，在转基因植物中获得增量表达。发明人还对获得转基因棉花分别在T0和T1代进行不同强度的草甘膦筛选，大部分转基因植株未
有明显的药害症状，生长正常，而阴性对照全部死亡。以上结果表明构建的双价抗草甘膦植物表达载体可赋予棉花较好的草甘膦抗性，获得草甘膦抗
性更强的转基因植物，从而提供了一种获得抗草甘膦除草剂转基因植物的优选方案。
附图说明
[0021] 图1是中间载体p3质粒图谱，图中Kanamycin为卡那霉素。
[0022] 图2是中间载体p4质粒图谱，图中inner为内，outer为外。
[0023] 图3是基础植物表达载体pBIOT1011质粒图谱。
[0024] 图4是中间载体pBS-ACTII-MC2质粒图谱。
[0025] 图5是中间载体pBS-RUBP-MC2质粒图谱。
[0026] 图6是中间载体pBIOT-ACTII-MC2质粒图谱。图中，inner为内，outer为外。[0027] 图7是双价植物表达载体pBIOT-ACTII-MC2-RUBP-MC2质粒图谱。图中，inner为内，outer为外。
具体实施方式
[0028] 实施例1双价mc2-epsps植物表达载体构建
[0029] 植物表达载体的改造：以pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)为模板，扩增卡那霉素耐药基因(aadA)至质粒复制原点(pVS1ori)的序列，在5’端添加EcoRⅠ和PvuⅠ酶切位点，在3’端添加ScaⅠ和EcoRⅠ酶切位点，引物序列为SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8，扩增得到的片段命名为片段A。利用EcoRⅠ酶切片段A，自边环化得到载体p3。合成LB至RB端序列，为了提高遗传转化中阳性植株比例、降低转基因植物基因组中载体骨架DNA的发生率、增加低拷贝转化事件频率，对LB和RB端进行修饰，在其内部增加识别切割元件，中间加入两个删除标记loxP位点(SEQ ID NO：9)，使转基因后代通过与转环化重组酶基因(cre)的植株杂交，删除标记基因的表达框，序列两端分别含Pvu I，Sca I酶切位点，命名为片段B，具体序列如SEQ ID NO：10所示。通过Pvu I和Sca I酶切载体p3和片段B，将片段B连入载体p3(图1)中，获得重组质粒p4(图2)。以植物表达载体pBI121(购自北京华夏远洋科技有限公司)为模板，扩增NPTII基因表达框，引物序列为SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12，所得片段两端分别带BamH I和Xho I位点，命名为片段C。利用BamH I和Xho I酶切片段C，Bgl II和Sal I酶切p4质粒，将片段C连入p4质粒中，得到优化的基础植物表达载体pBIO1011(图3)。
[0030] 抗草甘膦基因mc2-epsps基因(下文简称mc2)由从陆地棉冀棉14中克隆，经人为修饰获的，具休修饰方法参考专利：PCT/CN/2013/082238，201380008110.6。构建mc2基因的双价植物表达载体。为了增加mc2基因在植物体内的表达量，预防相同启动子可能引起的基因沉默问题，分别利用来自拟南芥
的激动蛋白基因的启动子(ActⅡ)和来自棉花的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶基因的启动子(RUBP)驱动mc2基因的表达。因EPSPS是在叶绿体中催化芳香族氨基酸的合成，因此在mc2基因的5端融合来自矮牵牛epsps基因的叶绿体导肽序列(ptp)，ptp序列如SEQ ID NO：5所示。构建过程如下：参考 www. ncbi.v/nucleotide，编号为GenBank:CP002686.1中的序列，从拟南芥中克隆启动子ActⅡ，使其5端带Spe I酶切位点，3端带Pst I酶切位点，引物序列如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14所示。克隆矮牵牛的epsps基因的叶绿体导肽序列，使其5端带Pst I 酶切位点，3端带Nco I酶切位点，引物序列为SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16所示。设计
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